（水产养殖专业论文）枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌融合子的构建及其生物学特性研究.pdf

摘要 本研究将具有淀粉酶和植酸酶酶活等优良特性的枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 和具有纤维素降解能力的的生孢噬纤维菌( s p o r o c y t o p h a g a m y x o c o e c m d e s ) 进行原生质体融合，希望得到具有双亲优良特性于一体的益生菌。 通过筛选最终得到一株具有淀粉酶、植酸酶酶活及强烈降解纤维素多功能融合 子。本研究包括以下部分： 1 分离纯化枯草芽孢杆菌，并对其进行生理生化和酶活鉴定。结果获得具 植酸酶和淀粉酶酶活的枯草芽孢杆菌b s 一1 菌株。 2 分别对枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌进行生长曲线测定，结果显示枯草 芽孢杆菌和生孢噬纤维菌对数生长中期分别为6 小时和6 5 小时。 3 利用单因素试验探讨影响枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌原生质体形成率 和再生率的因素，结果显示：b s 一1 和s m 一1 最佳溶菌酶浓度为5 m g m l ，6 m g m l ； 酶解时间为1 小时。在这种条件下，b s 一1 菌株的原生质体形成率和再生率分别 为9 0 2 8 ，i 0 8 0 ；s p 一1 菌株的为7 8 6 6 , 1 1 19 7 0 4 利用热灭活的方法对生孢噬纤维菌原生质体进行灭活处理，结果显示： 灭活时间5 0 分钟，灭活温度为6 0 0 c 。 5 在p e g 6 0 0 0 和c 酽+ 存在下使二者在3 7 。c 水浴箱中融合6 0 r a i n 。并进行可 稳定遗传融合子的筛选合子。在选择培养基上获得8 7 株融合子，连续传代l o 代，获得一株稳定的融合子。 6 比较亲本及融合子菌落表型，显微形态，生化特性，酶活鉴定，对融合 子进行初步鉴定。 7 用d n a 琼脂糖电泳方法进一步对融合子进行d n a 鉴定，确证初筛结果。 8 对融合子及其亲本的纤维素酶，植酸酶和淀粉酶活性进行测定。结果证 明融合子淀粉酶酶活高于其亲本，纤维素酶活和生孢噬纤维菌相当，植酸酶活性 略低于枯草芽孢杆菌。 关键词：原生质体融合，融合子，纤维素酶，植酸酶，淀粉酶。 a bs t r a c t b s - 1w i t hh i g ha m y l a s ea n dp h y t a s ea c t i v i t ya n ds m 一1w h i c hc o u l dd e c o m p o s e c e l l u l o s e e f f e c t i v e l yw e r et r i e dt oi n t e g r a t ei n t oaf u s a n tb yp r o t o p l a s tf u s i o n nt h e e n d ，am u l t i f u n c t i o n a le n g i n e e r i n g s t r a i nw h i c hh a dt h ea m y l a s e , p h y t a s e ，a n dc e l l u l a s e a c t i v i t yw a sc o n s t r u c t e ds p e c i t i c m e a s u r e sa n dr e s e a r c hr e s u l t sw e r es h o w e da s f o l l o w s ： 1 ab a c r t e r i u mn a m e db s - 1w a ss c r e e n e df r o ma q u a t i cf e e d i tw a sp r o v e dt o s e c r e t e sl a r g ea m o u n to f a m y l a s ea n dp h y t a s e 2w em e a s u r e dt h eg r o w t hc u r v eo fb s - 1a n ds m 1 b y m e a n so f s p e c t r o p h o t o m e t e rr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el o g a r i t h m i cm e t a p h a s e o f g r o w t ho f t h et w os w a n sw e r e6h o u r sa n d65h o u r sr e s p e c t i v e l y 3 d i s c u s s i n gf a c t o r sw h i c ha f f e c tt h ef o r m a t i o nr a t ea n dr e g e n e r a t i o nr a t eo f b s 一1a n ds m - 1b ym e a n so f o n e - w a ye x p e r i m e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h eb e s t e n z y m et r e a t i n gs o l u t i o no f t h eb s 一1w a s5 m g m l ，b u tt h es m - 1w a s6 m g m l ；t h eb e s t t r e a t i n gt i m ew a s6 0 m i n a tt h i se n z y m et r e a t i n gs o l u t i o na n dt i m e ，t h ep e r c e n t a g e so f p r o t o p l a s tf o r m a t i o na n dp r o t o p l a s tr e g e n e r a t i o no ft h eb s - 1 w e r e9 02 8 a n d 1 08 0 r e s p e c t i v e l yb u tm es m - 1w e r e7 8 6 6 a n d97 0 4 c h o o s i n gt h eh e a t - t r e a t i n gp r o t o p l a s tt od e s t r o yt h ep r o t o p l a s to fs m - 1 t h e r e s u k ss h o w e dt h a t ：t h eb e s tt r e a t i n gt e m p e r a t u r ew a s6 0 。ca n dt r e a t i n gt i m ew a s 5 0 m i n 5 ，a t3 7 。ci nw a t e rb a t h ，t h ep r o t o p l a s t so f t h et w os t r a i n sw e r eb ef u s i n g6 0 m i n a tp e g 6 0 0 0a n d c a 2 + ，a n dt h eg e n e t i c l ys t a b l ef u s a n t sw e r es c r e e n e d 8 7f u s a n t sw e r e i s o l a t e do ns e l e c t i n gc u l t u r em e d i u ma n dm a k et h e me x i s tf r o mt h ef i s tg e n e r a t i o nt o t h e1o 血g e n e r a t i o n , g e t t i n gag e n e t i c l ys t a b l ef u s a n t sf u s a n t s 6 c o m p a r i n g t h e a p p e a r a n c e o f c o l o n y , m i c r o s o s m i cc o n f i g u r a t i o n ， p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c c h a r a c t e re x p e r i m e n to ft h ep a r e n ta n df u s a n tt oi d e n t i t y t h ef u s a n tp r e l i m i n a r i l y 7i d e n t i f y i n gt h ef u s a u tf u r t h e rb ym e a n so fd n a e l e c t r o p h o r e s i st og e tt h e s t e a d yg e n e t i cf u s a n t 8 ，m e n s u r a t i n gt h ea c t i v i t yo f a m y l a s e ，p h y t a s ea n dc e l l u l a s et oc o m p a r et h e 。n z y m a t i ce n e r g eo f f u s a n ta n di t sp a r e n t st h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h ee n e r g eo f a m y l a s eo f f u a n t sw a sm o r et h a ni t sp a r e n t s ；t h ee n e r g eo f c e l l u l a s ea p p r o a c hm i g h t y t os m - 1 ；a n dt h ee n e r g eo f p h y t a s ew a s c l o s et ob s 1 k e yw o r d s ：p r o t o p l a s tf u s i o n ；f u s a n t ；c e l l u l a s e ；p h y t a s e ；a m y l a s e 枯草芽拖杆菌和生搬噬纤维菌融合子的构建及其生物学特性研究 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成巢。尽我所知，豫r 文中特别加以标注积致谢豹地方外，论文中不包含其他 人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学健或证书箍使用避的材料。与我一嗣工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 矜叠投时问：酗年月 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学彼论文。同意湖南农业大学w 以用不闷方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密看应遵守_ 垂l ：协议) 研究生签名 对露r 嫒 翩躺：够 直 时间：睨年厶 时间：洲多年占月，占日 枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌融台“f 的构建及其生物学特性研究 l 研究嚣的和意义 第一章绪论 避年来，随着我器规模化、高密度水产养殖业豹迅速发鼹，工业废水和生活污 永的大量摔救，使养殖生态环境遽到严藿破坏，水产动物瘸害频繁发生，传染性疾 病笺延越来越快，发病攀越来越离，危害越来越严整，水产动物病害成为了水产养 殖业发展的瓶颈。秘蓠在水产动物疾病茨治中主要使用广谱抗生素，虽然使掰抗生 素能够有效地掇刳某些疾瘸豹发生黎蔓延，但是它于扰养殖醛境中郛水产动物体表 及肠道中存益微生物菌群豹委常生长和繁殖，导致微生态失调，水产动物对癍原微 生物的易感性壤加，易产生多重感染。特别是病缀藏的耐药性增强，使防治异常困 难。此外，抗生素豹使用还会等致其在永生动物体内的残露、富集，水产晶质壁降 低，熊害人类豹健康，制约水产品销售和出口贸易。因此，人们认识到不能对养殖 水体逃章亍掠夺式的开发，必须进行无公害养殖，开发微生惑制蒡l 矛匿各种免疫增强裁 等无公害渔药，用以替代抗生索，发展健康养殖。 微生态制裁无毒、纛残鹭、不产生抗药性，能够麴制痰琢微生物，改善养殖生 态环境，维持生态平衡，增强水产莽殖动物的免疫力，从两减少疾病发生。但微生 态划剂是由一种或数羊孛裒活性的微生物组成，其效果优劣有赖于微生物的穗类及其 作用类型与活性高低。因此，选择合适的菌种、改善和增加其活性是微生态制荆研 制中一项十分袁意义的工传。 本实验拟通过原生质体融合技术，将其有植酸酶和淀粉酶活性的枯草芽孢杆菌， 与能降解纤维素形成胞乡 多糖的生孢噬纤维菌进行原生赝体融合，以期找到具有双 亲优良性状并能够稳定遗传的融台子，著对其形态、结构、生理生化特性、酶滔性， 数及d n a 围源性进行了黟 究。警在通过灏生餍体融合，培育掇将纤维索降解成旗莓 糖、果糖等简单糖类、产生益生菌亲本之间的优势盥补、降低环境因予对微生态菌 株及其酶滔的不利影晌的融合子，寻求该技术在微生态制裁育种上的瓶突破。这对 于进一步利用细胞融合技术培育和开发具有多功能的益生菌菌种资源，增加细胞融 合酶铡剂工程菌和优良微生态制荆的幂申类，解决水产动物在疾病防治上成本高、效 果差，在营养调控上内源酶不足、饲料利用率低等系列难题，快速推进益生菌代替 枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌融台子的构建及其生物学特性研究 抗生索防治疾病的进程，改善水体环境，修复、保持微生态环境的平衡，提高水产 品质擞，增强我国水产品的竞争力，保障食品安全和人类健康都具有熏要的科学意 义和实用价值。 2 。生孢噬纤维菌的硬究概况和终维素酶在水产上的开发利用 2 1 生孢噬纤维菌的研究概况 生孢噬纤维葑( s p o r o c y t o p h a g a 。o e 玩0 为能够降解纾维素的滑动细菌“1 。 它和堆囊菌、噍纤维菌同属于能够降解纤维素的滑动细菌。他们的共同特点是能够 在固体表蘧抉速潺动，携够吸辩劐赣班生长的不滚性固体介质表嚣获取营养，这对 于其能够降解不溶性纤维素是非常重要的。生孢噬纤维菌本身具有特殊的生活史， 具有菌丝搏和小孢囊两种主要形态，菌丝体在蓉莽缺乏或遇到逆境时，形成小獭囊， 条件合适时，小孢囊再萌发成菌丝体。据刘东波。4 报道生孢噬纤维菌为能够降解纤 维素的滑动细蘸，可强烈地降鳃终维素，攀兰氏染色阴性，菌体形态为可挠届杼状、 末端钝圆、无鞭毛、大小为0 2 0 p m 0 3 9 i n ) 1 m 3 h m ，培养后期发现有小孢囊形成， 直经为0 5 9 m 一0 。6 社m ，为带有内凹的圜球彤，培养的任何阶段都束发现有予变体形 成。在葡萄糖，蔗糖，淀粉等碳源上生长时，该细菌菌体为0 9 一i 5p m 的杆状细胞， 在培养后期，括状缨胞缩短成为更短的短轷状和孢囊。而在纤维素为唯一碳源培养 时，在培养的2 4 h ，菌体细胞的长度就明显变长达n 2 1 2 7 p r o ，培养歪1 1 4 8 - 5 9 h 时， 莹体煲是变得明显细长，长度达n 2 7 4 0 1 a m 。故推测细长的杆状细胞可能是生孢 噬纤维细菌降解纤维素时生成的一个重要形态，即菌体在形成细长细胞的过程中， 大量合成纾维索酶，辫解滤纸纾续素，两只有细长的生孢噍纤维细菌的杆状细胞才 是具有降解纤维素活性的细胞。小孢囊主要出现在不良的墙养环境或老培养状态， 故小孢囊应是生孢噬纤维细菌在培养后期出现的不具有纤维索降解活性的体眠状态 的细胞。在降解纤维素的过程中，生孢噬纤维菌通过与纤维素物质紧密的粘附作用， 强烈地降解纤维素并产生胞外英膜多糖“1 。 2 2 纤维素酶的酶解机理及其在水产上的研究和应用 2 。2 。1 纤维素酶系的酶解枫理“ 纤维素酶是指能降解纤维索生成纤维二糖和葡萄糖分子的一类酶的总称。研究 枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌触台子的构建及其生物学特性研究 表明，纤维素酶系之间存在协同作用。通常情况。f ，葡聚糖外切酶( e x o j ，4 p d - g l u e a n a s e , e c 3 2 1 9 1 ) 作用于纤维素分子菲还原性末端，水解8 l 囊一糖菅键，每 次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶。葡聚糖内切酶( e n d o j ，4 芦 d - g l u c a n a s e ，e c 3 2 ，铆一般终用于天然纤维素内部的非结晶馥，随机水解叠 一1 ，4 一糖苷键，将长链纤维素分予截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素， 纤维 螽聚糖也是其赢物，其水解速率随键的加长面加快。蕺聚糖蒈酶f 算 g l u c o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 1 ，b g ) 一般将纤维= 糖或纾维寡糖水解成葡萄糖。必须指出， 该协阚降解枫铡中各酶豹作翊不是绝对的，两置葫能也不是简单固定豹。 2 2 2 纤维素酶的营养作用及奠在水产动物生产上研究和_ 敷用 水产动物镭料中含存适量的粗纤维燕维持潢佬遴正常功能顼必需豹，面饲料中 纤维索过多，食糜通过消化道速度加快、消化时间缩短、导致蛋白质和多种矿物质 元素蔽收剥餍率降低，影响水产动物生长和镄毒毒豹利瑶”。水产动物消亿道中，一 般不存在纤维索酶或酶活性很低，对纤维索的分解极为有限“3 。因此，有必要在水 产动物饲料中添船纤维索酶。 2 2 。2 1 分瓣营养物质，改善镧料的结构和品质，促进水产动物生长 具鸯活性的纤维索酶，耗泰效蟪将饲糕孛豹一些糖类大分子多聚体分解期消化 成水产动物容易吸收的营养物质或分解成小片段营养物质，同时提商微生物对饲料 的分解，增搬单细藤蛋童含量，殴昶l 予其镳消纯酶进步漕纯。此外，纾维素酶 露在 半纤维素酶、果胶酶替协同作用下破坏细胞壁，使细胞内容物释放出来以利于进一 步降鳃提亵吸收率，阍辩也增加了j 淀粉多糖的港化，逃谣改善粗饲辩逶e 1 牲，促 进了水产动物摄食，并提高了旃纤维锶料的利用率。y a n g 嘲报道，在粗饲料添加纤 维索酶帮木聚糖酶，不疆提商了鸯机携和中性洗涤终维的溺化率，丽且微生物蛋白 质食成量也相应增加。赵东海“”认为在锶料中添加适量的纤维素酶一方面可改善饲 料的结构和品质，另一方瑶有剥予降低镪料成本，减少浪费蛋白资源造成环境污染， 为人工养殖鳜鱼创造更好的经济效益。 2 2 。2 。2 键遽氨基酸相奎肽的熏吸收，摄离饲料蛋白质的承l 用率 随着饲料中纤维素水平的升高，内源氨基酸的排泄量明显增加，其中以必需氨 基羧瓣增触隔度最大，显键料中较离的纤维素能吸收氨基酸帮小肽弗阻止其重吸收 枯草芽弛杆菌和生孢噬纤维菌融台子的构建及奠生物学特性研究 “。鱼类对蛋白质的需求量较高，并偏好于以蛋白质为供能物质，而蛋白质的许多 重要生理功能是脂肪和糖类所不能代替的。因此饲料中适宜的能量蛋白 = c ( c p ) 既能 满足鱼类对能量的需要，又有利于蛋白质的最佳利用，从而提高饲料的效率。 2 2 23 消除抗营养因子，分解毒物因子，改善消化机能，提高营养吸收率 植物性饲料原料中常存在一些非淀粉糖、果胶、纤维素聚合物，这些物质使水 产动物消化道内容物的粘度增加，使营养物质和内源消化酶不能充分接触，降低了 蛋白质、淀粉等营养物质的消化利用率“”。纤维素酶可以破坏食糜周围的水化膜， 加速细胞壁中多糖类物质的降解为小分子物质，增加食糜与酶及小肠的接触面，降 低食糜黏度；促进内源酶扩散，加大酶与底物接触机率，有效消除这些抗营养因子 的不良影响，改善动物的消化机能。加强肠道内容物流动性，维持小肠绒毛形态完 整、并使肠道形态结构发生有利于营养物质消化、吸收的变化，从而促进营养物质 吸收，提高饲料效果，减少排泄物中营养物质的含量和其对水体的污染。邓岳松“” 在研究中发现由纤维素酶，淀粉酶，蛋白酶等组成的复合酶对饲料中的一些抗营养 因子具有灭活作用消除鱼对营养物质的消化和吸收困难。 2 2 24 补充内源酶的不足，激活内源酶的分泌和活性 虽然有些水产动物能通过体内的微生物合成纤维素酶，但酶量有限，使粗纤维 的消化吸收受到一定限制，而补充纤维索酶制剂则可明显提高其对纤维素的利用率。 同时，添加纤维素酶后，动物消化道酶系的组成、酶分泌量及活性可以得到改善， 并改善消化道环境，增加酸度，激活胃蛋白酶。如余年丰“”报道纤维素酶能促进动 物胃肠蠕动，刺激内源消化酶分泌。特别是对于草食水产动物来说，可以补充体内 纤维素酶的不足。s u n g “8 利用三种浓度1 3 葡聚糖浸浴斑节对虾幼虾，发现其显著 促进了对虾的生长，同时0 5 和1 浓度提高了酚氧化酶活性以及抗菌能力。 2 2 3 纤维素酶在水产动物医学上的研究和应用 国内外很多研究证明在饲料中添加纤维素酶，对增强水产动物机体抵抗力，控 制疾病，净化水质，促进动物健康生长具有重要意义。 2 2 3 1 改善消化道菌群结构及比例，减少水体污染，促进水产动物健康 纤维素酶能够加强肠道内容物流动性，减少有害微生物附着和繁殖，减少肠道 有害微生物的数量，促进有益微生物生长，保护水产动物健康。同时抑制细菌繁殖， 枯草芽瓶杆菌和生张噬纤维苗融台子的构建及其生物学特性研究 改善消化系统，并具有一定的消炎作用，防止和减缓水产动物的应激反应，减少排 泄物中营养物矮的含量秘其对水体的污染。徐国武等“”在含大麦粉4 1 3 的饲料 中添加b 葡聚糖酶饲喂鲤鱼，使肠道食糜粘性增加，结果使肠粘膜表面不动水层 增厚，掰寸着大援的益生菌( 乳酸菌、酵母菌、双歧杼菌、芽熙杆菌等) ，可以起到抗 病提商免疫力的作用，减少发病率和死亡率，从而保证水产动物健康快速生长。 2 2 3 2 增强机体免疫力 r a m i “，s r i t u n y a l u c k s a n a “”等研究发现1 3 葡聚糖、木聚糖，几r 质，肽聚糖 等物质能增强机体免疫力。丽纤维素酶能将一些大分子多糖物质降解为葡聚糖， 木聚糖，几丁质等物质。而这些物质能提高水产动物体内溶菌酶活性、补体活髋和巨 噬细胞杀菌活力，巨噬细胞和血细胞超氧化酶活力增强。刘伟“”在研究饲料中不同 含量的b 葡聚糖酶对自鲟幼鱼脂肪合成酶及肝组成的影响对发现，随着葡萄 糖含量的增加，稚鲟的4 种主要肝脂肪合成酶活性提高。 2 2 4 纤维素酶在水产其他方面的研究和废用 纤维素是地球上段丰富的可再生生物资源。纤维素酶可以把纤维素水解成葡萄 糖从箍用它代替淀粉来生产水产饲料。比如d i t e r 等“”研究发现，纤维素酶和葡聚糖 酶可以提高大麦的营养价值。 泽细胞蛋自代替鱼粉用于水产饲料，霜益受到重视。我们可以幂t 用纤维素酶降 解非还原性多糖来生产酵母等单细胞蛋囱。董亮1 等在大米细糠中添加纤维索酶生 产饲料单缡胞蛋白质。粱新乐”等采用纾维素酶木聚糖酶复合酶系可将玉米芯永解 生成可发酵性糖类，将其用作生产富含虾青素的饲料酵母的原料。此外，法夫酵母 通过分泌纤维索酶等胞外物质，能利用多种还凛糖迸行生长、合成虾青素。虾青素 是一种重要的类胡萝h 素，广泛用于饲料添加剂中，虾青索除作为高档饲料营养强 化剂外，还具有高度碎灭单莺态氧和消除自由基的作用，增强机体免疫能力，其生 物活性比维生索e 、胡萝b 素都高得多，从而大大提高了饲料酵母的营养品质。 虽然我函经过近几年的研究发震，镪用酶铷藕已形戒定的规模，但是与匿外 相比，产量还很低，因此，选育高效降解纤维索和分泌纤维索酶的菌株，尤为薰要。 枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌融台子的构建及其生物学特性研究 3 枯草芽孢杆菌的研究概况及其植酸酶在水产上的应用 3 。 桔草芽孢杆菌的谤究概凝 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 是一种好氧或兼性厌氧，可以产生抗逆性内生孢 子豹苹兰氏阳性杼状纲蓥，在土壤、永体罨j 植耪表嚣普遍存在，圭予能够产生对热、 紫外线、电磁辐射和某烘化学药品强抗性的芽孢，可忍受各种不良环境，如可以在 蝉为2 - 3 的施方生存，也可以在溢度离达6 0 。c 甚至以上豹建方生长，南极寒冷的 冰雪中也能见到它们的踪迹，在自然界分布较为广泛。能防治多种动植物病害， 其芽孢可班潮成羚裁、可湿性粉剃等各韩镧型或与化学药物滢用面不失活。“。它是 对人畜无毒害、不污染环境、对许多病原生物具有拮抗作用的非病原微生物o ”，枯 草势沲括菌可以产生多麟抗蕴物质“2 “，包括l 旨效类、获类、骥脂类、纲菌素等物 质，可克服病原菌对现有的抗生素的抗性问题。现在，有关芽孢的生理性质、生化 组成班及芽豫形态学和遗传学磺究已经成为一个饕常重要的领域，其中枯草芽穆拇 菌的研究已经成为原核生物分化的范例。同时它能够产生大量的淀粉酶、抗菌蛋白、 以及在饲料工业上具骞开发潜力豹檀黢酶，因两圈益受到水产工 乍纛的关注。 3 2 枯草芽孢杆菌植酸酶的酶学性质 燕蚕t 9 8 2 年，v i s h n u k p o w a r 。3 等才首次分离到产植酸酶的轱鼙芽孢杆菌，弗 进行了酶学性质研究，其最适p h 为7 5 ，6 0 c 作用1 h 酶活保存8 3 ，7 0 0 c1 0 m i n 酶活保 存7 0 ，具毒窿度的底物特异性，虢植酸钠为底魏豹k m 僮为0 0 5 m m o l ，凝胶电泳出 现两个条带，这也是目前所报邀的芽孢杆菌植酸酶中唯一出现的现象，且两条带都 有酶活性。1 9 9 2 年，m i k i os h i m i z u 等拉9 1 从豆腐中分离到b s u b t i t i s ( n a t t o ) n 7 7 檀酸 酶菌株，并揭示其分子量为3 6 - 3 8 k d ，最适p h 为6 0 6 5 ，最适温度为6 0 。c ，k m 值为 0 5 m m o l 。1 9 9 8 年k i m 等擞邋t b a c i l l u ss p 。檀酸酶，分子量为4 4 ，最逶碡 为 7 0 ，在p h 4 0 培0 范围内都很稳定，最适温度为7 0 0 c ，在5 r e t o o l 钙离子存在下9 0 0 c 作 用1 0 m i n ，剩余酶活5 0 ，k m 僮为0 5 5 m m o l 。k e r o v u o 等。“研究表疆，枯草芽孢杼 菌榱酸酶在5m m o l lc 矿溶液6 0 0 c 培育1 0m i n 后保留酶活9 0 以一t ，若没有c a 2 + 存在刚无酶滔。只有在c a 2 + 的存在下，德骏酶才旁热稳定性，两豆在热诱导的交性 后，植酸酶才可部分复性，可见，c a 2 + 对植酸酶的三维结构具有稳定作用。然而， 枯草芽张牲蓉和蕊：张嘴纤维翦融旨子的构建投其生物学特性研究 过量的c a ：+ 也会抑制植酸酶的活性。3 。2 0 0 1 年王亚茹等”也报道了芽孢杆菌械酸 酶，分子量为4 5 k d ，最适孵为7 5 ，擐适湿度为5 5 。c ，5 5 作用l h ，剩余酶活5 0 ，6 0 。c 作用l h ，剩余酶活1 0 ，以植酸钠为底物的k m 值为0 1 9 m m o l l 。 3 3 植酸酶的营养作用及其在水产上的应遐 枯草芽孢杆菌能够产中性植酸酶，其最适p h 量中性，能够满足消化道里中性的 鱼类的镱辩添嬲剂的需要，传为水产馕料添加裁具有显蓑的优势和开发潜力。 3 3 1 分解植酸磷释放磷元素提高动物对磷的利用率 水产动物体内几乎无檀酸瓣荐在，蠢法裂羽饲辩中的攘酸磷”3 。添加撼羧酶能 够分解植酸磷，释放磷元素，倪进水产动物对磷的吸收，大大提高了磷的翻用率。 r i c h o 等。”在奴鳟饲料中添加1 0 0 0f l u k g 饲料的樽酸酶，结采可使豆粕中磷的铡擂 率从2 5 增加到5 7 ，提高了1 2 8 ；p a p a 仃y p h o n s 等。1 撒道。在条纹猿鲈饲料中喷 洒植酸酶溶液t 0 0 0f i u k g ，发现植酸酶提高条纹狼鲈对磊粕中磷的利用攀2 3 。 3 3 2 破坏植黻一金属离予络台物，释放z n ”、c a ”等微豪元素 撞酸熊与z n 2 + 、c 蠢h 、i v l n 2 + 、f c = 抖等鳌含形成稳定豹不溶性络合物，从丽降 低了鱼类对这黩矿物质元素的生物和用率，添加德酸酶能破坏植酸与垒属离子络合 物，群放金耩离子，提高水产动物对徽量元素的利用率。s u g i u r asn 等9 ”在虹鳟饲 料中添加植酸酶。提高了虹鳟对e a 2 + 、m 矿、c u 2 * 、f e 2 + 、s n 2 + 和z n 2 十的表观消纯率。 3 3 3 破环援鞍与蛋白瑷络岔，挺高水产动物对蛋白质的利用率 在适蛊的p n 条件下，植酸在消化道中可与爨自质形成难溶的植酸蛋随瑷络合 物，降低鱼类对蛋逸质的剥用率，添加植酸酶w 部分地释放被植酸络合的蛋幽质， 从而提高蛋白质的利嗣率。s t o r e b a k k e n 等在大褥洋鳟豆牿、蹙粉为蒸础饲料踩料中 添蚋植酸酶。试验结采表明添加植酸酶明最改善了动物对蛋囱质的袭观消化率1 。 3 3 4 补充水产动物肉潦酶术足及分泌，键进营养物矮分解 植酸对霹蛋白酶、腠蛋妇酶、淀粉酶、脂肪酶的活性有抑制作用，从而降低了 蚕自质、淀粉、月旨肪这些营养物旗的消优暇收。添加楗酸酶有可能部分解除檀酸对 内源酶的挪翩作用，健避内源酶分泌，提高动物对营养物溪的漓纯分解，键避水产 动物生长。z i - - s a y e d a f m 等用檀酸酶处理豆粉锶喂罗 鱼测定内源酶活性，发现 枯草芽獭杆菌和生孢噬纤维菌融合子的构建及其生物学特性研究 植酸酶处理组内源蛋白酶活性显著高于对照组。 3 。3 5 降低磷的 泄，减少对琢壤的污染 械物性饲料原料中的植酸磷不仅造成原料的浪费，而且污染水质，破坏生态环 境。在水产动物中添加植酸酶大大降低了磷的封 泄，减少了对环境的污染。s u g i u r a s n 等0 7 】于艮道；在阻大豆粉为基础原料的虹鳟饲料中添加植酸酶，鱼类粪便中的排泄 量消耗l 毽饲料搀泄磷0 3 2g ，比投喂商品鱼饲料磷的排泄麓减少t 9 5 - 9 8 。 4 原生质体融合技术的研究概况 骤生质体融合亦称缁施融合，是使一个细胞的遗传物餍，包捶d n a 和垓外基翟 都进入另一个细胞的技术。其目的是使进人该细胞的另一个细胞的遗传基因为该细 胞所接受，或弓i 起该纲胞遗传特性的变异，这种接受豹遗传特性或发生的遗抟变异 能够一代代传下去并稳定下来。目前，原生质体融合已被广泛运用于动、植物和微 生物豹育稚工作中，并取褥了融大进展。 4 1 原生质体融合技术发展简史 垂从氩措发现p e g 在逶慧的c a 2 + 存在下能有效豹促进豫生质体融合，a n n e 和f e r e n e z y 证实了p e g 能促进真菌原生质体融合之后，原生质体融合技术便跨入 了一个薪阶段，共不断丰富霜发袋。从融合方法上，除了搀统的化学方法外，1 9 8 0 年，z i m m e r m a n n “”等报道了电场诱导融合技术，以后几年慰，人们把这项新的融合 手段从动物、檀物扩展列微生物领域。国内直到1 9 8 1 “”年才报道了江行媲等通过骧 生体融合进行质粒转移的研究。1 9 8 8 年王岳五“。等进行了芽孢杆菌种间原生质体融 合。1 9 9 2 年支l 伊强“”等探讨了棼孢杆蒴藏生覆体的形成、辩生，及中润融合盼影响 因素。1 9 9 9 年钟蕾和2 0 0 4 年陈光荣“”用草鱼肠炎病、烂鳃病和赤皮病的三种病 原萤构建了二元和三元融合子，磬将其成功遮制餐了缨施融合灭活疫苗。 在融合菌株的选择方面，除了传统的利用形态差异和营养缺陷溅作为遗传标记 选挺融合蓥橡，新的选择方法撬药性标记、琢活原生质体“”，荧光染色等逐渐被使 用“”。针对融合子的不稳定性，人们在获得融合子后常结会生物学鉴定方法、生化 鉴定方法以及分子生物学方法米进行严格的鉴定，去伪存真。 4 2 原生质体融合技术育种的优势 枯草芽孢杆釜和生孢噬纤维菌融食予的构建敷其生物学特性研究 ( 1 ) 克服远缘物种间不相容屏障，进行种内、种间、属间、目问原生质体的融合。 ( 2 ) 不需要详细了解研究对象的遗传背景便可进行操作，阑而可对微生物中大部 分尚朱充分研究其遗传背景的菌种进行重组育种。 ( 3 ) 与当前进行的基阈工程方法不同，不需要进行梅建载体系统的困难工作，而 是直接通过原生质体融合进行染色体片段的转移。 能进行多基因转移，从丽克服基因工程载体携带基因少雨对多纂因无能为力 之不足，且不需要昂贵的仪器设备。 4 3 源生蒺体融合豹技术程序、方法 4 3 1 菌株遗传标记的筛选 在原生质俸融合过程中，通常所用的亲株要有一定的遗传标记，阻便于筛选。 亲本壤株获得遗传标记的方法可采用常规的诱变方法，以及诲养缺陷型和抗药性等 遗传性状为标记。在选择标记时，尽可髓采用该菌株自身己带的遗健标记为好。 4 3 2 原生质体的制备 测备原生矮体要注意以下几个阚题： ( 1 ) 菌龄：细菌原生质体制备的最适菌龄为对数生长期。 ( 2 ) 酶解温度和p h ：温度一般在2 5 4 0 = c 之闯，p h 以酶滚自然p h 僮霹可。 ( 3 1 酶解时间：酶解时间过短，原生质体形成不完全，会影响原生质体间的融合； 酶解时间过长，原生质体的矮黻受损伤影响琢生质体的荐生。 酶浓度：在一定范围内，酶浓度增加，原生质体化加快，超过一定范围反应 速度不再明显提高；酶浓度过离，服生质俸再生率会降低。 ( 5 1 渗透压稳定剂的种类和浓度：渗透压稳定剂是为了避免原生质体因渗遴作用 破裂丽对其起保护佟用的，但不同的渗邋压稳定裁对溶菌酶的活洼有一定驰影响。 ( 6 ) 脱壁促进荆种类和浓度：这也是影响原生质体形成和氍生的黧要因素之一。 4 3 3 源生反体的再生遥疆 酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能重建细胞壁，恢复细胞完整 影态并能生长、分裂，这是原垒质体融合育瓣豹必要条件。由予仅有缁魏貘豹器生 质体对渗透拦很敏感，很容易破裂致使原生质体液外流而使其死亡，所以，再生培 枯草芽子魍杆菌和生孢噬钎维菌融合子的构建及其生物学特性研究 养基必须与原生质体内的渗透压相等。这就要在再生培养基中加入具有一定渗透压 的渗透压稳定剃。影穗原生质体辩生因素主要有菌株本身的再生特性，原生质体制 备条件，再生培养基成分，再生培养条件等“8 ”1 。 4 3 4 艨生蔟体的融金 促进原生质体融合的方法主要有以下几种： “) 生物学法：采用病毒促进融合，如仙荟病毒、天花病毒、到流感病毒等能诱 导融合。仙苔病毒最早用于动物细胞融合。 ( 2 ) 化学融会翔法：采用的化学融合荆包括聚乙二醇( p e g ) 、甘浊醋酸脂，油酸 盐等化合物，其中聚乙二醇( p e g ) 应用最为广泛。c a ：+ 的存在可促进原生质体融合。 p e g 应用最广泛，应用最多的是p e g 4 0 0 0 和p e g 6 0 0 0 两种。 ( 3 ) 电处理融合法：其原理是藤于双向电泳和膜的电降解，己成功的应用于植物、 酵母、哺乳动物细胞等方面，具有操作简单等优点。 43 5 融合株的选择及鉴别 4 3 5 1 融合子的选择 如何准确、迅速、简便地筛选出所需要的异源融合子，这是原生质体融合能否 取得成功的一个非常重要的环节。常用的选择方法及选择标记有：其一营养缺陷型 标记，原理是融合双亲为不同的营养缺陷想( 单缺或双缺) ，双亲的原生质体由于遗 传缺陷，丧失了合成某种营养物质的能力丽不能在基本再生培养基上萌发生长，只 有缺陷的遗传物质得到甄补的融合子才能生长。翼二灭活原生质体标记，原联是对 单亲或双亲原生质体进行灭活，使其丧失再生的能力，当与另一亲株融合后，代谢 上得到互补，能够存滔。在这个系统中，被灭活的原生质体实际上超了遗传物质的 载体作用。灭活原生质体的方法很多，如热灭活、紫外光灭活以及化学灭活等，其 中以化学灭活与热灭活效果较好，运用得当效果几乎达到1 0 0 。其三抗药瞧标记， 该标记是由遗传物质决定的，不同的真菌对某一种药物的抗性存在差异，利用这种 差异w 对融合予进行选搀。其图荧光色素标记，该法是在酶解制备犀生质体时向不 同细菌酶解液中加入不同种荧光色素，使双亲原生质体分别带上不同的荧光色索， 融合子带有两种荧光，经过显徽操作，可赢接挑选出带有两种荧光的融合子。 4 3 5 2 融食子的鉴别“o 4 ” 枯草芽殉杆菌和生孢噬纤维菌融台子的构建及其生物学特性研究 融合后所枪出的融合子，由于融合双亲亲缘关系的远近、染色体数目和大小的 差异等滕困，融合子实际上是一个十分不稳定的杂种异核体。匿此，箨要将捡出的 融合予多次传代进行稳定性测定，去伪存真。常见的鉴定方法有：其一生物学鉴定 方法，包括菌落表型、拮抗实验、核摺观察及结实实验等几个方嚣。其二生理生他 标记，主要是从酶、蛋囱质水平对融合子及亲本进行鉴定。如同工酶电泳图谱攀定、 可溶 生蛋白质凝胶电泳图谱分秽亍等。其三为分子标记鉴定方法，是煮接利用核瞢酸 序列变异而得到的标记，为原生质体融合予在分予水平上的鉴定提供了科学根据。 常用豹分子标记有：r f l p 鄂艰制性片段长度多态憾、p c r 法即聚合酶链式反应、 r a p d 即随机扩增多态性d n a 、a f l p 即扩增片断长度多态性。 4 3 6 融会予生产性缝捡测 进行原生质体融合育种的最终目标就是要得到集两个亲本优良性状于一体，并 能在生产上推广应用的超级杂种。融合子经过一系列鉴定排除了那些假的、遗传性 能不稳定的后，就得到了稳定可靠的杂种菌株。佩他们能番在生产上得到广泛的应 用，则需要做生产性能的检测。最终筛选蹬能够在生产上攘广应用且有明显杂种优 势的原生质体融合工程菌株。 枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌融合子的构穗及其生物学特性研究 第二章枯草芽孢杆菌的分离纯化 芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生獭子的抨状细菌 。“。芽孢杆菌属与人类关系极为密切，是越来越引起人们熏视和研究的一个重要的 微生物类群嘲。本试验鲁在通道对在水产养殖上具有重要菔生作用的枯草芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 进行分离纯化，以便为后面的原生质体融合提供可靠的实验材料。 1 实验材料 1 1 实验夔釉来源 内含多种益生菌的混合菌种样品，由南海水产研究所赠送。 1 。2 试剂和药品 牛肉膏，蛋白胨，蛋白胨，营养琼脂，酵母没出汁，葡萄糖，甘露醇，蔗糖， 氯纯钠，六水氯化镁，氢氯化钠，盐酸，磷酸氢二钾，柠檬酸钠，明胶，七衣骧酸 镁，磷酸氢二铵，硫酸钙，脲，木糖，山梨醇，蔗糖，溴酚兰，甘油，溴甲酚紫， 酚红，硝酸锋，硝酸铵，甲基红，硫酸豫铁，淀粉，碘液，穗醋酸，瑾萘胺，慰氨 基苯磺酸，结晶紫，复红石炭黢，酒精等。 1 。3 实验仪器 试管，平皿，载玻片，盖玻片，凹玻片，锥形瓶，玻璃棒，三角刮棒，研玻， 烧掇，移液管，枪头，滤纸，p h 值试纸，按种环，接种针，镊子天平，邀炉，随 温水浴箱，生化培养箱，恒温振荡培养箱，显微镜，高压蒸汽灭菌锅，无菌嶷等。 2 方法 2 1 菌株的分离和纯化5 ”1 2 1 1 菌悉液的制备 称取试验样品1 9 ，放入无荫研钵中研碎，加无菌水1 0 m l 制成1 1 0 的样晶稀释 液。摇床振荡3 0 m i n 。静置5 m i n 吸取上清液l m l ，依次稀释1 0 2 ，1 0 3 ，1 0 4 ，t 0 5 倍。 2 1 2 平板接种 涂抹法：用移液枪吸取1 0 0 9 l 的稀释渡于肉膏蛋白膝平扳中央，箍聱用三角形 玻璃棒涂匀。1 0 3 ，1 0 4 ，1 0 5 每个梯度涂抹两个平板。( 肉膏蛋囱髂培养基：蛋白胨1 ； 枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌融合子的构建及其生物学特性研究 牛肉膏o 5 ；氯化钠o 5 ；蒸馏水1 0 0 m l ；固体培养基加2 的琼脂。) 混菌法：吸取稀释滚o 5 m l ，加入无菌的培养腿中，分别注入预先溶化并冷却到 5 0 6 0 的培养基约1 8 2 0 m l 。轻轻摇转培养皿，使样品和培养基充分混匀。 2 。1 。3 分离培养 搂种好的培养皿，3 0 0 c 恒温培养2 天使可见弼明显的菌落。根据菌落的形状、 大小、表面和边缘结构、质地、光泽、透明度、颜色和产生的可溶色素等特征，将 孤立的单个菌落一一挑出，移到相应培养基的试管或平板上继续培养2 天，并编号。 2 1 4 继代培养 连续继代培养l o 代，保留活性无明疑变化的菌株。 2 1 5 菌株保存 筛选出的菌株，采用牛肉膏斜面临时保存。斜面置于4 冰箱中。 2 2 菌株鉴定” 2 2 1 菌体形态观察 将待鉴定菌在内膏蛋白胨平板上培莽2 4 h 后染色并镜检。染色方法包括：革兰氏 染色、鞭毛染色、英膜染色、细胞壁染色、抗酸染色。 革兰氏染色 将供试菌株和对照菌株同时按种在肉汤蛋白胨培养基上，培养1 8 2 4 h ，按照三 点品行法，在同一载玻片上滴三滴水，用接种环挑取供试菌株和分别作为阴性对照 的生孢噬纤维菌和阳性对照的棼云金杼赣的菌苔，于水滴边缘轻轻涂抹几下，自然 风干并在火焰上固定涂片、染色和镜捡。 芽孢染色 将供试荫株和对照菌株接种到淡薄墙养基上培养2 4 h 之后染色，用饱和的孔雀 石绿染色后再以蓍红复染。 鞭毛染龟 将待测菌株接种于岗汤蛋舀黥培养蒸中，违续传代四次，然后取样染色。取样 时，在细菌弥散生长较明显的隧域，浩取极少景的菌株，静止悬浮于载玻片上的小 水滴中，待水珠稍变浑浊，立即移开按种环，将载玻片倾籀竖立，使菌液从载玻片 枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌融台子的构建及其生物学特性研究 的一端缓漫流至另一端，自然干燥后染色，取菌时应尽量少取，减少背景的干扰。 2 。2 2 培养特征观察 取菌龄为2 4 - 4 8 h 的菌株集中在肉膏平板、斜面、营养肉汤中3 0 0 c ，培养2 4 h 。 同时进行琼脂柱、明胶穿刺培养，温度3 0 0 c ，2 4 h 培养。 2 2 3 需氧性测定