（光学专业论文）冷休克蛋白力致去折叠的动力学模拟.pdf

河南人学2 0 1 0 届硕十学位论文 摘要 蛋白质折叠和去折叠机制是蛋白质研究的重要领域。蛋白质的j 嘟角折叠是体 现生物功能的基础，也是生物学中最基本和最普遍的白组装模式。肽链在体内如 何折叠主要取决于其一级结构和肽链所位于的细胞环境，一般来说，蛋白质能自 发的折叠成具有特定空间结构和生物功能的分子。但是环境因素的改变会使肽链 构象发生变化，也就是说蛋白质采取何种空间结构不仅受肽链自身热力学稳定性 的控制，还受到蛋白质分予所处的微环境和动力学过程的影响。 蛋白质的构象转换在生物体内是一个普遍的现象，近年来的医学研究发现， 蛋白质在人体内的错误折叠会引起严重的疾病；另一方面重组蛋白质的高效表达 常常导致无活性的蛋白质聚集体生成。因此，研究蛋白质的折叠机理和促使蛋白 质复性的方法无论在理论上还是在应用上都有很重要的意义。 除了一系列试验技术( 例如原子力显微镜、光镊等等) 以外，计算机模拟对 于研究这些问题具有不可替代的作用，分子动力学模拟是研究蛋白质分子动态性 质的主要方法之一，与实验方法互补，在生物大分子体系研究中得到了广泛的应 用，它能够给出皮秒( 1 0 。2 秒) 到微秒( 1 0 。6 秒) 时间尺度内蛋白质在原子水平上的 动力学信息。生物大分子的计算机模拟在这个领域开展时间并不是很长，但是已 经在研究蛋白质折叠和去折叠以及功能因素等方面取得了很多成就，并且还在进 一步的发展完善之中。 我们研究嗜热和嗜温两种冷休克蛋白在外力作用下的去折叠过程和机制，采 用分子动力学软件包n a m d 在相同的外力情况下进行两组分子动力学模拟，都 以蛋白质的完全去折叠作为模拟终点。我们着重从氢键相互作用，静电相互作用 和疏水相互作用这三个方面讨论了影响冷休克蛋白的去折叠因素，本论文主要包 括以下部分： 1 概括的论述了分子动力学理论的基本原理，以及蛋白质的相关基本概念。 l 河南人学2 0 1 0 届硕士学位论文 2 主要论述了嗜温冷休克蛋白在常速和常力两种动力学模拟中的去折叠过 程，研究发现在两种拉伸过程中，嗜温冷休克蛋白都是c 端p 片层首先破裂，随 后n 端p 片层破裂，然后讨论了决定嗜温冷休克蛋白去折叠的内部相互作用力。 3 论述了嗜热冷休克蛋白和嗜温冷休克蛋白在常速和常力两种动力学模拟 中去折叠的异同，在常速去折叠的过程中，嗜温冷休克蛋白c 端b 片层的破裂需 要更大的力，但是嗜热冷休克蛋白在n 端b 片层的破裂中需要更大的外力。 随着计算机运算能力的大幅度提高和算法的发展，计算机模拟技术将在更大 体系，更长时间尺度内的蛋白质动力学研究方面发挥更大的作用。 关键词：动力学模拟，去折叠，力，n a m d i i 河南人学2 0 1 0 届硕十学位论文 a b s t r a c t t h em e c h a n i s m so f p r o t e i nf o l d i n ga n du n f o l d i n g ，i st h ei m p o r t a n tf i e l do fp r o t e i n r e s e a r c h t h ep r o t e i n sm u s tf o l di n t ot h e i rc o r r e c tt h r e e - d i m e n s i o n a lc o n f o r m a t i o ni n o r d e rt oa t t a i nt h e i rb i o l o g i c a lf u n c t i o n p r o t e i nf o l d i n gi st h em o s tf u n d a m e n t a la n d u n i v e r s a le x a m p l eo fb i o l o g i c a ls e l f - a s s e m b l y h o wap o l y p e p t i d ec h a i nf o l d si n t oa s t a b l e ，n a t i v es t r u c t u r ei nv i v oi sd e p e n d e n to na m i n oa c i ds e q u e n c ea n dn a t i v e s o l u t i o n e n v i r o n m e n t g e n e r a l l y , t h ep o l y p e p t i d ec h a i n w i t hg i v e na m i n o a c i d s e q u e n c ec a ns p o n t a n e o u s l yf o l di n t oac e r t a i nt h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r ew i t hu n i q u e b i o l o g i c a lf u n c t i o n b u ts t r u c t u a lt r a n s i t i o nc o u l dt a k ep l a c ew h e nt h ee n v i r o n m e n to f p r o t e i ni sc h a n g e d ，t h a ti st os a y , t h et h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u n t u r eo fp r o t e i n i s d e t e r m i n e db yn o to n l yi t st h e r m o d y n a m i cs t a b i l i t y , b u ta l s ot h em i c r o - e n v i r o n m e n to f p r o t e i na n dk i n e t i cp r o c e s s s t r u c t u a lt r a n s i t i o no fp r o t e i ni sc o m m o np h e n o m e n ai no r g a n i s m t h er e s e a r c h f o u n dt h a tt h es t r u c t u r a l t r a n s i t i o na n dm i s f o l d i n go fp r o t e i nc o u l dl e a dt os e r i o u s d i s e a s e s o nt h eo t h e rh a n d ，t h eo v e r e x p r e s s i o no fr e c o m b i n a n tp r o t e i n si ne s c h e r i c h i a c o l io f t e nr e s u l t si nt h ea c c u m u l a t i o no ft h ep r o t e i n ，p r o d u c i n gi n a c t i v ei n s o l u b l e d e p o s i t s i n s i d et h ec e l l s ，c a l l e di n c l u s i o nb o d i e s t h e r e f o r e ，t h e s t u d y o nt h e m e c h a n i s mo fp r o t e i nf o l d i n ga n dt h ed e v e l o p m e n to fm o r ee f f i c i e n tf o l d i n gm e t h o d s i sv e r yi m p o r t a n ti nt h e o r ya n dp r a c t i c e b e s i d e sas e r i e so fe x p e r i m e n t a l t e c h n i q u e s ( a f m ，o p t i c a lt w e e z e r se t c ) ，t h e m o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o np o s s e si r r e p l a c e a b l ee f f e c tf o rs u c hr e s e a r c h m o l e c u l a r d y n a m i c s ，o n eo ft h em o s tp o p u l a r ss i m u l a t i o nm e t h o d s ，h a sb e e np r o v e dt ob eap p o w e r f u l t o o li n s i m u l a t i n gd y n a m i cp r o p e r t i e so fp r o t e i n m o l e c u l a rd y n a m i c s s i m u l a t i o n sc a np r o v i d eaa t o m i c a lr e a l i s t i cv i e wo ft h ef o l d i n ga n du n f o l d i n gp r o c e s s f r o mp i c o s e c o n dt om i l l i s e c o n d e v e nt h o u g hm ds i m u l a t i o na b o u tb i o m a c r o m o l e c u l e i i i 河南入学2 0 1 0 届硕+ 学位论文 i si nas h o r tt i m e ，m ds i m u l a t i o n sh a v es u c c e e di nt h e s ef i e l d ，a n di tn e e df u r t h e r d e v e l o p m e n tt oo v e r c o m ei t sd i s a d v a n t a g e t h e r m o p h i l i ca n dm e s o p h i l i cc o l ds h o c kp r o t e i n ，w h i c hh a v eb e e ne m p l o y e dt o m o d e lf o r c e du n f o l d i n go fc o l ds h o c kp r o t e i n w es t u d yt h eu n f o l d i n gp r o c e s sa n d m e c h a n i s mo ft h ep r o t e i n sb ye x t e r n a lf o r c ew i t hd y n a m i c ss o f t w a r ep a c k a g en a m d t h ec o m p l e t e l yu n f o l d i n go ft h ep r o t e i n sw e r et h o u g h ta se n do f d y n a m i c ss i m u l a t i o n w ec h i e f l ys t u d yt h eu n f o l d i n gm e c h a n i s mo ft h ep r o t e i n su n d e rt h ei n t e r a c t i o no f h y d r o g e nb o n d ；e l e c t r o s t a t i ca n dh y d r o p h o b e ，c o m et ot h ec o n c l u s i o na sf o l l o w ： 1 w en o to n l yi n t r o d u c e dt h eb a s i cp r i n c i p l eo fm o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n ， c o n c e p to fs t e e r e dm o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n ，a n db a s i cp r i n c i p l eo fp r o t e i n 2 u s i n gs t e e r e dm o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n ，w ee x p l o r e dt h eu n f o l d i n g p r o c e s so fm e s o p h i l i cc o l ds h o c kp r o t e i nb yc o n s t a n tv e l o c i t ya n dc o n s t a n tf o r c e t h e r e s u l t si n d i c a t et h a t1 3 s h e e to fct e r m i n a lo fm e s o p h i l i cc o l ds h o c kp r o t e i ni sr e p t u r e d , s u s e q u e n t l y l 3 s h e e to fnt e r m i n a l t h e nw ee x p l o r e dt h ei n t e r i o rf o r c et h a td e t e r m i n e t h eu n f o l d i n gp r o c e s s 3 u s i n gs t e e r e dm o l e c u l a rd y n a m i c si nc o n s t a n tv e l o c i t ya n dc o n s t a n tf o r c e ，w e e x p l o r e dt h es i m i l a r i t i e sa n dd i f f e r e n c e si nt h ef o r c e du n f o l d i n go ft h e r m o p h i l i ca n d m e s o p h i l i cc o l ds h o c kp r o t e i n s t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ep r o t e i n sf o l l o ws a m e u n f o l d i n gp r o c e s s ，i nt h ec o u r s eo fc o n s t a n tv e l o c i t yu n f o l d i n g ，t h ect e r m i n a li s r e p t u r e da tf i r s t ，s u s e q u e n t l ynt e r m i n a l b u tt h em e s t p h i l i cc o l ds h o c kp r o t e i nn e e da b i g g e rf o r c ei nt h eb e g i n n i n g w i t h c o n t i n u i n g a d v a n c e si nb o t h c o m p u t e r s a n d a l g o r i t h m s ，c o m p u t e r s i m u l a t i o n sw i l lp l a ya ne v e nm o r ei m p o r t a n tr o l ef o r u n d e r s t a n d i n go fp r o t e i n f o l d i n g u n f o l d i n ga n df u n c t i o n a lm o t i o n si nt h ef u t u r e k e y w o r d s ：d y n a m i c ss i m u l a t i o n ；u n f o l d i n g ；n a m d i v 关于学位论文独立完成和内容创新的声明 本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明：所呈交的学住论文是 本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除 文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学住或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 学住申请人( 学位论文作者) 签名： 狸 兰 涵 2 0p 年石月肜目 关于学位论文著作权使用授权书 本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者，本人完全 了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家 图书馆、科研信，包机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文( 甄质文 本和电子文本) 以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校 学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手 段保存、汇编学位论文( 纸质文本和电子文本) 。 ( 涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书) 、 i 学位获得者( 学位论文作者) 签名： 耸殳 圭 翌 2 0l o 年乞兔，毛b 学住论文指导教师签名：趟亟 2 0 1 年a ，6 甚 河南大学2 0 1 0 屑硕十学位论文 1 1 引言 第一章绪论 蛋白质所具有的功能在很大程度上取决于蛋白质的空间结构，因此对蛋白质 结构的研究在蛋白质工程中具有极其重要的意义。早在1 9 5 9 年c b a n f i n s e n 在进 化的分子基础一书中写道“蛋白质化学家很自然的想到理解细胞行为最可能的 方式在于研究蛋白质分了结构和功能的关系”。 生物体内基本上所有的生理活动都是通过蛋白质来实现的。蛋白质分了参与 了生物体内细胞的构建和酶的催化反应，也参与细胞间信号传导、免疫反应、基 因表达等生理过程【l 刃。x 射线晶体衍射方法是目前为止研究蛋白质结构最为理想 的方法。目前蛋白质结构数据库的蛋白质结构信息扩展了人们对蛋白质功能的了 解，为基于受体三维结构的合理药物设计奠定了很好的基础。然而，所有生物大 分子在生理状态下都是动态的【3 1 ，蛋白质分子也是动态的与其他生物大分子相互 作用而发挥其功能。蛋白质的构象变化，小到局部残基侧链的位置变化，大到整 个结构域的运动，时间从飞秒到毫秒甚至秒，有很大的波动范围。因此研究蛋白 质的动态性质，对于进一步认识蛋白质的结构功能关系以及对生命过程的了解和 调控具有很大的现实意义。 蛋白质新生肽链的折叠是一个历史不久的研究课题，但是蛋白质的变性却是 一个古老的话题。从蛋白质研究的初期就对蛋白质变性给予了高度的重视，因为 在分离纯化蛋白质时，经常会遇到蛋白质的沉淀，这就是变性的结果。中国著名 学者吴宪在2 0 世纪2 0 年度末，提出了有关蛋白质变性的重要论述。1 9 9 5 年，美 国蛋白质化学家e d s a l l 还专门在蛋白质化学进展这套丛书中发表文章，回顾 和介绍吴宪对蛋白质变性研究所做出的贡献。蛋白质变性的研究和积累的成果， 对于开展蛋白质新生肽链的折叠研究是非常有用的，因为蛋白质的变性与肽链的 折叠在一定程度上可以理解为是一个可逆的过程【4 】。 河南人学2 0 1 0 届硕十学位论文 根据蛋白质的中心法则我们知道，生命体的d n a 遗传密码决定了蛋白质的 结构，蛋白质的结构决定了蛋白质的功能。因此对蛋白质结构的预测有着极为重 要的意义，目前对蛋白质结构预测的方法主要有对二级结构的c h o u - f a s m a n 方法 和对蛋白质三级结构的预测方法同源建模法，c h o u - f a s m a n 方法主要通过研究单个 残基出现在特定二级结构的几率进行统计，得出一个二级结构倾向性因子，来对 蛋白质的二级结构进行预测。同源建模法主要依据同源蛋白质具有相似的结构进 行预测，首先根据结构已知的同源蛋白建立要预测蛋白质的结构，然后对建立的 结构进行优化，得到目标蛋白质的结构。 在生物体内蛋白质的合成过程中，蛋白质的折叠是一个动态的过程，目前我 们尚缺少对蛋白质折叠过程的认识。而分予动力学模拟正好可以对一些生命的微 观过程进行动态的模拟，因为蛋白质的变性与肽链的折叠在一定程度上可以理解 为是一个可逆的过程，并且蛋白质的去折叠过程我们可以通过变性剂加速实现， 因此对蛋白质去折叠的研究可以深化我们对蛋白质折叠过程的认识，分子动力学 模拟在进行去折叠的动力学模拟过程中，更是可以从原子尺度上展现了蛋白质的 去折叠过程【5 - l o l ，因此拥有比试验方法更加直观的优势。 在研究蛋白质的动态性质时，有两种常用的模拟方法：一种是蒙特卡罗随机 模拟方法【l l 】，另一种是分子动力学模拟方法 1 2 1 。m o n t ec a r l o 方法随机的产生构 象并用一套标准来确定是否接受这一构想，这一标准确保体系处于低能构象，这 一方法在探讨蛋白质的动态性质时发挥了重要作用。分子动力学方法与m o n t e c a r l o 随机取样方法不同，它是随时间演化的，通过牛顿力学方程再现分子体系的 时间演化轨迹。如果模拟时间足够长、取样足够充分，上述方法模拟的结果还可 以统计的用来描述分子体系的热力学性质。两种方法在过去的几十年中都得到了 很好的发展，其中分予动力学方法在研究生物大分子体系的动态性质时更是发挥 了重要的作用。 任何生命体的生存都要首先适应所居住的环境，任何剧烈的环境变化对生命 体来讲都是致命的 1 3 1 ，目前人们对生命体冷休克的认识才刚刚开始，通过研究， 2 河南人学2 0 1 0 届硕士学何沦文 人们发现，生命体对冷的适应一般有三种方法【1 4 2 1 1 ，首先是改变体液中盐的浓度 来降低体液的凝固点；第二种方法是抗冻蛋白，它可以和冰的晶面相互作用，从 而阻止冰晶在a 轴和c 轴的生长【1 6 2 0 2 2 1 ，从而起到对有机体的保护作用；第三种 办法就是冷休克蛋白，蛋白质在温度降低的情况下，蛋白质的活性相应会受到影 响，会减缓遗传密码的转录和蛋白质的翻译，从而影响生命体的生存能力，而冷 休克蛋白的存在可以促进遗传密码的转录和蛋白质的翻译过程，从而增强生命体 的适应能力。 冷休克蛋白不仅在生命体的低温适应能力方面发挥着重要的作用，目前冷休 克蛋白在化工，食品，医疗，美容等很多方面都发挥着越来越重要的作用，通过 蛋白质工程我们可以通过基因工程产生性能更加稳定、活性更强的冷休克蛋白， 从而可以产生巨大的经济效益，因此现在已经成为实验和理论研究的重要领域 2 3 - 2 8 o 本论文的主要研究内容就是对冷休克蛋白进行分子动力学模拟，研究蛋白质 在外力作用下的去折叠过程，从而加深我们对冷休克蛋白质折叠的认识，同时由 于冷休克蛋白具有典型的五股反平行口桶结构，因此可以充当一个很好的模型系 统【2 9 - 3 0 1 ，可以通过蛋白质内部的相互作用力对去折叠过程的影响，研究冷休克蛋 白的结构对蛋白质稳定性的影响，加深人们对冷休克蛋白质的认识，从而对基于 冷休克蛋白的蛋白质工程提供一定的帮助。 本论文的部分内容就是通过常规分子动力学模拟以及由其衍生的一些计算方 法来探讨生物大分子冷休克蛋白的动态性质。下面我就分子动力学的基本原理、 力场和算法的发展，分子动力学中常用的模拟策略和技巧以及蛋白质的相关理论 等做一论述。 1 2 冷休克蛋白的研究现状 从原核生物到真核生物，所有的生命体都已经形成了不同的对温度变化的适 河南人学2 0 1 0 届硕士学位论文 应机制。冷适应机制主要发生在细胞膜这一层次上。冷休克可以影响细胞膜的构 成并且有机体可以使膜功能保持在最佳状态。冷休克也能影响到细胞的分裂。温 度的下降会导致生长变的迟缓。在生命体生长迟缓期间，生命体能够改变细胞膜 的构成并且可以合成一系列的蛋白质即冷休克蛋白质。 对冷适应机制的研究开始于上世纪6 0 年代末，对于所有的生命体而言，高度 可调的生理事件起源于对寒冷的适应【3 1 。3 5 1 。例如，有些鱼可以在海水的冰点温度 ( 1 9 ) 生活。生活在南极的鱼的血液的冰点在2 0 到2 1 之间。这些不同 寻常的冰点在很大程度上是由于血液中高浓度氯化钠的存在，部分程度上归因于 抗冻蛋白( a f g p ) 的存在 3 昏37 1 。近年来，随着对冷适应机制的广泛研究，一组在低 温下能够被诱导合成的蛋白已经在化学上得到确认，称之为冷休克蛋白。 冷休克蛋白是微生物在适应低温生长条件下，细胞诱导合成的一系列分子量 为7 k u 左右的蛋白质，它们绑定单链r n a 和d n a 并且在细胞数个生理过程中起 着重要作用，小分子冷休克蛋白都存在5 个反平行b 折叠的b 桶状片层结构。它 们的主要功能是作为r n a 分了伴侣与m r n a 结合，阻止m r n a 二级结构的形成， 促进蛋白质的翻译【3 8 4 1 1 。 温度的降低要求生命体做出合适的应答，通过对冷休克过程的研究，发现在 生命体中存在着多种冷休克蛋白，它们分别在不同的温度范围能够得到有效地合 成并且在不同的温度范围内发挥自己的作用，我们可以将其称为嗜热冷休克蛋白， 嗜温冷休克蛋白和晴寒冷休克蛋白，而通过蛋白质结构的研究能够加深我们对蛋 白质功能的认识。 对蛋白质折叠和去折叠机制的理解，以及蛋白质结构稳定性的研究已经成为 实验和理论研究的主要内容。对于这种研究，冷休克蛋白可以充当一个很好的模 型，来自于嗜热的芽孢杆菌( b c c s p ) 和嗜温枯草杆菌( b s c s p ) 的冷休克蛋白已 经被发现拥有一个可逆两态折叠，这两个蛋白6 6 个残基中有1 1 个残基不同，并 且它们的三维结构具有高度的相似性，都具有一个五股反平行b 桶。但是嗜热蛋 白的去折叠过程比嗜温蛋白要慢2 0 倍，这两个蛋白的明显区别在于它们的折叠稳 4 河南人学2 0 1 0 届硕十学位论文 定性，它们的熔化温度分别是7 7 和5 4 。通过突变研究发现蛋白质的表面电荷， 特别是残基3 ，被发现在蛋白质的稳定性方面扮演着重要的角色【4 2 4 6 1 。 分子动力学模拟可以提供蛋白质折叠和去折叠的真实过程而得到广泛的应 用。目前通过对蛋白质在高温下去折叠过程的研究，已经发现b c c s p 和b s c s p 在高温下具有相同的去折叠过程，但是b c c s p 的去折叠过程更加缓慢。嗜热冷休 克蛋白缓慢的去折叠过程可以归因于a r g 3 和g l u - 4 6 ，g l u 2 1 以及c 端所形成的 离子对，这些离子对的形成提升了嗜热冷休克蛋白的稳定性【4 7 5 1 】。 为了揭示b c c s p 和b s c s p 不同的折叠稳定性的根源，p e r l 和s c h m i d 3 l 】研究 了1 1 个氨基酸残基的替代效应，通过对两个蛋白质进行单个残基和多残基的替代 发现，b c c s p 和b s c s p 不同的稳定性在很大程度上归因于三个位置的残基：3 ， 4 6 和6 6 。替代的效应可以由静电力计算结果进行定量的解释。p e r le ta 1 通过研究 1 1 个替代残基对于折叠和去折叠速率的影响，也发现这两种蛋白的区别源于这三 个位置的残基。 通过目前的研究进展，我们已经发现冷休克蛋白的功能在很大程度上取决于 蛋白质内部的静电相互作用力，特别是位于3 ，2 1 ，4 6 这三个位置的残基。蛋白 质内部的静电相互作用在蛋白质稳定性方面也发挥着重要的作用。 1 3 基本理论 分了动力学方法最早是f l j a l d e r 和w a i n w r i g h t 两个人在2 0 世纪5 0 年代末提出来 的【5 2 】。虽然当时的模拟非常简单，只是研究两个模型硬球在相互作用下的运动状 况，但是它给人们带来了全新的研究观点。通过几代科学家的努力，分子动力学 模拟和产生之初相比已经有了质的飞跃。 分子动力学方法的发展和应用是和分子动力学本身力场、算法的发展以及计 算机的发展和应用分不开的。在计算机技术飞速发展的今天，分予动力学在生物 大分子动态模拟中的应用越来越广，研究的体系越来越大，在模拟时考虑水溶液 河南大学2 0 1 0 届硕士学位论文 环境、膜环境等更接近生物体系的真实环境。超级计算机已经并将继续在计算生 物学领域得到广泛应用。许多适合生物大分子计算的分子动力学程序和力场的发 展( 如a m b 一5 3 ，5 4 1 ，c h a 册m 5 5 - 5 7 1 ，g r o m a c s 5 s , 5 9 j 和g r o m o s t 6 0 1 等) 已趋于成熟。 1 3 1 分子动力学基本原理 在所有模拟蛋白质运动的方法当中，分子动力学方法是最受欢迎的【6 ，分子 动力学属于经典力学的范畴，是在分子力学的基础上描述分子运动的一种方法。 按照量了力学理论，一个分子体系及其动力学特征可以用时间依赖的牛顿运动方 程或薛定谔方程表示，能量是由每个粒了的动能项和各粒子之间相互作用的势能 项组成。对于成百上千个原子的生物大分子体系，目前还不能有效的处理电子的 运动。更进一步的简化是把复杂的分子体系看作是在有效势场中质点的运动，所 有的电子的运动及电了运动对核运动的影响都被忽略。这样就可以用经典力学来 描述每个原予的运动【6 2 1 。 分子动力学模拟都是利用牛顿力学的基本原理，通过求解运动方程得到所有 原子的轨迹，并从轨迹中计算得到各种性质。对于含有n 个原予的体系，每个原 予的运动规律符合牛顿运动方程： f = 聊雳= 一导u ，。幻，( i ，乏，死) ， f = 1 ，2 ， ( 1 1 ) o r ： j?j 其中，只是原子f 所受到的力，m ，是原予i 的质量，i 是原子i 的加速度，f 是原 子i 的位移矢量。原子所受的力可由分子力学势能函数”的负梯度求得： t = 一型掣( 1 2 ) u i i 在直角坐标系中，e 和n 可用它的三个分量来表示。以x 方向为例，将t 时刻粒 子i 在x 方向的坐标进行t a y l o r 展开，得到以下两个方程( 一个向前、一个向后) ： 6 河南人学2 0 1 0 届硕十学位论文 x i q + a t ) = x i ( t ) + v i ( t ) a t + a i _ ( t ) a t 2 2 + b i ( t ) a t 2 6 + ( 1 3 ) 誓一a t ) = x i q ) 一v i ( t ) a t + a , ( t ) a t 2 2 一b i ( t ) a t 2 6 + ( 1 4 ) 这里x i ( o 、v i ( t ) 、a i ( f ) 和b i ( t ) 分别是t 时刻原予f 在x 方向上的位置、速度、加速 度和x 对t 的三阶导数。 将式( 1 3 ) 和( 1 4 ) 分别相加与相减后可得到 x to + ) = 2 x f ) 一x i0 一a t ) + a i ( t ) a t 2 ( 1 5 ) v f ( f ) = x f ( f + f ) 一x f ( f a t ) 2 a t ( 1 6 ) 在t 及f 一出时刻第f 个原子的位置是知道的，加速度可以从势能函数的负梯 度求出： 铲跏，一掣夕， 7 ， o r ； 所以以后任何时刻原子的位置、速度和加速度都可以迭代求解。这就是计算牛顿 运动方程的v e r l e t 蛙跳方法。( 1 5 ) 式称为v e r l e t 方程 6 3 】。对高阶项的不同处理 方式涉及到算法问题。 从上面的一系列方程我们可以概括一下分了动力学的基本流程： 1 给出体系所以粒了的初始坐标i ( f ) 和速度v i ( t ) 。这里v i ( t ) 通常都是按照体系 的初始温度根据波尔兹曼分布赋值。 2 采用特定的力场参数和能量评价函数，从i ( f ) 得到体系的势函数，由此计算每 个粒子所受到的力f ( t ) 。通常这一步的计算占据整个积分步骤的9 0 的时间 3 运用牛顿运动方程，由弓( f ) ，v i ( t ) 积分计算亏o + a t ) ，e o + a t ) 。这里涉及数 值积分的计算方法问题，选择合适的数值积分计算方法是动力学计算方法效率 的决定因素。 4 用弓( f + a t ) ，v i ( t + f ) 作为输入，再计算下一步的i ( f ) ，谚( f ) 。不断重复步骤 河南人学2 0 1 0 届硕士学位论文 ( 2 ) - ( 4 ) 。 就上述实现分子动力学模拟的基本流程来看，分予动力学方法有几个重要的 因素。首先分子体系的势函数是用特定力场参数和能量评价函数来计算的。分子 动力学模拟方法把分了体系看作是质点在势能面中的运动【6 4 , 6 5 】。由于每个分支体 系真实的势函数是非常复杂的，难以精确描述，为了实用，往往选用某些原了坐 标相关的函数对势能面进行拟合，得到势能面的近似解析表示。这种势能面的表 示方法称为力场，而这组与坐标相关的能量评价函数称为势函数。在此基础上 ( 3 2 ) 方程中的函数【，就有了解析表达，从而整个运动方程就可以求解了。既然 力场参数和势函数是半经验的，采用什么样的力场参数和能量评价函数将对分子 动力学的精度产生重大的影响。其次，三个粒予以上的分子体系的牛顿第一运动 方程积分计算没有解析解，必须通过数值计算方法来解析。不同的数值计算方法 的选择不仅会影响方法的效率，而且会影响计算的精度。 分子动力学方法的威力在于它可以跨过较大的能垒，在稳度t 时，每一个自 由度可跨越如7 的能垒，因此可以通过升温来搜索更大的构象空间。高温下整体 能量和势能波动较大，意味着较大的构象变化，当总能量中出现最小点后，系统 将在常温( 3 0 0 k ) 下平衡，这样便可以获得低能量构象。分子动力学与简单的能 量优化相比，能更有效的表现生物大分子的动态行为。 所有的生物大分予在溶液中都是动态的，具有结构柔性，而且在表现其生物 功能的时候都会发生构象变化，d , n 局部的残基侧链的位置变化，大到整个功能 域的运动。了解生物大分子的动态性质对了解生物大分予的构象关系以及基于构 象关系上的研究( 例如基于结构的药物设计) 非常重要。目前核磁共振方法( n m r ) 和x 射线方法能够在一定条件和范围内提供分子的动态结构信息，使人们能够在 原子水平上更精细的了解生物大分子。2 0 0 2 年的化学诺贝尔奖就授予了在n m r 技术上作出杰出贡献的科学家维特里希；2 0 0 3 年的化学诺贝尔奖则授予用x 射 线测定离子通道结构的科学家麦金农。但是，试验有严格的实验条件限制，n m r 测定的局限性在于只能测定分子量小于3 0 k d 的蛋白，而对于很多跨膜蛋白，它 g 河南人学2 0 1 0 届硕十学位论文 的结晶很困难，晶体结构很难得到。因此，计算机模拟具有不可替代的作用，而 且通过应用计算机进行分子动力学模拟可以了解生物体系内的一些重要动态过 程。例如，从探讨蛋白质的结构稳定性，到蛋白质在特定条件下的构象变化，从 蛋白质的折叠去折叠过程到受体配体之间的识别机制，分予动力学都发挥了重 要的作用。使用大型计算机进行生物大分子的分子动力学模拟已经在计算生物学 领域得到了广泛的运用。 研究蛋白质的去折叠过程常用的拉伸方法有原子力显微镜和光镊【6 6 ，6 7 1 ，但是 这些方法都不能观测到蛋白质去折叠的微观过程，作为一种强有力的工具，s t e e r e d m o l e c u l a rd y n a m i cs i m u l a t i o n 不仅可以进行多种生物大分子的拉伸模拟，还可以 提供拉伸过程中的原子水平上的微观细节 6 8 7 1 1 ，这是任何实验方法都难以实现的。 基于分了动力学的这些优势，本论文主要使用分子动力学模拟的方法对冷休克蛋 白进行拉伸模拟，研究冷休克蛋白质在不同的外力作用下的去折叠过程，从而加 深我们对冷休克蛋白质折叠的认识。 1 3 2 蛋白质的结构 十九世纪中期，荷兰化学家g e r a r d u sm u l d e r 从动物组织和植物体液中提取一 种共同的物质，他认为，这种物质在有机界的一切物质中无疑是最重要的，缺少 它我们这个星球上的生命就可能不存在。根据著名瑞典科学家b e r z e l i u s 的提议， m u l d e r 将这种物质命名为蛋白质( 蛋白质p r o t e i n 来自希腊语p r o t e i n s ，意指“第 一重要的) 。同时m u l d e r 还把这种称为蛋白质的物质归结为一个特定的化学式 ( c 4 0 h 6 ：0 ，2 ) 。他的这个化学式从蛋白质化学来说当然是错误的，但认为有一类 对活的有机体所必不可少的物质存在，从这一点上来说却是j f 确的。因此蛋白质 一词一直使用下来。 蛋白质是细胞内含量最高的部分。酶，抗体，多肽激素，运输分子乃至细胞 的自身骨架都是由蛋白质构成。蛋白质是结构和功能上形式种类最多，也是最活 9 河南丈学2 0 1 0 届硕士学位论文 跃的一类分子，它是生命体系的支柱，几乎在一切生命过程中都起着关键作用。 蛋白质是一种信息大分子，由染色体上核苷酸碱基顺序所编码的遗传信息最终是 通过蛋白质来体现的。从本质上来说，蛋白质是一类具有很强专一特性的复杂大 分子，每种蛋白质在体现细胞内协调一致的活性中扮演着各自特定的角色。它们 互相配合共同来拆建分予，摄取能量，抵御外敌，充当传递系统并且甚至去合成 遗传器本身。组建蛋白质分予的最基本的结构单元，就是所谓的氨基酸。 图i l 氨基酸的结构 图ii 表示的是单个氨基酸的结构，其中间具有四面体结构的碳原子为伍碳原 子，它以共价键在一侧与氨基( n h 2 ) 相连，另一侧与羧基( c o o h ) 相连，与 它的第三根键相连的是氢原子，而与第四根键相连的是一个可变的侧链r ，r 的 不同决定氨基酸的不同。自然界存在2 0 种不同的氨基酸。氨基酸依靠肽键而彼此 连接，肽键的形式由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基之间脱去一个水分 予形成( 脱水缩合) 。肽键( c o - n h - ) 具有一部分坝键的性质，其结果导致构 成肽键的原子处在一个平面上，称为酰胺平面。任何数目，不同顺序种类的氨基 酸都能以这种方式连接成一条多肽( 如图12 ) ，此多肽链的序列构成蛋白质的一 级结构，即氨基酸种类的同步排列信息。 。剃一 图12 多肽链的结构 河南人学2 0 1 0 届硕士学位论文 多肽链并非是一个线性的高分子结构，靠着酰胺平面连接在q 碳原子上的单 键的转动在三维空间形成扭曲，折叠的特殊结构，首先局部的氨基酸会形成不同 的二级结构，二级结构是肽链内部形成的局部的周期性结构，如q 螺旋和b 折叠 ( 图13 ) 。在二级结构内部，不同的氨基酸的原子之间交替的形成规则的氢键网 络，以维持此周期性结构的能量平衡。整个蛋白质分子的空间构象就是由这些不 同种类的二二级结构通过一些较为无规的多肽片段形成的转角( t u r n ) 或者环结构 ( l o o p ) 相连而在三维空间构成的稳定而紧密的聚集【4 j 。 图1 4 蛋白质的四级结构( 血红素蛋白) 河南人学2 0 1 0 届硕十学位论文 最后，不同的蛋白质亚基以及结构单体形成一个功能性聚集的高度有序的排 布，称为蛋白质的四级结构( 图1 4 ) 。 1 3 3 蛋白质分子内部的相互作用 天然态的球蛋白的形状接近于球形或椭球形，其疏水的氨基酸残基一般位于 分子内部，而亲水的残基在外部。稳定蛋白质三维结构的作用力主要是一些弱相 互作用或称非共价键，包括氢键，范德华力，疏水作用和静电作用( 图1 5 ) 。此 外共价二硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起着重要的作用。蛋白质的高级结 构是各种相互作用力协同作用的结果。同时，这些相互作用力也是蛋白质结构转 换的主要驱动力。 麓：芦? ) ，o 、- v k 夕， 国l ? j 荤、o r 摭j 辩 , t 1 1 2 0 i 0 一w 1 ， l c r 嚣0 图1 5 维持蛋白质结构稳定的各种作用力：l 、静电作用力；2 、氢键；3 、疏 水作用；4 、范德瓦耳斯力；5 、二硫键 1 疏水作用 非极性分子或基团在水溶液中倾向于聚集以保持与水相接触最少的趋势，即 所谓的疏水性。使非极性分子或基团聚集在一起的力称为疏水相互作用。当疏水 化合物或基团进入水中时，它周围的水分子将排列成刚性的有序结构即所谓笼形 结构；在与此相反的过程中，排列有序的水分予被破坏，因此疏水作用是熵驱动 1 2 囝 3 ；， ) - p d 弋 伽 m m ，t 0 c c l 酚0 。 、囝 1h= 起c d，一l吨沁w 甜赫秘似 河南人学2 0 1 0 屑硕十学何论文 的自发过程【2 2 刃2 4 1 。在蛋白质分子内含有许多疏水基团，如丙氨酸、亮氨酸、苯 丙氨酸与色氨酸等残基上的侧链基团。球状蛋白质总是倾向于把疏水残基埋藏在 分了的内部，蛋白质结构的主要特征是疏水亲水间的平衡。蛋白质结构稳定在很 大程度上依赖于分子内的疏水作用。蛋白质受外界因素，如热、酸以及变性剂等 因素的影响时会发生构象变化，其疏水基团会暴露在溶剂中而导致分了间疏水聚 集。 2 静电作用 蛋白质分子中的酸性氨基酸残基电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基电离后 代j f 电荷。当蛋白质所带正负电荷相等时的p h 值称为该蛋白质的等电点。当溶 液p h 高于蛋白质的等电点时，蛋白质带净的负电荷；相反，蛋白质带净的正电 荷。随着溶液的p h 逐渐偏离等电点，蛋白质所带的净电荷逐