（生物化学与分子生物学专业论文）水稻低磷胁迫基因表达谱分析.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及0 燮燮攀攀缈 学位论文 香 如需保密，解密时间 员黾 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：窖弁1 3 牟 时间：2 1 7 1 年三月知日 学位论文使用授权书 糊黼始翰华撇名：锄碉- 钍l 址 签名日期：2 ? 年z 月弓p 日签名日期：2 0 0 7 年，2 月弓口日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 1 2 1 形态学的反应8 1 2 2 生理学上反应。9 1 2 2 1 有机酸分泌增加9 1 2 2 2 酸性磷酸酶、r n a 酶的分泌9 1 2 2 3 高亲和力磷酸盐转运蛋白10 1 2 3 生化上反应1 2 1 3 植物磷饥饿的信号途径1 2 1 3 1 局部信号和系统信号1 2 1 3 2 磷饥饿反应与激素信号的关系1 3 1 3 3 植物中磷信号传导及调控机制的研究1 4 1 3 3 1 拟南芥中以p h r l 为中心的磷信号调控体系。1 4 1 3 3 2m i c r o r n a 对磷信号的调控1 5 1 3 3 3 类泛素化修饰对磷信号的翻译后调控一1 5 1 4d n a 芯片技术1 6 1 4 1d n a 芯片的制作1 7 1 4 2d n a 芯片技术的应用一1 7 1 4 2 1 测序17 1 4 2 2 基因诊断与基因药物的设计1 8 1 4 2 3 基因表达谱分析18 1 5 本研究的目的和意义1 9 2 材料与方法。2 0 2 1 水稻材料种植2 0 2 2 样品采集和r n a 分离2 0 2 3 芯片杂交实验设计2 0 2 4 芯片荧光探针的标记、杂交、洗脱和扫描2 l 2 5m i c r o a r r a y 数据分析2 1 2 6 差异表达基因验证2 l 3 结果与分析2 3 3 1 芯片材料取样时间的确定2 3 3 2 芯片数据的有效性2 3 3 3 差异表达基因总体特征2 3 3 4 差异表达基因功能分类2 7 3 5 水稻中早18 和水稻l a g r u e 低磷反应共同点。2 8 3 5 7 7 7 3 5 1 根部磷酸盐转运蛋白、磷酸酶、核酸酶等基因上升表达2 8 3 5 2 根部n 吸收和利用相关基因下降表达3 l 3 5 3 根部脂代谢相关基因表达的改变3 2 3 5 4 根部蛋白质降解、细胞衰老相关基因上升表达3 4 3 5 5 根部氧化胁迫相关基因上升表达。3 7 3 5 6 根部跨膜转运蛋白基因上升表达3 7 3 5 7 信号传导相关基因表达的改变3 8 3 5 8 转座因子表达的改变4 0 3 6 水稻中早1 8 和水稻l a g r u e 低磷反应差异性4 0 4 讨论4 4 4 1 对芯片结果的理解。4 4 4 2 对侯选基因选择的一些设想4 6 4 3 芯片实验设计要注意的两点问题4 8 参考文献4 9 附录i实验操作指南。6 3 附录简历7 5 致谢：。7 7 2 磷是植物体内重要的营养元素。土壤中总磷含量丰富，但能被植物直接吸收利 用的可溶性磷含量却很低，成为制约农作物产量的重要因素。 低磷胁迫条件下，植物体可通过改变其形态结构及生理、生化代谢途径获取磷 酸盐。目前植物适应低磷胁迫的分子机制尚不清楚。本研究利用水稻基因组寡核苷 酸芯片研究了耐低磷水稻中早1 8 和不耐低磷水稻l a g r u e 在正常营养条件和低磷胁 迫后6 小时、2 4 小时、7 2 小时3 个时间点的全基因组表达谱。芯片杂交实验设计 有3 次生物学重复，每次生物学重复中又设有两次技术重复。研究结果共鉴定出两 种水稻低磷胁迫根部、地上部差异表达基因共5 6 8 7 个。其中，水稻中早1 8 出现差 异表达基因2 3 1 6 个，水稻l a g r u e 出现差异表达基因3 7 3 1 个。差异表达基因依据功 能注释依次分为磷酸盐转运、其它转运、磷酸酶、其它酶、主要代谢、次生代谢、 蛋白质降解、蛋白质合成等类别。 水稻中早1 8 和水稻l a g r u e 针对低磷胁迫反应在表达谱上存在一些共同点：具 体表现如下： 1 根部磷酸盐转运蛋白基因、磷酸酶基因、核酸酶基因等上升表达。 2 根部n 吸收和利用相关基因下降表达 3 根部脂代谢相关基因表达的改变 4 根部蛋白质降解、细胞衰老相关基因上升表达 5 根部氧化胁迫相关基因上升表达 6 根部跨膜转运蛋白基因上升表达 7 信号传导相关基因表达的改变 8 转座因子表达的改变 耐低磷水稻中早l8 和不耐低磷水稻l a g r u e 低磷胁迫时，在表达谱上还存在许 多差异。在低磷胁迫早期，耐低磷水稻中早1 8 根部通过加强糖酵解途径为其以后 侧根和根毛生长提供尽可能多的物质和能量。随着磷素的进一步缺乏，水稻根部和 地上部糖酵解都减弱。而不耐低磷水稻l a g r u e 低磷胁迫时，糖酵解就开始减弱，没 有糖酵解加强这一过程。耐低磷水稻中早1 8 在低磷胁迫开始时，三羧酸循环( t c a ) 加强，加强的三羧酸循环( t c a ) 产生更多的有机酸，分泌到土壤中，活化土壤中 的难溶性磷，这样有利于更好的吸收磷。同时低磷胁迫7 2 h 磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶( p e p c ) 上升表达，为三羧酸循环( t c a ) 产生有机酸提供足够的c 源。而不 耐低磷水稻l a 矿在低磷胁迫时三羧酸循环( t c a ) 始终减弱，不能产生有机酸去 活化土壤中的难溶性磷。 从这些差异表达基因中选择部分基因，可以作为遗传改良侯选基因，希望能对 我国水稻磷营养高效的利用提供有用的资源。 关键词：磷水稻芯片表达谱 4 a b s t r a c t p h o s p h a t e ( p i ) i so n eo ft h ee s s e n t i a ln u t r i e n t sr e q u i r e db yp l a n t s p h o s p h o r u st h a t c a nb ea b s o r b e db yp l a n t sd i r e c t l yi sv e r yl o wa l t h o u g hi ti sr i c hi ns o i l s u b - o p t i m a lp n u t r i t i o nc a nl e a dt oy i e l dl o s s e s p l a n t sh a v ed e v e l o p e dn u m e r o u sm o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a l a d a p t a t i o n st oa c q u i r ep h o s p h a t e h o w e v e r , t h em o l e c u l a rb a s e so ft h e s er e s p o n s e st op i d e f i c i e n c ya r en o tt h o r o u 9 1 a ye l u c i d a t e d e x p r e s s i o np r o f i l ei nr e s p o n s et ol o wp h o s p h a t e w a si n v e s t i g a t e df o r r i c ez h o n g z a o18 ( 1 0 w - p h o s p h a t et o l e r a n t ) a n dr i c el a g r u e ( n o t l o w - p h o s p h a t et o l e r a n t ) a t6 h r ，2 4 h ra n d7 2h ra f t e rl o wp h o s p h a t es t r e s sw i t ht h en o r m a l p h o s p h a t ea st h ec o n t r o l 谢t hd n ac h i po f6 0 ，0 0 0o l i g o s ( 7 0m e r ) r e p r e s e n t i n ga l l p u t a t i v eg e n e so fr i c eg e n o m ep u r c h a s e df r o mt h eb e i j i n gg e n o m i ci n s t i t u t e n e p l a n t i n ga n dh a r v e s t i n gw e r ec o n d u c t e dt r e b l y 、析t l l a ni n t e r v a lo f5d a y sf o rt h r e e b i o l o g i c a lr e p e a t s e a c ho ft h eh y b r i d i z a t i o n sw a sp e r f o r m e d 、析m2t e c h n i c a lr e p e a t s l l s i i l gi n d e p e n d e n ts a m p l e sf r o mt h r e ed i f f e r e n tp l a n t i n g s a t o t a lo f 5 6 8 7g e n e se x h i b i t e d a l t e r a t i o ni ne x p r e s s i o ni nr e s p o n s et ol o wps t r e s si na tl e a s to n eo ft h et h r e et i m ep o i n t s i nr i c ez h o n g z a o18a n di nr i c el a g r u e t h en u m b e ro fd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e s w a s2 316 ，3 7 31i nr i c ez h o n g z a o18 ，r i c el a g r u e ，r e s p e c t i v e l y n l ed i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e dg e n e sw e r ec l a s s i f i e d i n t o p it r a n s p o r t 、t r a n s p o r te x c e p tp it r a n s p o r t 、 p h o s p h a t a s e ，e n z y m ee x c e p tp h o s p h a t a s e ，p r i m a r ym e t a b o l i s m ，s e c o n d a r ym e t a b o l i s m ， p r o t e i nd e g r a d a t i o n 、p r o t e i ns y n t h e s i se ta 1 a c c o r d i n gt ot h eg e n e s f u n c t i o na n n o t a t i o n t h e r ew e r es o m ec o m m o na r e a si nt h ee x p r e s s i o np r o f i l eb e t w e e ni nr i c ez h o n g z a o 18a n di nr i c el a g r u ei nr e s p o n s et ol o w - p h o s p h o r u ss t r e s s s p e c i f i cp e r f o r m a n c ew a sa s f o l l o w s ： 1 t h eg e n e so fp h o s p h a t e t r a n s p o r t e r , a c i dp h o s p h a t a s e s ，n u c l e a s e w e r e u p r e g u l a t e d i nr i c er o o t s 2 g e n e si n v o l v e di nnm e t a b o l i s mw e r ed o w n - r e g u l a t e di nr i c er o o t s 3 s e v e r a lg e n e si n v o l v e di nl i p i dm e t a b o l i s mc h a n g e dt h e i re x p r e s s i o ni nr i c e r o o t s 4 s o m eg e n e si n v o l v e di nc e l ls e n e s c e n c ea n dp r o t e i n d e g r a d a t i o nw e r e 5 t op r o v i d e 嬲m u c hm a t e r i a la n de n e r g yt ol a t e r a lr o o ta n dr o o th a i rf o rg r o w t hi nr i c e z h o n g z a o18r o o t sd u r i n ge a r l ys t a g e so fp id e f i c i e n c yt r e a t m e n t s a saf u l t h e rl a c ko f p h o s p h o r u s ，t h eg l y c o l y s i sd e c r e a s e di nr i c ez h o n g z a o18s h o o ta n dr o o t s t h ep r o c e s so f s t r e n g t h e ng l y c o l y s i sd i dn o te x i s ti nr i c el a g r u er o o t sd u r i n ge a r l yo rl a t es t a g e so fp i d e f i c i e n c yt r e a t m e n t s t h et c ac y c l ew a ss t r e n g t h e na f t e rl o w - p h o s p h o r u ss t r e s s t r e a t m e n t ss t a r t e di nd e ez h o n g z a o18r o o t s t h u st h em o r eo r g a n i ca c i d sw a sp r o d u c e d a n dr e l e a s e di n t ot h es o i lt o a c t i v a t et h ei n s o l u b l ep h o s p h o r u s a n dt h ei n c r e a s e d e x p r e s s i o no fp h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y l a s eg e n e sh e l p st os u p p l ys u f f i c i e n tc a r b o n s o u r c et op r o m o t et h et c a c y c l ei nr i c ez h o n g z a o18r o o t s t h et c a c y c l ed e c r e a s e d d u r i n ge a r l yo rl a t es t a g e so fp id e f i c i e n c yt r e a t m e n t si nr i c el a g m er o o t s s oo r g a n i c a c i d sc a nn o tb ep r o d u c e da n dr e l e a s e di n t ot h es o i lt oa c t i v a t et h ei n s o l u b l ep h o s p h o r u s i nr i c el a g r u er o o t s t h ei d e n t i f i c a t i o no fd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sc a l lp r o v i d eu s e f u li n f o r m a t i o n t of u r t h e rs t u d yt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f p l a n ta d a p t a t i o nt ol o wp h o s p h o r u s a n d t h e s ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sc a nb eu s e da sc a n d i d a t eg e n e st oi m p r o v ep iu s e b y c r o ps p e c i e s k e yw o r d s ：p h o s p h o r u s ；r i c e ；d n ac h i p ；e x p r e s s i o np r o f i l e 6 重要物质的组成成分，核酸、蛋白质、磷脂、植酸、a t p 存在。 接吸收的磷，以可溶性磷酸盐的形式为主。磷酸盐主要靠 扩散作用移向根表，以正磷酸盐的形式被植物被动吸收。植物在吸收磷酸盐的过程 中，磷酸盐首先进入表皮和皮层的质外体，然后，在磷酸盐转运蛋白作用下，跨膜 进入共质体，再经木质部输送到地上部分，从而分配到不同器官( s m i t h , 2 0 0 2 ) 。 磷酸盐被植物吸收后，少数以离子状态存在于体内，绝大多数都被同化为有机物。 植物根部吸收磷酸根的过程是一个耗能的协同运输过程，它是由质膜上的 i c - a t p a s e s 所产生的跨膜的h + 离子梯度所驱动。共转运所需要的旷可由外界环境 提供，也可被质膜上激活的旷泵提供。当土壤溶液p h 值发生改变时，植物根系对 磷酸根的吸收能力也会随之发生改变，在较低的p h 条件下，根系对磷酸根的吸收 会大大增加( s c h a c h t m a ne ta 1 ，19 9 8 ；u l r i c ha n dn o v a c k y , 19 9 0 ) 。在n h + h 2 p 0 4 。共转 运过程中，随着外界磷酸盐浓度的变化，相对的r 1 值也会有所改变。1 1 值一般在2 4 之间摆动。当外界磷酸盐浓度较低时，n 值可达4 ，而当外界磷酸盐浓度稍高时， 1 3 值可达2 ( s a k a n o ，1 9 9 0 ) 。 1 2 植物对低磷的响应 由于土壤中能被植物体直接吸收的有效磷含量很低，植物在长期的进化过程中 形成了一系列适应低磷环境的机制。植物对低磷适应性一般包括形态学适应、生理 学适应以及生化适应等三个方面。植物形态上的变化能够帮助植物在营养缺乏条件 下获取和贮存更多养分，而生理、生化改变则可帮助植物提高养分吸收或利用能力。 植物对低磷适应性目的是为了提高植物对磷的吸收及加强体内磷的代谢能力而提 高磷利用效率。 1 2 1 形态学的反应 目前，植物根部对土壤中的营养变化而改变根构型结构的发育机制还不清楚。 植物在低磷条件下，植株的根冠比增大，根构型也发生变化( f o h s ee ta 1 1 9 9 1 ；b a t e s a n dl y n c h , 19 9 6 ；k e e r t h i s i n g h ee ta 1 ，19 9 8 ；l i s ae ta 1 ，2 0 01 ) 。 大多数土壤中的有效磷主要集中在土壤表层并随土壤耕层深度的增加而降低 ( l i s ae ta 1 ，2 0 0 1 ；t h a l a ra n dp a g e ，1 9 9 7 ) 。低磷条件下植物为了更好的获取磷素， 通过改变自身根系构型，使根系在土壤中有效磷含量较高区域分布较多。这样促使 植物主根细胞的伸长减少，主根变短，而侧根长度和密度增加( l i s ae ta 1 2 0 0 1 ) ， 基根向地性减弱，生长角度变小，根系在表层生长介质中的分布相对增加( 王庆仁 等，1 9 9 8 ) ，从而导致整个根系变浅。豆科植物生长在低磷条件下，其基根生长会 发生变化，使其向四周生长，而不是向下生长( b o m e re ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 高等植物在对磷酸盐的吸收过程中，根毛具有重要作用，根部吸收的磷酸盐 9 0 通过根毛来加以实现( f o h s ee ta 1 ，1 9 9 1 ) 。对拟南芥的研究表明，缺磷导致了 根毛长度和密度的大幅度增加( b a t e sa n dl y n c h ，2 0 0 0 ) 。同时，有些高等植物如白 羽扇豆在低磷条件下会产生排根。排根由象瓶刷样的簇根组成，表面覆盖有致密的 根毛，簇生根的产生可以大大的提高植物根系与土壤的接触面积，同时释放出大量 的柠檬酸，一方面使根际酸化，另一方面能够鳌合f e 、a l 、c a 等，从而提高了土 壤磷的有效性( j a n ee ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 磷在土壤中的扩散系数很低，植物一般仅能吸收距根表面1 - 4 r a m 根际土壤中 的磷( 李庆逵，1 9 8 6 ) 。在此情况下，根系除了通过改变根的长度和粗细、根毛和 侧根的数量及密度等来扩大根系与土壤磷的接触面积，还能与菌根真菌相互作用， 以提高植物对磷的吸收效率。陆生植物9 0 能和菌根真菌形成共生关系( d a n i e le ta 1 1 9 9 8 ) 。许多研究表明，菌根真菌浸染植物根系形成菌根，对于扩大根系的吸收范 围和面积，活化土壤中的难溶性磷具有重要作用( 李玉京等，1 9 9 9 ) 。菌根真菌与 植物共生，真菌从植物得到c 源，植物从真菌得到p 和其它矿质元素( s m i t h a n dr e a d ， 1 9 9 6 ) 。植物和微生物在吸收土壤中有效磷过程中存在着竞争，菌根这种共生关系 可以提高植物竞争能力。真菌的分泌物如有机酸，可以将难溶性无机磷转变为能被 植物吸收有效磷，真菌分泌的磷酸酶可以将土壤有机磷水解为能被植物吸收的有效 磷。小麦接种菌根真菌后，菌根的酸性和碱性磷酸酶的活性以及植物的吸磷量均有 提高( g u n t e re ta l ，19 9 9 ) 。觅豆接种菌根真菌4 0 d 后，磷酸酶活性增加了2 倍( l y n c h , 8 1 9 9 9 ) 。植物体内磷主要以无机磷形式运输，移动速率为2 m m h 1 ，而菌丝内磷则以 聚磷酸盐颗粒形式进行运输。由于v a 菌根真菌的菌丝无隔膜，磷能随原生质环流 向根内运输，因此其运输速率可达2 0 m m h 1 ，为根内运输速率的l o 倍，使根外菌丝 吸收的土壤磷能较迅速地运输到根内丛枝中，再由聚磷酸盐分解为简单的无机磷转 移到寄主植物体内( b o l a a , 1 9 9 1 ) 。 1 2 2 生理学上反应 1 2 2 1 有机酸分泌增加 低磷胁迫条件下，有些植物有机酸分泌增加，促进植物对难溶性磷酸盐的活化 与吸收( l i p t o ne ta 1 ，1 9 8 7 ；g r i e m o 玛1 9 9 2 ) 。通常在低磷条件下，双子叶植物比单子 叶植物分泌的有机酸能更有效地活化土壤中的磷。根分泌有机酸部位一般位于根尖 后l 2 厘米处( h o f f l a n de ta 1 ，1 9 9 2 ) 。苜蓿在缺磷胁迫条件下根系分泌的有机酸有 柠檬酸、苹果酸和丁二酸，其中柠檬酸的分泌量是正常供磷时的2 倍( l i p t o n ，1 9 8 7 ) ， 油菜是利用难溶性磷能力比较强的作物，在缺磷条件下，其根分泌物中含大量的苹 果酸和柠檬酸( h o 们a n de ta 1 ，1 9 8 9 ) 。 目前，对植物分泌有机酸的机理研究并不多，只局限于对白羽扇豆和油菜的研 究。生长在石灰性土壤中的白羽扇豆，缺磷胁迫条件下形成特殊排根，并于排根处 分泌大量的柠檬酸，其释放量可达总干物重的1 5 2 3 ，柠檬酸活化的磷足以满足 白羽扇豆自身生长对磷的需要。通过计算白羽扇豆吸收阴阳离子电荷平衡，发现白 羽扇豆排根分泌的是柠檬酸而不是柠檬酸盐( d i n k e l a k e rc ta 1 ，1 9 8 9 ) 。最近研究表 明，排根形成加速、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( p e p c ) 的上升表达及柠檬酸的分 泌是白羽扇豆对缺磷胁迫的适应机制。其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( p e p c ) 活 性的变化在排根分泌有机酸过程中起十分重要的作用，研究还表明排根分泌的有机 酸2 5 - 3 4 来自于根中非光合作用固定的c 0 2 ，其余的则来自叶片光合产物( j a n ee t a l 。1 9 9 6 ) 。 1 2 2 2 酸性磷酸酶、r n a 酶的分泌 ， 磷酸酶按其所处的最适p h 值，可分为酸性磷酸酶和碱性磷酸酶。植物体内主 要以酸性磷酸酶形式存在。酸性磷酸酶主要定位于植物液泡和质外体表面 9 ( g o l d s t e i ne ta 1 ，1 9 8 8 ) 。植物根部的酸性磷酸酶能将植物根际的有机磷转变成能被 植物体直接吸收的无机磷酸盐，同时，苗和叶里的酸性磷酸酶能将木质部内主要含 磷化合物磷酸胆碱水解，释放出磷酸盐，以供植物体生长需要( j a m e se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 酸性磷酸酶上升表达是高等植物体内应对磷饥饿的一种普遍反应( d u f fe ta 1 ， 1 9 9 4 ；h a r a ne ta 1 ，2 0 0 0 ；b a l d w i ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。酸性磷酸酶还可作为一个植物体内磷 酸盐含量是否缺乏的标记( a s c e n c i o ，1 9 9 4 ) 。第一个分泌型的酸性磷酸酶基因是从 拟南芥中克隆的，它的蛋白是由4 6 0 个氨基酸构成的。将其与绿色荧光蛋白融合表 达，在缺磷的根系分泌液中便能检测到绿色荧光( h a r a ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。番茄酸性磷 酸酶l e p s 2 的表达受低磷胁迫特异诱导，其它营养胁迫如低氮、低钾、低铁等生长 条件下不会诱导酸性磷酸酶的表达。同时，其它非生物胁迫如1 5 0 m m n a c i 、4 。c 、 3 7 1 2 等生长条件下亦不会诱导其表达。但是当低磷营养液中重新添加磷酸盐时，酸 性磷酸酶的转录会在1 2 小时内下降。分根实验表明，小部分根置于磷酸盐充足环 境中，对抑制酸性磷酸酶表达就足够了( j a m e se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在白羽扇豆的排根中， 缺磷诱导分泌型酸性磷酸酶大量表达。将缺磷的排根放在含有磷酸酶底物的琼脂 上，几分钟即可检测到酶的活性( m i l l e re ta 1 ，2 0 0 1 ；w a s a k ie ta l ，1 9 9 9 ) 。白羽扇豆的 分泌型酸性磷酸酶基因已被克隆，它主要在排根中表达，并专一的受磷饥饿诱导 ( w a s a k ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 在高等植物中，核糖核酸酶能够降解核糖核酸释放出磷，使其重新参与磷素循 环( b a r i o l ae ta 1 ，1 9 9 4 ；d o d d se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。根部分泌到根际中的r n a s e 能降解土壤 中r n a 而释放无机磷，而体内的r n a s e 使死亡细胞或衰老细胞中的有机物中的磷 得以重新利用。受低磷胁迫诱导，番茄细胞产生4 种核糖核酸酶，其中3 种位于液 泡，另一种在液泡外，恢复供磷后，4 种r n a s e 减少( l o f f i e r e ，1 9 9 2 ) 。表明番茄细 胞在低磷胁迫下r n a s e 合成增加，释放r n a 中的磷，提供给细胞生长。同时磷饥 饿也使番茄r n a s e 在悬浮细胞中受到诱导表达( d o d d se t a l ，1 9 9 6 ) 。拟南芥在低磷 条件下3 种r n a s e 基因均受到不同程度诱导表达( g o l d s t e i n ，1 9 8 9 ) 。 1 2 2 3 高亲和力磷酸盐转运蛋白 土壤中磷酸盐经扩散作用进入表皮和皮层质外体后，必须跨膜才能进入共质 体。在跨膜过程中，磷酸盐转运蛋白起着十分重要作用。土壤中磷酸盐浓度以u m 计，而植物根部细胞内磷酸盐浓度以m m 计，所以，磷酸盐的吸收主要靠高亲和力 磷酸盐转运系统。 1 0 首次从酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e u i s i a e ) 中克隆了高亲和力磷酸盐转运蛋白的 编码基因p h 0 8 4 ( b u n y ae ta 1 ，1 9 9 1 ) ，继之从丝状真菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 、菌根 真菌( v e s i c u l a r - a r b u s c u l a ri r am y c o r r h i z a l ) 中克隆了同源基因( v c r s a w , 1 9 9 5 ；h a r r i s o n a n dv a n , 1 9 9 5 ) 。近几年已从拟南芥( m u c h h a lc ta 1 ，1 9 9 6 ；s m i t he ta 1 ，1 9 9 7 ) 、马铃 薯( l e g g e w i ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 和番茄( l i u e ta 1 ，1 9 9 8 ) 等高等植物中克隆了高亲和力 磷酸盐转运蛋白的编码基因，并证明，每个物种基因组中高亲和力转运蛋白基因是 一含少数几个成员的基因家族。从真菌、酵母，以及高等植物中分离出的高亲和力 磷酸盐转运蛋白均有共同的保守结构，即1 2 跨膜区域，且由一个带电荷的亲水区 分隔成2 组，每组6 个。高亲和力磷酸盐转运蛋白这种结构和糖、离子、抗生素、 氨基酸等转运蛋白具有相同特征( g r i f f i t he ta 1 ，1 9 9 2 ) 。同时，还存在3 个保守位点， 即蛋白激酶c 调节的磷酸化位点、酪蛋白激酶i i 调节的磷酸化位点及n 一连接糖基 化位点。 高亲和力磷酸盐转运蛋白基因在低磷条件下诱导表达，多数偏爱在根部表达， 如拟南芥高亲和力磷酸盐转运蛋白基因a t p t l 和a t p t 2 等，少数几个除了在根部表 达外，在其它部位也可以表达，如番茄高亲和力磷酸盐转运蛋白基因l e p t l 和土豆 磷酸盐转运蛋白基因s t p t l 在茎、叶、花也可以表达( l e g g e w i e e t a l ，1 9 9 7 ；l i ue t a l ， 1 9 9 8 ) 。 低磷条件下，高亲和力磷酸盐转运蛋白基因转录水平上升的同时，该基因的蛋 白水平也上升，说明高亲和力磷酸盐转运蛋白基因属于转录正调节( m u c h h a l ， 1 9 9 9 ) 。m u c h h a l 等( 1 9 9 9 ) 研究发现，当再将磷酸盐饥饿番茄转入到含2 5 0 u m 磷酸 盐营养液中后，l e p t l 转录水平在2 4 小时内下降。u t h a p p a 等( 2 0 0 1 ) 利用拟南芥高 亲和力磷酸盐转运蛋白基因a t p t 2 启动子分别与低磷和磷含量正常培养的拟南芥根 部核内蛋白因子相互作用，凝胶阻滞实验分析表明，a t p t 2 启动子与低磷培养条件 下的拟南芥根部核内蛋白因子不能结合，而能与正常磷培养条件下的拟南芥根部核 内蛋白因子相互结合。说明，拟南芥在磷酸盐含量正常培养条件下，一些蛋白因子 与a t p t 2 启动子能结合，从而阻碍相关基因的转录；而在低磷条件下，那些蛋白因 子不能与启动子区域结合，这样致使该基因诱导表达。h u a n g 等( 2 0 0 0 ) 研究大麦 中发现，大麦根中高亲和力磷酸盐转运蛋白基因h v p t 和- v p t 2 的表达与z n 在 大麦中含量息息相关，在z n 缺乏时，大麦不管是生长在低磷还是磷含量正常条件 下，高亲和力磷酸盐转运蛋白基因均表达，而且，z n 的这种特异性调节地位还不能 被m g 所代替。这表明z n 在高亲和力磷酸盐转运蛋白基因表达的信号传导中起着 重要作用( h u a n g c ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 2 3 生化上反应 生物体内糖酵解途径不仅要为各种代谢提供碳骨架，还是植物提供维持生命所 必须的能量来源。在磷饥饿胁迫下，a t p 和a d p 的浓度下降，糖酵解途径可以绕 过不需要a t p 或a d p 参与的步骤进行( t h e o d o r o ua n dp l a x t o n , 1 9 9 6 ) 。 焦磷酸是二级代谢的副产物，通常在细胞的代谢过程中不被利用。在磷缺乏时， 蔗糖向己糖磷酸的转换过程中，可通过焦磷酸依赖的途径进行。此途径需要u d p 葡萄糖焦磷酸化酶( u d p g l u c o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e ) 。拟南芥缺磷条件下u d p 一 葡萄糖焦磷酸化酶的表达量增加( c i e r c s z k oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。植物缺磷时，葡萄糖一6 磷 酸可以通过焦磷酸依赖的磷酸果糖激酶( p f p ) 催化，转变为果糖- 1 ，6 - - 磷酸。这使 得焦磷酸充当能量的提供者，帮助维持有限的a t p 库( t h e o d o r o ue ta 1 。1 9 9 2 ；p l a x t o n a n dc a r s e w l ，1 9 9 9 ) 。低磷条件下，在3 一磷酸甘油醛生成3 一磷酸甘油酸的糖酵解过 程中，n a d p 依赖的3 一磷酸甘油醛脱氢酶可以代替反应过程中需要磷酸盐参与的 n a d 依赖的3 一磷酸甘油醛脱氢酶，行使催化作用，以节约磷。另外，磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶( p e p c ) ，苹果酸脱氢酶( m d h ) ，n a d 型的苹果酸酶可以代替需要 磷才能发挥催化作用的丙酮酸激酶( p k ) ，使得磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 转化为 丙酮酸，从而进入下一步代谢( p l a x t o na n dc a r s w e l l ，1 9 9 9 ) 。 质子从胞质到液泡的主动运输可通过液泡膜上的a t p 依赖的质子泵或p p i 依赖 的质子泵进行。在胞质a t p 不足的情况下，液泡膜两边p h 梯度的维持可由a t p 为 动力的h + 泵转换为p p i 为动力的一泵( p l a x t o n ，1 9 9 6 ) 。 这些代谢途径的改变，能够帮助植物在缺磷条件下尽量少的利用磷来维持植物 生长( h a m m o n de ta l 。2 0 0 4 ) 。 1 3 植物磷饥饿的信号途径 1 3 1 局部信号和系统信号 k o c k 等( 1 9 9 8 ) 在细胞水平上分析了磷的感受机制。以番茄培养细胞进行研究， 当细胞从含磷培养基质转入到无磷的培养基中时，核糖核酸酶基因编码的m r n a 在2 小时内显著升高；相反，当再将细胞从无磷的培养基转入含磷充足的有磷培养 基中时，2 _ 4 小时内该基因编码的m r n a 则降低到极低的水平。表明在单细胞水平 上，细胞能够直接感知外界磷含量，当外界磷浓度高时，磷饥饿诱导表达基因不表 达，当外界磷浓度低时，磷饥饿诱导表达基因迅速上升表达( k o c ke ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 目前植物对低磷反应的调控方式被认为主要有两种，一是依赖于整株磷水平的 信号，是系统性的；另一是依赖于外部磷浓度局部信号。 高等植物在低磷条件下，一些磷饥饿诱导基因的表达明显迟于细胞培养中这些 基因的表达，需要几天才能达到最高峰( m a r t i ne ta 1 ，2 0 0 0 ；b a l d w i ne t a l ，2 0 0 1 ) 。因 为在高等植物中，低磷胁迫之前，体内已经积累了一定的磷，需要胁迫一段时间， 使体内在整株水平上磷缺乏时，磷饥饿诱导表达基因才上升表达。分根实验也支持 这种观点。在分根实验中，部分根处于低磷环境中，部分根处于正常磷环境中，结 果在低磷环境根部中磷饥饿诱导基因没有上升表达( b u r l e i g ha n dh a r r i s o n , 1 9 9 9 ； m a r t i ne ta 1 ，2 0 0 0 ；b a l d w i ne ta 1 ，2 0 0 1 ；h o uc ta 1 ，2 0 0 5 ) 。在对拟南芥地上部低磷突 变体础d j 的研究发现，在正常供磷条件下，该突变体中的a t 4 基因仍然诱导表达， 说明地上部的磷浓度是植物磷饥饿反应的决定因素( l i ue ta 1 。1 9 9 8 ；b u r l e i g ha n d h a r r i s o n , 19 9 9 ；f o r d ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 尽管许多磷饥饿反应基因的表达都受植株磷整体水平所调控，但是仍有一些低 磷反应是依赖于局部磷含量水平，如根毛的密度和长度。s h a n e 等( 2 0 0 3 ) 对白羽扇 豆的分根试验说明排根的发育与局部供磷的状况有关( s h a n ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。对水稻的 分根试验也发现，局部供磷可以影响根的形态和构型( h ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 3 2 磷饥饿反应与激素信号的关系 对植物进行生长素和在乙烯处理，会出现低磷胁迫症状，如促进侧根和根毛 的生长( s c h i e f e l b e i n ，2 0 0 0 ；l o p e ze ta 1 ，2 0 0 2 ) ，改变根生长角度( h ee ta 1 ，1 9 9 2 ； l y