（分析化学专业论文）铜Ⅱ、锰Ⅱ等希夫碱金属配合物的合成及其dna生物传感器的研制.pdf

铜( i i ) 、锰( i i ) 等希夫碱金属配合物的合成及其d n a 生 物传感器的研制 摘要 本论文合成了6 种希夫碱类金属配合物，通过元素分析、红外光谱测定其结 构。利用电化学和荧光光谱的方法研究了这些配合物与鲑鱼精d n a 的作用机理， 确定了最佳反应条件。运用核酸杂交技术，用具有电化学活性的配合物作为指示 剂制备了d n a 电化学传感器，通过对电极表面s s d n a 的固定，制备成d n a 探 针，并将d n a 探针应用于靶序列d n a 片断的识别。论文共分为四个部分。 ( 1 ) 通过合成两种希夫碱配体，与过渡金属铜( i i ) 、钴( i i ) 、镍( i i ) 、 锰( i i ) 合成了6 种金属配合物，并通过元素分析和红外光谱对它们的结构进行 了表征。 ( 2 ) 选用配体l l 的铜( i i ) 的金属配合物，运用循环伏安法研究了l l c u l m h 与鲑鱼精d n a 的相互作用。实验结果表明，l l c u l m h 可以通过沟槽作用与d n a 结合，实验求得当r 3 1 4 时，m = 2 3 7 2 2 ，其化学平衡常数k 。= 3 8 0 x 1 0 9l 2 m o l ，结构式为 d n a ( l i c u l m h ) 2 。以l l c u l m h 为杂交指示剂，通过共价键合法进一步制备成d n a 生物传感器。该d n a 电化学传感器检测乙肝病毒的检测线性范围为2 0x1 0 一 8 1 x1 0 一m o l l ，检出限为5 9 3x1 0 m o l l ，( s n = 3 ) 。 ( 3 ) 选取配体l 2 的铜( i i ) 的金属配合物，并基于它与d n a 的相互作用 将其作为一种杂交指示剂制成了d n a 电化学传感器。用循环伏安法研究了 c u 2 ( l 2 ) 2 与d n a 在玻碳电极( g c e ) 表面的相互作用，实验表明其作用模式主要是 沟槽作用。通过对互补链d n a 、碱基错配d n a 与探针d n a 的杂交信号在结合 指示剂后微分脉冲伏安行为的比较，说明指示剂有良好的选择性。测定了d n a 电化学传感器检测乙肝病毒( h b v ) 的检测线性范围为8 0 7 l o 9 5 0 1 1 0 。 m o l l ，检出限为7 4 6x1 0 _ um o l l _ ( s n = 3 ) 。 ( 4 ) 通过循环伏安法和荧光分析法研究了m n 2 ( l 2 ) 2 与d n a 相互作用，结果 表明m n z ( l 2 ) 2 以嵌插结合的方式与d n a 结合。用带有羧酸基团的多壁碳纳米管 ( m w n t s c o o h ) 修饰玻碳电极，将57 端氨基修饰的核苷酸通过羧基共价固定 在碳纳米管上，电活性的m n 2 ( l 2 ) 2 作为杂交指示剂，制备了一种新颖、灵敏的 d n a 电化学传感器。该传感器检测互补的s s d n a 的线性范围为6 7 1 0 。o 8 4 1 0 一m o l l ，检出限是1 4 0 1 0 一um o l l _ ( s n = 3 ) 。与把核苷酸直接固定在玻碳 电极上的d n a 电化学传感器相比，该传感器具有更高的灵敏度和更低的检出限。 关键词：希夫碱金属配合物：电化学；d n a 生物传感器：多壁碳纳米管 h s t u d yo ns y n t h e s i so fs c h i f fb a s e c o p p e r ( i i ) a n d m a n g a n e s e ( i i ) c o m p l e x e s a ndd n a e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r a bs t r a c t i nt h i sa r t i c l e ，s i xk i n d so fs c h i f fb a s em e t a lc o m p l e x e sw e r es y n t h e s i z e d ，w h o s e s t r u c t u r e sw e r ec h a r a c t e r i z e du s i n gi n f r a r e d ( i r ) a n de l e m e n t a la n a l y s i s ( e a ) m e t h o d s e l e c t r o c h e m i c a la n df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yt e c h n i q u e sw e r eu s e dt os t u d yt h e o p t i m i z a t i o n c o n d i t i o n sf o r t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e s e c o m p o u n d s a n d d o u b l e s t r a n d e ds a l m o ns p e r md n at o t h e s es e n s o r sw e r ep r e p a r e db yi m m o b i l i z i n g s i n g l e s t r a n d e d d n ap r o b e so ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e s ( g c e s ) w i t hm e t a l c o m p l e x e sa se l e c t r o a c t i v ei n d i c a t o r st om e a s u r et h eh y b r i d i z a t i o ne v e n t sb e t w e e nt h e d n a p r o b e sa n dt h e i rc o m p l e m e n t a r yd n af r a g m e n t s t h i sd i s s e r t a t i o nc o m p r i s e sb y f o u rp a r t sb e s i d e st h ep r e f a c e ( 1 ) t w ok i n d so fs c h i f fb a s el i g a n d sa n di t ss i xo fm e t a lc o m p l e x e sc o p p e r ( i t ) ， c o b a l t ( i i ) ，n i c k e l ( i i ) a n dm a n g a n e s e ( i i ) w e r es y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e du s i n g e l e m e n t a la n a l y s i sa n di rs p e c t r a ( 2 ) t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ec o m p l e xo fl ic u l m h ( l l ：p o t a s s i u m ( e ) - 2 ( 2 ，4 - d i h y d r o x y b e n z y l i d e n e a m i n o ) p r o p a n o a t e ，a b b r e v i a t e db yl i ) a n d d o u b l e s t r a n d e ds a l m o ns p e r md n aw a ss t u d i e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) i tw a ss h o w n t h a tt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nl ic u l m ha n dd n a i s g r o o v eb i n d i n gm o d e a n dt h e b i n d i n gs t o i c h i o m e t r y ( m ) a n dt h eb i n d i n gc o n s t a n t ( k a ) w e r ea l s oc a l c u l a t e d w h e n r 3 1 4 ，m - 2 3 7 2 2 ，k a = 3 8 0 x1 0 9l 2 m o l ，t h e c o m p l e xi sd n a - ( l ic u l m h ) 2 ，u s i n gl ic u l m ha san o v e le l e c t r o a c t i v ei n d i c a t o r ，a d n ae l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rb a s e do ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ew i t hc o v a l e n t l y i m m o b i l i z e dp r o b es s d n aw a sc o n d u c t e d t h et a r g e ts s d n ac o u l db eq u a n t i f i e di na r a n g ef r o m9 8 1 0 9m 0 1 l 。1t o2 0 1 0 7m 0 1 l 1w i t had e t e c t i o nl i m i to f1 1 5 1 0 一m 0 1 l 一 ( 3 ) u s i n gt h ec o m p l e xo fc u 2 ( l 2 ) 2 ( l 2 ：s o d i u m ( e ) 一3 - ( ( 1 c a r b o x y e t h y l i m i n o ) m e t h y l ) - 4 h y d r o x y b e n z e n e s u l f o n a t e ，a b b r e v i a t e db yl 2 ) a se l e c t r o a c t i v ei n d i c a t o r s ，a l l e l e c t r o c h e m i c a ld n ab i o s e n s o rw a sd e v e l o p e d i t si n t e r a c t i o nw i t hd o u b l e s t r a n d e d s a l m o ns p e r md n a ( d s d n a ) w a ss t u d i e db ye l e c t r o c h e m i c a le x p e r i m e n t sa tg c e s u r f a c e i tw a sr e v e a l e dt h a tc u 2 ( l 2 ) 2c o u l db i n dw i t hs a l m o ns p e r md n as t r a n d s m a i n l yb yg r o o v em o d e t h ed i f f e r e n c eo fi t se l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s e sb e t w e e n h y b r i d i z e dd s d n ad u p l e xa n dp r o b ed n aw a se x p l o r e dt oa s s e s st h es e l e c t i v i t yo ft h e d e v e l o p e de l e c t r o c h e m i c a ld n a b i o s e n s o r t h ec o m p l e m e n t a r yt a r g e ts s d n ac o u l d b eq u a n t i f i e do v e rt h er a n g ef r o m8 0 7 10 。9m 0 1 l 1t o5 01 10 。7m 0 1 l 。1w i t ha d e t e c t i o nl i m i to f7 4 6 10 1 0m 0 1 l 1f s n = 3 ) ( 4 ) c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yw e r eu s e dt ot h e i n t e r a c t i o no fm n 2 ( l 2 ) 2w i t hd o u b l e - s t r a n d e ds a l m o ns p e r md n a i tw a ss h o w nt h a t t h ei n t e r a c t i o nm o d eb e t w e e nm n 2 ( l 2 ) 2a n dd n ai si n t e r c a l a t i o n ，u s i n gm n 2 ( l 2 ) 2a sa n o v e le l e c t r o a c t i v ei n d i c a t o r ，an o v e la n ds e n s i t i v ed n ae l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rw a s c o n d u c t e d ，w h i c hw a sb a s e do nm u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e sf u n c t i o n a l i z e dw i t h c a r b o x y lg r o u p s ，m w c n t s - c o o h ，f o rc o v a l e n tp r o b es s d n ai m m o b i l i z a t i o n t h e t a r g e ts s d n ac o u l db eq u a n t i f i e di nar a n g ef r o m6 7 1 0 。1 0m o l l 。lt o 8 4 1 0 9 m o l l 1w i t hg o o dl i n e a r i t ya n dad e t e c t i o nl i m i to f1 4 0 10 一m o l l c o m p a r e dt o d n ae l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r sw i t hs s d n ad i r e c t l ym o d i f i e do ng l a s s yc a r b o n e l e c t r o d e s ，t h i sc a r b o nn a n o t u b e b a s e da s s a yd r a m a t i c a l l yi n c r e a s e dt h ed e t e c t i o n s e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y k e yw o r d s ：s c h i f fb a s em e t a lc o m p l e x e s ；e l e c t r o c h e m i c a l ；d n ab i o s e n s o r ； m w c n l l s c o o h 铜( i i ) 、锰( i i ) 等希夫碱金属配合物的合成及其d n a 生物传感器的研制 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人己用于其他学位申请的 论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名：趣散 日期： 、叫年 夕月。厂日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解青岛科技大学有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或 使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科 技大学。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密喵。 ( 请在以上方框内打“、”) 本人签名：也幽k日期：、坼年月 f 厂日 导师签名：坪绷 日期： 乞q 年 z 月 伊日 i j 青岛科技大学研究生学位论文 第一章前言 生物传感器以具有分子识别作用的生物体成分( 酶、微生物、动植物组织切片、 抗原和抗体、核酸) 或生物体本身( 细胞、细胞器、组织) 作为敏感元件，与被分析物 产生高度选择性生物亲和或生物催化反应产生的各种物理、化学变化被转换元件捕 获，进而实现将生物学信息转换为可识别和测量的电信号【ij 。d n a 生物传感器是分 子生物学与微电子学、电化学、光学等相结合的产物，它在生命科学与信息科学之 间架起了一道桥梁，成为d n a 信息分析检测最重要的技术之一。d n a 生物传感器 乃至基因芯片的出现使对目标d n a 的测量时间大大缩短，操作简单、便捷，无污 染，既可定性，又可定量，且灵敏度高、选择性好，显示出十分诱人的发展前景。 1 1d n a 电化学传感器的概述 1 1 1d n a 电化学传感器 根据不同的基础传感器件，生物传感器可分为6 大类型【2 】：电化学生物传感器、 介体生物传感器、热生物传感器、压电晶体生物传感器、半导体生物传感器和光生 物传感器。其中，电化学传感器具有快速、灵敏和价廉等优点，是目前传感器中最 成熟的一种，在生化传感器研发及其商业化领域中处于重要地位，该传感器种类繁 多，可广泛应用于医疗保健、食品工业、农业、环境等领域。根据生物传感器中生 物分子识别元件上敏感物质的不同，电化学生物传感器可分为酶传感器、免疫传感 器、电化学d n a 传感器等。 白1 9 9 3 年，m i l l a n 和m i k k e l s e n 【3 】首次描述电化学dna 传感器以来，该领域 受到了广泛关注。这类传感器选择性好、种类多、测试费用低，同时具有测定简便、 快速、灵敏的特点。根据基底电极的类型不同，d n a 电化学传感器可分为两大类： 第一类为d n a 修饰汞电极，主要是悬汞电极( h m d e ) ：早期主要是采用d n a 修饰汞电极【4 1 。汞电极易得到新鲜、重现的电极表面，能方便地修饰d n a 。f o j t a 1 5 1 以悬汞电极为基底，根据超螺旋d n a 、线性d n a 和变性d n a 三者电化学信号的 差异，用吸附转移溶出伏安法对低于微克级的三种d n a 进行了检测。 第二类为d n a 修饰固体电极，包括金电极和各种碳电极，如玻碳电极( g c e ) ， 碳糊电极( c p e ) 、裂解石墨电极( p g e ) 、定向裂解石墨电极( h o p g e ) 、碳条电极( c s e ) 等。 另外，新兴的纳米技术同样给d n a 的电化学检测提供了丰富的发展空间，如 碳纳米管【6 1 、纳米金属颗粒【6 ，7 】与电极技术相结合用于特定序列d n a 的检测。h u i p 等【8 】结合纳米技术与电化学阻抗技术，对一条含1 8 碱基的特定序列d n a 进行检测， 铜( i i ) 、锰( i i ) 等希大碱金属配合物的合成及其d n a 生物传感器的研制 结果表明在3 7 3 7 0n m o l l 。范围内电极响应信号与纳米颗粒的含量成正比，且检 测限达到了1 n m o l l 。 1 1 2d n a 电化学传感器工作原理 d n a 生物传感器主要由两部分组成【9 】，即分子识别元件和换能器。识别器件主 要用来感知样品中是否含有待测物质，转换器则将识别器件感知的信号转化为可以 观察记录的信号。其设计原理是以敏感的元件为基底表面，固定一定量含十几到上 千个核苷酸的单链d n a ，通过d n a 分子杂交，对另条含有互补碱基序列的d n a 进行识别，将d n a 双链杂交信息通过不同的形式表达出来。而d n a 电化学生物传 感器的主要原理是以电极为换能器，将单链d n a 固定于电极表面，形成d n a 电化 学探针。由于探针d n a ( s s d n a ) 与其互补d n a 在杂交过程中有很强的序列选择 性，使得该d n a 修饰电极具有极强的分子识别能力。当d n a 探针分子与互补d n a 杂交后，杂交导致了电极表面结构的变化，这种变化通过电化学信号的改变加以识 别，从而达到检测的目的。 1 1 3d n a 电化学生物传感器的制备 d n a 电化学生物传感器的制备主要分以下四个步骤： 1 、单链d n a 的固定 d n a 探针在电极表面的固定首先要考虑实现其与电极的稳定连接和杂交活性的 保持，电化学d n a 传感器的性质，包括灵敏度和使用寿命等，很大程度上与探针d n a 的固定方法密切相关。为了把d n a 牢固连结在电极表面，往往需要借助有效的物 理或化学方法【1 0 】。就目前研究者所采用的d n a 固定方法而言，大致可以分为以下5 类： 吸附法 吸附法是将d n a 直接或恒电位吸附到电极表面，另外可以利用聚阳离子化合 物与d n a 的静电作用固定d n a 1 1 】。吸附型修饰电极要求修饰剂不溶或难溶于水， 易溶于醇、酮等有机溶剂，有机物最好熔点较低，并在所使用的电位范围内不发生 氧化还原反应，或只发生对溶液中待测物质的催化反应。 吸附法是一种最简单的d n a 固定方法，固定化速度快，不需要什么特殊的试 剂，也无须对核苷酸进行修饰衍生化。但是吸附固定的d n a 在高盐浓度的环境中 易从电极表面解脱，所以不宜在高盐浓度条件下使用。而且它是多点位的吸附甚至 d n a 可能平躺在支持物表面，因而d n a 固定化密度较小，并且多个作用点固定d n a 使d n a 片段运动自由度减小，在杂交反应中影响其与互补d n a 的杂交效率。 共价键合法 共价键合法一般分两步进行：首先是将传感器表面进行活化预处理，引入各种 所需的活性基团，如羧基、羟基、氨基等，或对核菅酸进行衍生，使其带上合适的 2 青岛科技大学研究生学位论文 功能性基团，随后用双官能试剂或偶联活化剂联结支持电极与衍生后的d n a 。共价 键合法可以提高探针的牢固度及耐用性。因为d n a 分子以一端固定，结构灵活， 有利于杂交反应的进行。 m i l l a n 等pj 研究发现，在氧化的玻碳电极表面，以一种水溶性的乙基( 3 二甲基 丙基) 碳二亚胺盐酸盐( e d c ) f i n 羟基磺基琥珀酰亚胺( n h s ) 作偶联活化剂， 变性的小牛胸t , 泉d n a ；n 多聚脱氧鸟苷酸多聚脱氧胞苷酸 p o l y ( d g ) p o l y ( d c ) 】片段通过 与活化的电极表面( o 酰基异脲) 形成磷酰胺键共价结合到电极表面，而未变性的 小牛胸 r d n a 和多聚脱氧酰苷酸多聚脱氧胸腺苷酸 p o l y ( d a ) p o l y ( d t ) 】则不能结合上 去。迸一步研究表明d n a 是通过d g 残基选择性的共价结合到电极表面，因此他们利 用末端脱氧核苷酸转移酶在脱氧核苷酸37 末端处用d g 残基s s d n a 共价结合到电极表 面。p a n g 等f 1 2j 发现由于位阻效应，小牛胸腺d n a 难于直接共价固定在氧化玻碳电极 表面；但是电极表面的活性中，1 1 , 由硅烷基化试剂延伸后可有效地固定小牛胸腺 d n a 。所以，玻碳、石墨电极氧化后直接固定d n a 时，多用g 为端基或氨基衍生的 d n a 片段【1 3 ，1 4 ，1 5 】。玻碳、石墨电极氧化后产生的羧基等含氧基团经还原剂还原，在 电极表面形成羟基，再与硅烷基化试剂反应，得到含有氨基或羧基的活性表面，使 活性中心有更大的运动自由度，有利于d n a 的固定。硅烷基化是一种相对成熟、应 用较多的d n a 共价固定方法。 共价键合法制备的d n a 修饰电极，得到稳定的修饰层，易进行分子杂交，但 由于电极表面活性位点少，表面合成又是异相反应，因而固定的d n a 量少，响应 信号较小。 自组装法 一般以金电极为基体电极，并在d n a 探针分子上导入硫醇基团，通过巯基可 自组装至电极表面【7 1 。另外，d n a 也可以通过修饰的巯基与金膜发生自组装过程【1 6 】 从而将探针固定于传感器的金膜电极表面，可构成结合牢固、排列有序、分布均匀 的单层d n a 分子膜。以自组装膜法得到的s s d n a 修饰电极表面高度有序，稳定性 也好，在适当的固定密度下，对互补d n a 有很高的杂交效率；它对巯基修饰的d n a 化合物纯度要求较高，分离提纯操作繁琐，由于大的亲水性核酸基团，较难产生一 个紧密的堆积表面，并且有一定非特异性吸附结合。 电化学聚合法 利用导电化合物在电极表面的电聚合作用将d n a 固定在电极表面。y o u s s o u f i 等以聚( 3 乙酸吡咯) ( 3 n 羟基苯邻二甲酞亚胺吡咯) 为前体共聚物，将带有胺基的 含有1 4 个碱基的d n a 或低聚核苷酸( o d n ) 嫁接到电极表面，对目标d n a 片段进 行电化学检测，检测灵敏度有很大提高，检测限达到1 0 j 1m o l l 。v i e i l 纠1 8 1 贝0 将 合成的n 正己酸取代吡咯键合上d n a 片段后，修饰d n a 的吡咯与吡咯单体进行电 铜( i i ) 、锰( i i ) 等希夫碱金属配合物的合成及其d n a 生物传感器的研制 化学共聚合，生成固定有d n a 的导电聚合物膜，直接把d n a 固定在电极上，利用 聚合物本身的导电性检测，实时定量测定d n a 。 这类导电聚合物膜固定d n a 锖i 备电化学传感器，利用杂交前后聚合物膜本身电 性能的变化检测靶序列，电化学方法简单，检测限较低，极具应用前景。但是，所 用的单体需特殊方法合成，有一定的难度。比如吡咯，2 位、5 位及n 原子上的h 比较 活泼，但是2 位、5 位取代吡咯不易聚合，n 取代吡咯聚合后会影响聚合物膜的导电 性能。3 位取代对吡咯聚合物的导电性能影响不大，但其单体合成时需保护活泼h ， 合成反应完成后再脱去保护基。 生物素亲和素法 这种方法一般是将亲和素( a v i d i n 或s t r e p t a v i d i n ) 共价偶联或通过静电作用吸 附到支持物上。随后将生物素( b i o t i n ) 标记的d n a 通过生物素和亲和素之间的专 一性亲和作用反应而固定。因为亲和素对许多材料都有强烈的吸附性能，包括裸金、 自组装层修饰的金表面f 1 卅以及石英表面f 2 0 】等，所以这种固定方法对电极材料具有很 宽的选择性。 f a n g 等【2 l 】利用生物素亲和素之间特殊的相互作用将生物素标i 己, s s d n a 分子固 定到修饰有亲和素的固体表面。c a i 等【2 2 】使含有亲和素的7 羟基6 甲氧基香豆素在氧 化铟锡电极上电聚合，把亲和素包埋在聚合物膜内，以固定修饰有生物素的s s d n a 。 n a n a d 等【2 3 j 用类似的方法把亲和素固定在玻碳电极上7 羟基6 甲氧基香豆素聚合物 膜内，进而通过生物素亲和素之间特殊的相互作用固定修饰有生物素的s s d n a 。与 聚吡咯、聚苯酚等相比，香豆素修饰薄膜的表面有更好的亲水性，虽然不导电，但 是能较好地溶胀，可以更高效地结合生物素，从而提高d n a 的固定效率和修饰电极 的稳定性，可检测1 7 个碱基对的d n a 片段中的单碱基错配。 这种基于亲和素一生物素反应系统固定生物分子方法在生物传感器领域越来越 受到人们的重视。d n a 的生物素化是在碱性条件下用57 一氨基衍生的d n a 和n - 羟 基丁二亚胺长链生物素反应生成。通常这些方法简便温和，且高效，因而应用愈来 愈广泛。 2 、杂交过程 将修饰单链d n a 的电极放入被测溶液，当与靶d n a 相遇时发生杂交，其杂交 的效率受多种因素的控制。对杂交参数的优化能极大的提高互补d n a 之间的杂交 效率，最终提高对靶d n a 的检测灵敏度。 3 、杂交的指示 即将杂交信息转变为可测定的电化学信号。 4 、电化学信号的检测 4 青岛科技大学研究生学位论文 电化学检测d n a 可以分为直接检测和间接检测。直接检测的依据在于d n a 与 某些电极表面的直接电子转移是可能的，而且d n a 的一些组分包括碱基和核酸核 糖在一定电势窗口下也是有电化学活性的；间接检测则是通过一些氧化还原媒介来 实现电子传递，借助于这些与d n a 选择性结合的有电化学活性的指示剂来进行杂 交检测。例如，一些具有电活性的阳离子会与带负电荷的d n a 磷酸骨架静电结合； d n a 双螺旋的沟槽也可作为电活性分子的连接位点；在d n a 链上标记一些电活性 标记物作为信号探针：另外，也可利用电催化反应或一些新型纳米材料对杂交信号 进行放大。 ( 1 ) d n a 的直接电化学检测 这种利用杂交能激发电信号改变的性质束直接进行检测的非标记法大大简化了 检测过程( 不需要指示剂的加入及反应、检测的步骤) ，并且这种方法可以即时检测 d n a 双螺旋结构的形成【2 训。这种原位检测法是通过监测目标d n a 或探针d n a 的 本身氧化还原活性的改变，或者是通过监测探针界面的电化学性质的变化进行的。 在d n a 的碱基中，鸟嘌呤和腺嘌呤在一定电势范围内比较容易被氧化，汞电极、 碳电极、金电极以及氧化铟锡( i t o ) 电极都被用于其电化学行为的研究【2 5 3 0 1 。鸟嘌呤 核苷在1 3 4v ( 对标准氢电极) 、腺嘌呤核菅在1 7 9v 发生单电子氧化反应，而胸腺 嘧啶和胞嘧啶则需要更高的电位1 3 。 虽然通过碱基氧化进行d n a 检测可以达到n m o l l 一量级的灵敏度1 3 2 ，3 3 】，但氧 化所需的过正的电位会产生很大的背景电流，对信号产生严重的干扰。w a n g 等1 3 4 l 通过背景校正的方法提高了在玻碳电极上氧化鸟嘌呤检测的灵敏度。d n a 骨架中的 核糖也可以被氧化，但氧化反应会毁坏磷酸骨架，所以这种方法较适合流动相中的 分析而不适合在d n a 修饰电极上应用。 ( 2 ) d n a 的间接电化学检测 在合适的条件下，d n a 探针电极浸入含有目标d n a 的溶液时，目标d n a 即与电 极表面的d n a 探针杂交形成d s d n a ，为了检测所发生的杂交信息，必须采用一种电 活性分子，称之为杂交指示剂，它选择性地与d s d n a 结合，并能在电极上产生某种 可被测定的电信号从而反映d n a 的杂交信息i ”，3 6 】；或者是通过监测杂交前后其他的 电化学参数( 如电容、电导) 的变化，以及直接检测杂交后d n a 的氧化还原信号来实 现的。根据电化学活性物质的不同，标记型电化学d n a 生物传感器可以分为以下几 类： 嵌入剂 通常是具有电活性的小分子物质，它们能选择性地与电极表面的d s d n a 结合。 将杂交反应后的电极浸入含有嵌入剂的溶液中反应一定时间，或在杂交反应之前， 先加入- i 中电活性分子再进行杂交，然后进行电化学检测，所得信号的大小或变化 铜( i i ) 、锰( i i ) 等希夫碱金属配合物的合成及其d n a 生物传感器的研制 值可以反映电极表面d s d n a 的多少，从而测定被测溶液中目标d n a 片段的含量l j 7 1 。 嵌入剂与d n a 分子的作用一是通过分子嵌入d s d n a 双螺旋的碱基之间，二是通过 分子与d n a 骨架上的磷酸基团之间的静电作用。a l o n s o 等【3 8 i 采用o s ( p h e n ) 3 2 + 作为 杂交指示剂，采用计时电位法检测杂交前后o s ( p h e n ) 3 2 + 的峰面积变化，从而测得特 定序列d n a 的含量。也有采用亚甲基兰【3 9 】等染料、配合物如制4 0 1 、锰配合物、 柔毛霉素等抗菌素作嵌入剂。 d n a 分子小沟结合剂 这类物质的作用与嵌入剂相类似，它们与d n a 分子结合的方式是与d n a 分子 扭曲区的小沟的碱基对边缘发生相互作用的小沟结合；这种小沟只存在于d s d n a 分 子中，s s d n a 并不具备，因此，这种结合剂对d s d n a 的选择性优于上述嵌入剂。 各种小分子与d n a 分子相互作用的电化学研究是上述嵌入剂和小沟结合剂的选择 基础，这类研究在国内外己有不少报道【4 引。 电活性d n a 标记物 合成的带有电化学活性基团的寡聚核苷酸与电极表面的靶d n a 选择性地进行 杂交反应，在电极表面形成带有电活性官能团的杂交分子，通过测定其电信号可以 识别和测定d n a 分子。即直接在d n a 链上引入导电性分子作为标记物。f a n 等1 4 列 设计了一种灵敏度高、特异性好的电化学分子信标( m o l e c u l a rb e a c o n ) 杂交检测方法。 他们将一段一端修饰巯基另一端连有一个二茂铁分子的捕获探针自组装到金电极表 面，这种探针具有类似于荧光分子信标的茎环( s t e m 1 0 0 p ) 结构。这种方法首次将分 子信标引入到电极表面，而且不需要任何杂交后处理和外加指示试剂，可以方便、 直接地检测杂交的进行。x i a o 等】同样基于探针杂交前后构型的变化，设计了一种 靶取代后信号增强的杂交检测方法，将一段与捕获探针部分互补并一端修饰亚甲基 蓝的“信号探针 与捕获探针先杂交。这时亚甲基蓝处于电极的远端，当靶序列与 捕获探针杂交后，被靶序列“竞争取代”下来的亚甲基蓝端会游近电极表面产生更快 的电子传递反应。这种方法的检出限可以达到l 1 0 j 2t o o l l d 以下并可以灵敏区分 单碱基错配。 信号放大杂交检测 在d n a 传感器中，灵敏度是至关重要的一个参数。特别是对极低含量的靶物 质进行检测时，由于发生杂交反应的d n a 的量很少和检测方法本身的限制，产生 的杂交信号很难与背景信号完全区分开，所以利用各种催化反应或纳米材料对杂交 信号进行放大是目前电化学d n a 传感器中较为常用的方法。酶具有极高的催化效 率，在酶的催化反应中产生的催化电流可以用电化学仪器灵敏地检测出来，所以把 酶作为信号标记物在电化学d n a 传感器中有着广泛的应用。碳纳米管是一类很重 要的纳米材料，它具有大表面积、中空、化学稳定和良好的导电性等特点，可以作 6 青岛科技大学研究生学位论文 为电极修饰物或信号载体【4 5 1 ，近年来在电化学生物传感领域有着广泛应用。w a n g 等1 4 6 j 将碳纳米管作为酶的负载体，结合酶的高催化效率及碳纳米管的高负载量和优 良的电子传递特性，在识别和传导两方面同时进行放大。由于每根碳管上大约负载 96 0 0 个酶分子，以及碳管促进电子传递的特性，使得杂交信号显著增强，检测极限 可以达到5 4am o l l 一。自m i r k i n 等1 47 j 通过比色检测方法将金纳米粒子作为信号探针 引入到d n a 传感器领域以来，由于它具有粒径可调、易修饰和生物兼容性好等特 点以及其本身的金属特性，金纳米粒子在电化学d n a 传感器中同样得到了重要的 应用。c a i 等1 4 酬将银的氧化电流作为检测信号，同样利用纳米金银染法在i t o 电极 上进行了d n a 的杂交检测。 1 1 4d n a 电化学生物传感器的应用 电化学d n a 传感器具有选择性好、灵敏度高、测试费用低及适于联机化的优 点。电分析化学不破坏测试体系，不受颜色影响，操作简便，而且，电化学传感大 都使用固体电极表面固定探针，对发展基于表面控制杂交反应的基因诊断学研究有 着独特的优势。电化学d n a 传感器是一种非常有发展前途的生物传感器，也必将 会在医疗保健、食品工业、农业、环境等领域具有极为广泛的应用。 l 、嗾病诊断 电化学传感器分子识别能力强，无放射性标记。避免了操作过程中对人的危害， 它还能与流动注射技术相结合，可以进行实时、在线检测，也可以进行活体检测。 电化学d n a 传感器不仅可以用来识别特定碱基序列的d n a ，还可用来检测d n a 的损伤，以及一些药物与d n a 的作用机理，进行特定药物的设计合成，在临床诊 断，体外药物筛选等方面都有应用。e r d e m 等1 4 9 】将合成的s s d n a 探针固定到碳糊 电极表面，以 c o ( p h e n ) 3 3 + 】作为杂交指示剂，采用差示脉冲伏安法检测肝炎b 病毒。 w a n g 掣5 0 】将2 7 和3 6 个碱基的寡聚核苷探针固定在碳糊电极上，p j , c o ( p h e n ) 3 3 + j 日l 指汞剂，检测m 肺结核d n a 。 2 、环境监测 传统的监测方法有很多缺点：分析速度慢、操作复杂且需要昂贵仪器，无法进行 现场快速监测和连续在线分析。近年来，利用d n a 传感器来监测环境中的病原微生 物和基因诱变剂，因其简便、快捷、准确而受到广泛重视【5 。d n a 传感器监控环境 中的病原微生物与用d n a 传感器进行疾病诊断的原理相似，即通过固定监测对象的 特异性d n a 探针，再配合p c r 技术，进行杂交信号的检测1 52 。2 0 0 6 年，t e n c a l i e c 等 【5 3 】报道了利用固定有小牛胸腺d n a 片段的石墨电极，结合方波伏安技术，成功检测 了废水中的s 形霍乱菌，证明d n a 电化学传感器用于环境监测的可靠性。 3 、食品检测 电化学d n a 传感器在食品检测中的应用已有报道，如对转基因食品的检测【5 训， 铜( i i ) 、锰( i i ) 等希丈碱金属配合物的合成及其d n a 生物传感器的研制 对食品中大肠杆菌的检测【5 5 】。2 0 0 6 年，k a f i a 等【5 6 峙艮道了电化学d n a 传感器检测食品 中小分子物质一葡萄糖。但目前电化学d n a 传感器在食品检测中的应用还很少。由 于电化学d n a 传感器具有灵敏、快速、易于在线测定等特点，适合于食品中可能存 在的诸如食品添加剂、农药等小分子物质的检测。可以预言，随着电化学d n a 传感 器研究的不断深入，其在食品检测中的应用也必将愈加广泛。 1 2 金属配合物与核酸的相互作用 1 2 1 金属配合物与d n a 作用的研究背景 金属配合物与d n a 的键合和分子识别特性是生命科学中重要的研究课题。对 研究金属配合物与核酸的作用方式和机理，探索配合物在抗肿瘤药物、分子生物学、 生物工程技术领域及其相关领域的应用都具有十分重要的意义。近年来金属配合物 与d n a 的键合之所以引起人们的重视是因为这类化合物具有以下诱人的应用前景： 用作核酸的光裂解试剂和示踪试剂，从而实现对d n a 的某些位点的特异性剪切， 即化学核酸酶：作为核酸非放射性的发光或电化学发光标记物；可望帮助人 们了解d n a 损伤和修复的机理，从而合成出对某些与基因突变有关疾病的治疗药 物；用作核酸二级或三级结构的探针。张书圣等1 5 7 】研究邻菲咯啉金属配合物与 d n a 作用时发现此类饱和的八面体配合物与d n a 的作用方式为嵌插方式，检测限 达到2 7p m o l t l 一，制备了较高灵敏度的d n a 生物传感器。实验证明金属配合物作为 嵌入试剂是这种结合模式极有用的探针。对插入剂本身而言，由于金属、配体可以 改变，因此对试剂的结构设计具有广泛的灵活性。这一系列的研究工作引起了科学 界的广泛重视，使得探索金属配合物与d n a 的作用机理、寻找d n a 的结构探针的 工作开展得更为深入。 1 2 2 金属配合物与d n a 作用的研究方法 金属配合物与d n a 分子间的相互作用研究，包括作用的位点( 大沟、小沟) 、 作用的形式( 嵌插、静电和沟槽键合) 、有无构型选择或碱基序列选择，需用多种方 法加以确定。常用的研究方法有光谱法、电化学方法、序列凝胶电泳、n m r 技术、 流体力学方法、粘度测定法以及热力学方法等。 l 、光谱法 d n a 分子中的碱基具有光学活性，在2 6 0n n l 附近处有吸收。许多金属配合物 分子本身具有光学活性，或与d n a 结合后产生光学活性，因此用光谱方法通过考 察金属配合物与d n a 结合后分子结构上的变化来研究其结合机理，是非常有效和 应用最为广泛的方法。其中紫外可见吸收光谱是研究金属配合物与d n a 分子相互 作用的一种最方便、最常用的技术。一般来说，当小分子以嵌插方式键合于双螺旋 碱基对之间时，其吸收光谱表现为吸收峰减小，波长红移，因为插入配体与d n a 8 青岛科技大学研究生学位论文 碱基对可发生兀电子堆积，插入配体的兀宰空轨道与碱基的兀电子轨道发生偶合，使 能级下降，导致兀_ 7 c 木跃迁几率减小，产生减色效应。光谱变化的大小与其结合力 相关联。嵌插结合方式的光谱变化要大于其他结合方式。 此外，线二色光谱( l d )