（动物学专业论文）南方鲇血细胞mpo细胞化学特征与cdan克隆及表达分析.pdf

c a n d i d a t e ：z h a 0n a s u p e r v i s e r ：p r o f z h a n gy a o - g u a n g s u r p o a e db yt h en o n p r o f i ts p e c i a lr e s e a r c hf r o mm i n i s t r yo f a g r i c u l t u r e ( n o 2 0 0 9 0 3 0 4 8 - 0 8 ) r e s o u r c ee n h a n c e m e n ta n dr e l e a s i n go fm e g a l o b r a m a p e l l e g r i n ia n d p r o c y p r i sr a b a u d ia n ds t u d yo ne c o l o g i c a lr e s t o r a t i o ni nt h ex i a o r i v e r s u r p o r t e db yt h ep h d p r o g r a m sf o u n d a t i o no f s o u t h w e s tu n i v e r s i t y ( n o s 唧10 9 0 01 ) s t u d i e so nb l o o do f p r o t e c t i n ga n di m p o r t a n tc o m m e r c i a l f i s h e si nt h eu p p e ry a n g t z er i v e r s c h o o lo fl i f es c i e n c e ，s o u t h w e s tu n i v e r s i t y c h o n g q i n g c h i n a m a y ，2 0 1 1 学位 究成 特别 在文 学位 定， 许论 论文 印或 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口 保密期限至年 月止) 。 学位论文作者签名：走娟p 导师签名： 签字日期：2 d f j 年多月，d 日 签字日期 6 目录 摘要兽i a b s t r a c t i i i 第1 章前言l 1 1 血细胞的m p o 细胞化学特征2 1 1 1 高等脊椎动物血细胞的m p o 细胞化学特征3 1 1 2 鱼类血细胞的m p o 细胞化学特征3 1 2 鱼类粒细胞发生中m p o 含量变化。4 1 3m p o 与鱼类非特异性免疫能力的关系5 1 4 鱼类m p o 基因与造血调控6 ， 1 4 1 鱼类造血基因及转录因子表达途经。6 1 4 2 鱼类m p o 的结构及该基因在胚胎发育中的表达模式6 1 5 本研究的目的和意义8 1 6 参考文献1 0 第2 章南方鲇血细胞m p o 细胞化学特征1 5 2 1 实验材料和方法1 5 2 1 1 实验材料。l5 2 1 2 实验药品与试剂1 5 2 1 3 实验方法16 2 2 结果1 6 2 2 1 南方鲇外周血细胞形态及p o x 染色特征1 6 2 2 2 南方鲇血细胞形态发生中p o x 染色特征。1 7 2 3 寸论1 9 2 3 1 南方鲇血细胞m p o 细胞化学特征。1 9 2 3 2 鲇形目和鲤形目鱼类血细胞m p o 活力比较。1 9 2 3 3 南方鲇与非鱼类脊椎动物血细胞p o x 染色特征比较2 0 2 3 4 南方鲇与非鱼类脊椎动物血细胞发生中m p o 细胞化学特征2 2 2 4 小结3 7 2 5 参考文献。3 8 第3 章南方鲇m p o 基因e d n a 克隆和表达分析4 1 3 1 实验材料和方法4 l 3 1 1 实验材料一4 1 3 1 2 实验仪器设备4 l 3 1 3 实验药品与试剂4 l 3 1 5m p o 基因的序列分析和组织分布4 7 3 1 6 南方鲇胚胎发育中检测m p o 表达的r t - p c r 4 9 3 2 结果5 0 3 2 1 总r n a 提取与南方鲇m p o 基因的p c r 扩增5 0 3 2 2 南方鲇m p oc d n a 序列分析5 0 3 2 3 真骨鱼类m p o 系统进化分析5 1 3 2 4 南方鲇m p o 的组织分布5 2 3 2 5m p o 基因在南方鲇胚胎发育中的时间表达模式5 2 3 3 讨论。5 2 3 3 1 南方鲇m p o 氨基酸序列分析5 2 3 3 2 真骨鱼类m p o 基因在脊椎动物p o x 基因家族中的进化地位。5 3 3 3 3 南方鲇m p o 组织表达和胚胎发育过程中的时间表达模式5 4 3 4d 、结6 4 3 5 参考文献6 6 致谢6 9 在校期间发表论文及参加科研实践情况7 1 摘要 南方鲇血细胞m p o 细胞化学特征与 c d n a 克隆及表达分析 动物学专业硕士研究生：赵娜 指导教师：张耀光教授 摘要 运用血细胞常规染色和酶细胞化学染色方法，研究了南方鲇血细胞髓过氧化物酶( m p o ) 的细胞化学特征。并对鲇形目、鲤形目等鱼类与四足类的血细胞p o x 染色特征进行比较；运用 r t - p c r 和r a c e 技术克隆南方鲇m p o 全长e d n a 序列，并运用r t - p c r 方法研究m p o 的 组织分布和个体发生。对南方鲇血细胞m p o 细胞化学特征和血细胞形态发生中m p o 含量变 化规律进行描述和总结，对脊椎动物系统发生过程中m p o 和e p o 的发生规律和真骨鱼类m p o 基因在脊椎动物p o x 基因家族中的进化地位进行总结，获得南方鲇m p o 的组织分布和个体 发生中的时间表达模式。意义在于丰富鱼类血细胞的酶细胞化学研究资料，为进一步研究鱼 类m p o 基因在造血发育调控中的作用提供参考资料。 m p o 特定存在于南方鲇嗜中性粒细胞中，可作为南方鲇嗜中性粒细胞的标志酶类。对几 种鲇形目和鲤形目鱼类血细胞的m p o 细胞化学特征进行比较。发现鲇形目鱼类血细胞中的 m p o 活力显著高于鲤科鱼类，推测鲇形目鱼类较强的抗病能力与嗜中性细胞中较强的m p o 活力有关。 m p o 在南方鲇早幼粒细胞阶段开始出现，到晚幼阶段含量逐渐增多，成熟嗜中性粒细胞 中含量有所减少。在粒细胞发生中，m p o 含量呈现先增加后减少的变化规律。比较南方鲇与 其他脊椎动物血细胞发生中m p o 含量变化规律，结果显示南方鲇中m p o 的发生规律和多数 鱼类、哺乳类相似。对比南方鲇与其他脊椎动物外周血细胞的p o x 染色特征，发现南方鲇的 m p o 细胞化学特征与两栖类、爬行类和哺乳类的较为相似，与鸟类的差异较大。推测在脊椎 动物系统发生过程中，m p o 和e p o 的变化规律可能预示二者在功能上可互补。 南方鲇m p o 基因c d n a 全长为3 3 5 6 n t ，开放阅读框( o r f ) 2 3 5 5 n t ，编码7 8 4 个氨基酸， 5 ，非编码区( 5 ，u t r ) 含4 5 n t ，3 非编码区( 3 u 1 r i 己) 含9 5 6 n t 。南方鲇m p o 的a a 序列包含 信号肽( m 1 s 2 4 ) ，一段前导肽( e 2 5 - p 1 3 9 ) ，轻链( c 1 4 0 g 2 5 4 ) 和重链( 1 2 5 5 k 7 料) 几个部分。 南方鲇m p o 与斑点叉尾鲴的同源性最高，达7 7 ：其次为斑马鱼。南方鲇m p o 的催化残基 与其他脊椎动物的催化位点高度保守，c a 2 + 结合位点与其他脊椎动物的较为保守，3 个n - 糖基 化位点与人的有差异，血红素环境与人的有较高相似性，但略有不同。推测南方鲇的m p o 蛋 白的催化机制与活性可能与哺乳类相似。 西南大学硕士学位论文 系统进化关系结果显示，真骨鱼类m p o 基因是自鱼类从脊椎动物主干上分化出来后单独 进化的，且与四足类e p o 和m p o 基因有共同的祖先。推测四足类m p o 、e p o 、l p o 和s p o 基因的分化时间晚于真骨鱼类与四足类的共同祖先。可能t p o 最先从真骨鱼类p o x 基因家族 中分化出来，其次是e p o ，伴随真骨鱼类嗜酸性粒细胞吞噬功能的退化，e p o 基因逐渐丢失。 最后真骨鱼类的m p o 基因分化出来，伴随嗜中性粒细胞吞噬功能的进化，m p o 基因在不同 类群的真骨鱼类中保留下来。 南方鲇m p o 在不同组织中广泛表达，且在肾脏、头肾、皮肤、鳃等组织高量表达，m p o 在不同组织中的泛表达模式与m p o 参与机体非特异免疫的功能相符。南方鲇m p o 基因在胚 胎处于尾芽游离期开始表达，至心脏初现期，表达水平显著增加；至出膜前期，表达水平最 高；至初孵仔鱼期，表达水平稍有下降；从出膜后到腹鳍和背鳍出现期，表达水平稍高于初 孵仔鱼期，表达量之间无显著变化。m p o 基因在胚胎发育中的时间表达模式说明南方鲇m p o 的表达与造血系统发育密切相关。 关键词：南方鲇；血细胞化学特征；m p o ；c d n a 克隆 u a b s t r a c t c l o i n g ，m r n ae x p r e s s i o na n a l y s i so fm p o c d n aa n d c y t o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s a t i o n f o r m p oo fb l o o dc e l l si n 跏r u sm e r i d i o n a l i s m a j o r ：z o o l o g y c a n d i d a t e ：z h a 0n a s u p e r v i s e r ：z h a n gy a o - g u a n g a b s t r a c t t h ew r i g h t - g i e m s a ( w - g ) a n dc y t o c h e m i c a ls t a i n i n go fe n z y m em e t h o d sw e r eu s e df o rs t u d y o f c y t o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s a t i o nf o rm y e l o p e r o x i d a s e ( m v o ) o fb l o o dc e l l si ns i l u r u sm e r i d i o n a l i s ， a n dc o m p a r e dw i t hp e r o x i d a s e ( p o x ) s t a i n i n gc h a r a c t e r i s a t i o no fb l o o dc e l l si nl e t r a p o d s , c y p r i n i f o r m sa n ds i l u r i f o r m s f u l l l e n g t ho fm p oe d n ai ns i l u r u sm e r i d i o n a l i sw a sc l o n e da n d a n a l y s i sb yr t - p c ra n dr a c e ，t i s s u ee x p r e s s i o na n do n t o g e n yo fm p ow e r ea l s os t u d y e db y r t - p c r t h er e g u l a r i t yo nc o n t e n tv a r i a t i o nf o rm p oo fh e m a t o g e n e s i sa n dc y t o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s a t i o ni ns i l u r u sm e r i d i o n a l i sw e r em a d ec l e a r , t h er e g u l a r i t yo nt h ec h a n g e so fm p oa n d e p oo np h y l o g e n yo fv e r t e b r a t e sa n dp h y l o g e n e t i cs t a t i o no ft e l e o s t e im p og e n ei np o xg e n e f a m i l yo fv e r t e b r a t e sw e r es u m m a r i z e d ，a n dw ea c q u i r e dt i s s u ea n dt e m p o r a le x p r e s s i o np a t t e mo n o n t o g e n yo fm p om r n ai n 彤l u r u sm e r i d i o n a l i s t h i ss t u d y c o u l de n r i c hr e s e a r c h e so n c y t o c h e m i s t r yo fb l o o dc e l l si nf i s h e s ，a n dp r o v i d et h ed a t ao ns t u d i e so fm p of u n c t i o n i n h e m a t o p o i e t i cr e g u l a t i o n m p oc o u l dr e p r e s e n tt h es i g ne n z y m ei ns i l u r u sm e r i d i o n a l i s ，w h i c hi ss p e c i f i ct on e u t r o p h i l c o m p a r e dw i t ht h ec y t o c h e m i c a lc h a r a e t e r i s a t i o nf o rm p o o fb l o o dc e l l si ns o m ec y p r i n i f o r m sa n d s i l u r i f o r m s ，w ef o u n dt h a ta c t i v i t yo fm p oi ns i l u r i f o r m si ss i g n i f i c a n t l yg r e a t e rt h a ni ti nc y p r i n i d f i s h s ，t h e r e b yw ep r e s u m e dt h a tt h er e l a t i v a l ys t r o n ga b i l i t yt or e s i s td i s e a s ei ns l u r u sm e r i d i o n a l i s i sr e l a t e dt o t h e i rh i g h e rm p o a c t i v i t yi nn e u t r o p h i l s m p om i g h tb eo r i g i n a t ef r o mt h ep r o m y e l o c y t ei ns l u r u sm e r i d i o n a l i s ，t h ec o n t e n to fm p o w a sr e d u c e di nt h em a t u r en e u t r o p h i l s ，a n dw a si n c r e a s e di nt h em e t a m y e l o c y t e ，w h i c hi n d i c a t e dt h a t t h ec o n t e n ti n c r e a s e da tf i r s t ，a n dt h e nd e c r e a s e dd u r i n gt h eg r a n u l o c y t e sm o r p h o g e n e s i s c o m p a r e d w i t ht h ec o n t e n to fm p oo nh e m a t o g e n e s i si ns i l u r u sm e r i d i o n a l i sa n do t h e rv e r t e b r a t e s ，t h er e s u l t s s h o w e dt h a tr e g u l a r i t yo fm p om o r p h o g e n e s i si ns i l u r u sm e r i d i o n a l i sw a ss i m i l a rt oo t h e rf i s h e s a n dm a m m a l s t h ec y t o c h e m i c a lc h a r a e t e r i s a t i o no fm p oi ns i l u r u sm e r i d i o n a l i sw a sr e l a t i v e l y s i m i l a rt oa m p h i b i a n s ，r e p t i l e sa n dm a m m a l s ，w h i l es h o w i n gag r e a td i f f e r e n c ew i t ha v i a n s ow e i l l 西南大学硕士学位论文 p r e s u m e dt h a tt h er e l a t i o n s h i po fm p oa n de p om a yi n d i c a t et h a tt h et w oc a r lb ec o m p l e m e n t a r yo r s u b s t i t u t ei nt h e i rf u n c t i o nd u r i n gv e r t e b r a t e sp h y l o g e n y f u l l l e n g t hm p oc d n as e q u e n c eo fs u r u s m e r i d i o n a l i sc o n s i s t so f3 3 5 6n u c l e o t i d e s ， i n c l u d i n ga l lo p e n - r e a d i n gf r a m e ( o r f ) o f2 3 5 5 n tw h i c he n c o d e sa s e c t i o no fs i g n a lp e p t i d e ( m l s m ) ， as e c t i o no fp r e c u r s o rp e p t i d e ( e 2 s - p 1 3 9 ) ，as e c t i o no fl i g h tc h a i n ( c 1 4 2 5 4 ) a n das e c t i o no fh e a v y c h a i n ( 1 2 5 5 k 7 8 4 ) ，a n d4 5n t5 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n ( 5 u t r ) ，9 5 6 n ty - u n t r a n s l a t e dr e g i o n ( 3 t l t r ) m m p os h a r e s7 7 a m i n oa c i ds e q u e n c ei d e n t i t yw i t hc h a n n e lc a t f i s h ，a n d6 6 w i t hz e b r af i s h c a t a l y t i cr e s i d u e si nt h el i g h tc h a i na n dh e a v yc h a i no fm p ow e r ec o n s e r v e da m o n gm a m m a l sa n d , 钳l u r u sm e r i d i o n a l i s t h ec a + b i n d i n gm o t i fw e r ea l s or e l a t i v e l yc o n s e r v e d t h ep e p t i d eh a st h r e e p o t e n t i a ln - g l y c o s y l a t i o ns i t e s w h i c hi s i n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n t a m o n gm a m m a l sa n ds i l u r u s m e r i d i o n a l i s ，a n dt h ec o v a l e n th e m el i n k a g er e s i d u e sw i t ht h eh e m eg r o u ph a si n s i g n i f i c a n td i f f e r e n t b e t e e nh u m a na n ds i l u r u sm e r i d i o n a l i s w ep r e s u m e dt h a tc a t a l y t i cm e c h a n i s m a n da c t i v i t yo fm p o p r o t e i ni ns i l u r u sm e r i d i o n a l i sm a yb es i m i l a rt om a m m a l s p h y i o g e n e t i ca n a l y s i so fm a m m a l i a np e r o x i d a s ea m i n oa c i ds e q u e n c e s ( m y e l o p e r o x i d a s e s , e o s i n o p e r o x i d a s e sa n dt h y r o i dp e r o x i d a s e s ) a n dm p oo ft e l e o s t e is h o w e dt h a tm p og e n eo f t e l e o s t e ih a v eu n d e r g o n et h e i ro w ni n d e p e n d e n tp r o c e s so fd u p l i c a t i o na f t e rt e l e o s t e id i v e r s i f i c a t i o n f r o mv e r t e b r a t e m p og e n eo ft e l e o s t e ia n dm p oa n de p og e n eo ft e t r a p o d sh a v et h ec o m m o n a n c e s t o r w es p e c u l a t e dt h e s eg e n ed u p l i c a t i o na n dd i v e r s i f i c a t i o ni nt e t r a p o d st h a tc r e a t e dm p o , e p o ，l a c t o p e r o x i d a s e s ，a n ds a l i v a r yp e r o x i d a s e sp o s t d a t et h el a s tc o m m o na n c e s t o ro ft e t r a p o d sa n d t e l e o s t e i w ea l s os p e c u l a t et h a tt p om a yb et h ef i r s td i v i d e df r o mt e l e o s t e ip o xg e n e nf a m i l y , f o l l o w e db ye p o ，t h em p og e n ed i v i d e da n de p ol o s tw i t ht h ed e g r a d a t i o no fe o s i n o p h i l p h a g o c y t o s i si nt e l e o s t e i m p og e n er e s e r v e dw i t h i nn e u t r o p h i l sp h a g o c y t o s i se v o l u t i o ni nd i f f e r e n t t e l e o s t e i m p om r n ao fs l u r u sm e r i d i o n a l i sh i g h l ye x p r e s s e di nk i d n e y , h e a dk i d n e y , s k i na n dg i l l s h o w i n ga b r o a de x p r e s s i o ni nt i s s u e s t h i se x p r e s s i o nm o d e lw a sa c c o r d i n gw i t ht h e i rf u n c t i o no f p a r t i c i p a t i n gi nn o n - s p e c i f i ci m m u n es y s t e m m p om r n a w a sf i r s ts e e na tt a i lb u df r e es t a g ei n e m b r y oo fs i l u r u sm e r i d i o n a l i s ，w h i c hw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dw h e ne m b r y od e v e l o p m e n tt ot h e h e a r ta p p a r i t i o n , a n dw a sh i g h e s tt op r o p h a s eo fo u tf r o mm e m b r a n e t h ee x p r e s s i o nl e v e l sd e c r e a s e d s l i g h t l yt on e w l yh a t c h e dl a r v a es t a g e ，a n dt ot h ep e l v i ca n dd o r s a lf i na p p e a r e ds t a g e s ，t h e e x p r e s s i o nl e v e ls l i g h t l yh i g h e rt h a nt h el a r v a es t a g e ，b u tt h e r ew e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n g t h e i ro w n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o nm o d e lo fm p oi ne m b r y od e v e l o p m e n to f s l u r u sm e r i d i o n a l i sw a s c l o s e l yr e l a t e dw i t ht h ed e v e l o p m e n to fh e m a t o p o i e t i cs y s t e m k e yw o r d s ：s i l u r u sm e r i d i o n a l i s ：c y t o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s a t i o no fb l o o dc e l l s ： m p o ；c d n ac l o n i n g i v 第1 章前言 第1 章前言 a g n e r ( 1 9 4 1 ) 在犬脓细胞中分离酶时，从中性粒细胞中的浓汁( 呈绿色) 中 分离得到一种酶，颜色呈深绿色，将其命名为绿过氧化物酶( v e r d o p e r o x i d a s e ) 【l j 。 之后的研究发现在哺乳动物中这种酶多分布于髓性细胞中，所以又将其称为髓过 氧化物酶( m y l o p e r o x i d a s e ，m p o ) 。m p o 、嗜酸性过氧化物酶( e o s i n o p h i l i c p e r o x i d a s e ，e p o ) 、乳酸过氧化物酶( l a c t i ca c i dp e r o x i d a s e ，l p o ) 、甲状腺过氧 化物酶( t h y r o i dp e r o x i d a s e ，t p 0 ) 和唾液过氧化物酶( s a l i v a r yp e r o x i d a s e ，s p o ) 都是含有亚铁血红素的氧化还原酶，共同构成过氧化物酶家族( p e r o x i d a s e ，p o x ) 。 m p o 主要存在于嗜中性粒细胞中，可将m p o 作为嗜中性粒细胞的标志酶。m p o 在鱼类的嗜中性粒细胞中常见，并被特定称为髓特异性过氧化物酶( m y e l o i d s p e c i f i cp e r o x i d a s e ，m p x ) 。 k l e b a n o f f ( 2 0 0 5 ) 【2 】对人的m p o 的功能已进行详细阐述，认为m p o 在 m p o f i e 0 2 氯化物抗菌系统中发挥重要作用( 如图1 1 ) 。当外源微生物被吞噬后， 嗜中性粒细胞合成或释放m p o 和h 2 0 2 到细菌所处部位。在吞噬小体中，h 2 0 2 激 发m p o 和主要的氯化物相互作用产生具有杀菌活性的次氯酸，同时这一过程的完 成还需要还原型辅酶( n a d p h ) 产生的h + 参与形成大量h 2 0 2 。m p o h 2 0 2 氯 化物抗菌系统是哺乳类嗜中性粒细胞杀灭病原微生物的主要途径。m p o 可能会有 更加复杂的功能，可产生中性粒细胞活性反应 4 1 ，增强巨噬细胞对荚膜组织孢浆菌 等病原菌的杀菌活力【5 j 。 e p o 是存在于嗜酸性粒细胞中的一种过氧化物酶，是嗜酸性粒细胞中含量相 对较多的蛋白，占嗜酸性粒细胞中蛋白含量的4 0 t 6 1 。e p o 的杀菌活力依赖 e p o h 2 0 2 抗菌系统，在体内s c n 。是e p o 的首选作用底物 6 1 。m p o 和e p o 均可 被释放到血浆和吞噬泡中执行功能，所不同的是e p o 具有较强的抗氰化物能力， 且活性易被叠氮化物、氨基三唑和氨苯砜等抑, , j t n 。 l p o 由乳腺、唾液腺以及其他外分泌腺分泌【8 】，s p o 主要由唾液腺分泌，l p o 和s p o 也可由白细胞分泌产生 9 1 。s p o 和l p o 能抵御由眼、口、鼻、支气管和肠 道粘膜表面的微生物引起的感染【1 0 1 ，l p o 在体内免疫系统中对乳汁和黏膜分泌物 中的细菌有较强杀菌作用【s 】。 t p o 是催化甲状腺激素的重要酶类，由甲状腺滤泡细胞合成，在滤泡腔面的 微绒毛处分布最为丰富。t p o 作用于碘离子和h 2 0 2 产生碘，并且在甲状腺激素 t 3 和t 4 的合成和分泌中起重要作用【l i 】，t p o 的生成和活性受t s h 调刊1 2 1 。m p o 在哺乳动物细胞中还具有细胞毒性作用：在由m p o 所引发的呼吸爆发过程中产生 大量的羟自由基，羟自由基和多种分子发生反应生成阻碍自然杀伤性细胞的免疫 西南大学硕士学位论文 应答功能的分子1 2 。m p o 基因的多态性和多种疾病有关，m p o 高水平表达会造成 急性髓细胞性白血病( a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ，a m l ) 1 3 】，乳腺癌等疾病。由 于多种鱼类的粒细胞类型和粒细胞形态发生过程和人类相似，因此对斑马鱼等鱼 类m p o 基因及其功能的研究对进一步研究人的髓细胞系分化和由造血基因引发的 疾病的治疗具有重要意义。 i - o 毒一扣一j 赣o ；琶夸； c y t o p i a s m 鬣e i n x t 妇r a p h a i i u g o i a r s o s m p a a l o r 。翻 图1 1m p o h 2 0 2 氯化物抗菌系统( g o e b e la n dd i n a u e r ，2 0 0 3 ) 嘲 f i g 1 1m p o h 2 0 2 - c h l o r i d ea n t i b i o s i ss y s t e m ( g o e b e la n dd i n a u e r ，2 0 0 3 ) 1 3 1 1 1 血细胞的m p o 细胞化学特征 血细胞化学染色技术结合血细胞形态染色方法可对血细胞类型、血细胞化学 成分和血细胞功能等方面进行研究。血细胞化学染色技术常应用于血细胞的识别、 血液疾病诊断和鉴别诊断中，且在骨髓细胞形态学、白血病形态诊断方面具有重 要意义。细胞化学染色技术可和电镜技术相结合用于研究胞质中颗粒类型和血细 胞发生过程。 过碘酸希夫反应、苏丹黑b 、二氨基联苯胺( d i a m i n ob e n z i d i n e ，d a b ) h 2 0 2 、 酸性吨醋酸萘酚、萘酚a s t r 磷酸酯、偶氮偶联法等可以分别检测细胞中的糖类、 脂类和过氧化物酶、酸性a 醋酸萘酯酶、酸性磷酸酶与碱性磷酸酶等酶类。伴随 血细胞化学染色技术的标准化，对染色结果的评价方法也逐渐规范化。m p o 细胞 化学染色方法是国际血液学标准化委员会( i c s h ) 最早推荐的一种细胞化学染色 方法，目前此方法被广泛应用于a m l 的诊断中。 d a b h 2 0 2 是最早用于人m p o 的染色方法【1 5 】，该方法具有敏感性强且致癌性 小，反应产物定位清晰的特点【1 6 】，但实验过程中会接触毒性物质。p e r e i r a l l7 】提出 采用碘化钾法进行血细胞m p o 染色的方法，该方法具安全性好、操作简便等特点。 国内学者对p e r e i r a 染色方法进行探讨和改赳1 8 9 1 ，该方法的缺点是在染色过程中 会出现褪色现象。 2 第1 章前言 鼍io 詈曼! 鼍曼詈詈! 鼍詈曼墨 二氨基联苯胺d a b h 2 0 2 的染色法的基本原理是在过氧化氢参与下，过氧化 物酶能与无色的供氢体d a b 反应，氧化d a b 为棕褐色沉淀定位于过氧化物酶所 在部位【2 0 】。对鱼类【2 1 1 和爬行类捌等血细胞的p o x 染色进行氰化钾抑制，结果嗜中 性粒细胞中的p o x 活力能被氰化物或叠氮化物抑制，嗜酸性粒细胞中的p o x 对 其不敏感，可能由于氰化物或叠氮化物是e p o 发挥功能时的主要作用底物。因此 有关血细胞化学染色特征方面的报道中多将嗜中性粒细胞的p o x 认为是m p o ，嗜 酸性粒细胞的p o x 认为是e p o 。 1 1 1 高等脊椎动物血细胞的m p o 细胞化学特征 高等脊椎动物外周血粒细胞常包括：嗜酸性、嗜碱性和嗜中性三种类型。有 关粒细胞形态研究较多，但细胞化学特征研究相对较少。蜥蜴( t u p i n a m b i s m e r i a n a e ) 粒细胞可分为嗜中性、嗜酸性和嗜碱性i 与嗜碱性i i 型4 种类型，嗜酸 性粒细胞的数量最少【2 引，嗜中性和嗜碱性粒细胞含m p o ；鳄鱼( c a i m a nc r o c o d i l u s y a c a r e ) 2 4 】的嗜中性粒细胞含m p o ；鸡( g a l l u sd o m e s t i a u s ) 1 2 5 】的嗜中性粒细胞和 嗜碱性粒细胞不含m p o ；猫( f e l l sc a t u s ) 1 2 6 】的m p o 阳性反应在早幼粒细胞中较 强，单核细胞是m p o 弱阳性；人粒细胞和单核细胞中均含m p 0 1 2 7 。 在高等脊椎动物中，m p o 在嗜中性粒细胞中常见，这一特点和多数低等脊椎 动物相似。同时，m p o 在哺乳类的单核细胞中也较为常见，这一特征与鱼类等低 等脊椎动物不同。 1 1 2 鱼类血细胞的m p o 细胞化学特征 鱼类在胚胎阶段必须依靠先天免疫系统来抵抗水体中的病原微生物，所以和 高等脊椎动物相比，鱼类的非特异免疫系统在机体内防御和抵抗外界病菌侵入过 程中更为重要【2 8 l 。白细胞是鱼类先天性免疫防御系统的主要承担者，e l l i s 早在1 9 7 6 年【2 9 】就用细胞化学染色方法研究鱼类白细胞化学成分，伴随细胞化学染色方法的 不断改进，细胞化学染色技术逐渐成为研究鱼类不同类型白细胞特征的重要方法。 z i n l d 等【3 0 j 认为金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 、斑点叉尾鲴( i c t a l u r u s p u n c t a t u s ) 、 虹鳟( o n c h o r h y n c h u sm y k i s s ) 、大马哈鱼( o n c h o r h y n c h u sk i s u t c h ) 的嗜中性粒细 胞含m p o ，近期研究发现星丽鱼( a s t r o n o t u so c e l l a t u s ) 和南美牙鱼( h o p l i a s m a l a b a r i c u s ) 1 3 1 l 的嗜中性粒细胞中也含m p o 。多数资料表明硬骨鱼类嗜中性粒细 胞中多含m p o ( 表1 1 ) 。另有资料显示m p o 在其他类型血细胞中存在：金头鲷 ( $ p a r u sa u r a t a ) 1 3 2 1 单核细胞中含m p o ，鲤( c y p r i n u sc a r p i o ) 3 3 1 的巨噬细胞也含 有m p o 。m p o 在成年草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a ) 1 3 4 1 体内含量很少，鳙 ( a r i s t i c h t h y sn o b i l i s ) 1 3 1 1 嗜中性粒细胞中未观察到，胭脂鱼( m y x o c y p r i n u sa s i a t i c u s ) 3 西南大学硕七学位论文 【3 5 j 外周血细胞中也未见m p o 。表明少数鱼类体内缺乏m p o 或m p o