（分析化学专业论文）水环境中吲哚美辛的酶联免疫吸附分析方法的建立.pdf

四川大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四 川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的， 论文成果归四川大学所有，特此声明。 指导教师签名： 2 帅7 1 日 学生签名：嘘松 硼年6 月午日 四川大学硕士学位论文 水环境中吲哚美辛的酶联免疫吸附分析方法的建立 专业：分析化学 硕士研究生：霍松岷指导教师：邓安平教授 摘要 本文成功建立了一种高灵敏度和高特异性的间接竞争酶联免疫吸附分析法 ( e l i s a ) ，用以分析不同水环境( 自来水，饮用水，地表水以及污水) 中的吲 哚美辛含量。 吲哚美辛是一种常用的非甾体抗炎镇痛药( n s a i d ) 。将吲哚美辛与牛血清白 蛋白和卵清蛋白相结合制成免疫原和包被抗原。使用免疫原对两只成年新西兰 大白兔进行5 次免疫后取得吲哚美辛抗血清，以灵敏度，特异性，精密度，准 确性和稳定性作为标准筛选出最佳抗体。在优化的实验条件下，标准曲线建立 在0 0 1 1 0 n 【g m l ( 0 0 1 ，0 0 3 ，0 1 ，0 3 ，1 0 ，3 0 ，1 0n g m l ) 的浓度范围内。在 两周时间内连续作出1 0 条标准曲线，ic 5 。值( 标准曲线中吸光度抑制至最大吸 光度值的5 0 时所对应的待测物浓度) 在0 1 0 0 2 5n g m l ，最低检出限 ( d l ，s n = 3 ) 为0 0 1n g m l 。e l i s a 法的特异性由交叉反应表示，在所测物质 中，作为吲哚美辛的一种前体药物，阿西美辛与吲哚美辛结构相似，因此它与吲 哚美辛抗体的交叉反应达到9 2 3 。然而其他非甾体抗炎镇痛药与吲哚美辛抗 体的交叉反应值很小。精密度，准确性和稳定性由加标实验确定，得到回收率 在9 8 一1 2 3 。 本实验也采用h p l c 法来测定不同水样中的吲哚美辛，将其测定结果与 e l i s a 法比较，两种方法保持良好的一致性，相关系数达到0 9 8 8 。 关键词：酶联免疫吸附分析；吲哚美辛；水样；环境分析 四川大学硕士学位论文 d e v e l o p m e n to fa ne n z y m e 。li n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a yf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fi n d o m e t h a c i ni n d i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lw a t e rs a m p l e s l l a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y p o s t g r a d u a t e ：s o n g m i nh u oa d v i s o r ：p r o f a n p i n gd e n g a b s t r a c t ah i g h l ys e n s i t i v ea n ds p e c i f i ci n d i r e c tc o m p e t i t i v ee n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) i ss u c c e s s f u l l yd e v e l o p e df o rt h ea n a l y s i s o fi n d o m e t h a c i ni nd i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lw a t e rs a m p l e s ( t a pw a t e r ， d r i n k i n gw a t e r ，s u r f a c ew a t e ra n dw a s t e w a t e r ) i n d u m e t h a c i ni sac o m m o n l yu s e dn o n s t e r o i d a la n t i i n f l a m m a t o r yd r u g ( n s a i d ) t h ei m m u n o g e na n dc o a t i n ga n t i g e nw e r ep r e p a r e db yc o v a l e n t l y 1 i n k i n g i n d u m e t h a c i nt ob o v i n es e r u u la l b u m i n ( b s a )a n do v a l b u m i n ( o v a ) i n d u m e t h a c i na n t i s e r u mw a so b t a i n e db yi m m u n i z a t i o no ft w oa d u l t n e wz e a l a n dr a b b i t sf o r5t i m e sa n d t h es u p e r i o ra n t i b o d yw a s c h a r a c t e r i z e di nt e r m so fs e n s i t i v i t y ，s p e c i f i c i t y ，p r e c i s i o n ，a c c u r a c y a n ds t a b i li t y u n d e ro p t i m a le x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h es t a n d a r dc u r v e w a sc o n s t r u c t e d i nt h ec o n c e n t r a t i o n r a n g e o f0 0 1 1 0 n g m l ( 0 0 1 ，0 0 3 ，0 1 ，0 3 ，1 o ，3 0 ，l o n g m l ) f o rt e nc o n s e c u t i v es t a n d a r d c u r v e sr u ni nt w ow e e k s ，i 岛v a l u e s ( t h ec o n c e n t r a t i o no fa n a l y t e p r o d u c i n g5 0 o fi n h i b i t i o n ) w e r ef o u n dw i t h i n0 1 0 0 2 5n g m l ，a n d t h ed e t e c t i o nl i m i t ( d l ) a tas i g n a l - t o - n o i s er a t i oo f3 ( s n = 3 ) w a sa b o u t o 0 1 n g m l t h es p e c i f i c i t y o ft h ee l i s am e t h o di sp r e s e n t e db y c r o s s - r e a c t i v i t y a m o n ga l lt h et e s t e dc o m p o u n d s ，a sap r o d r u g o f 2 四川大学硕士学位论文 i n d o m e t h a c i n ，a c e m e t a c i ni ss t r u c t u r a l l ys i m i l a xt oi n d o m e t h a c i na n d t h e r e f o r ei t sc r o s s - r e a c t i v i t y r a t i o w i t hi n d o m e t h a c i n a n t i b o d yi s9 2 3 h o w e v e r ，t h ec r o s s r e a c t i v i t yv a l u e so ft h ea n t i b o d yw i t ho t h e rt e s t e d n s a i d sw e r ev e r yl o w p r e c i s i o n ，a c c u r a c ya n ds t a b i l i t yw e r ec o n f i r m e d b yt h es p i k i n ge x p e r i m e n t s ，t h er e c o v e r i e sw e r ef o u n dw i t h i n9 8 - 1 2 3 i no u ra s s a y 肿l cm e t h o dw a sa l s oa p p l i e di nt h ed e t e r m i n a t i o no f i n d o m e t h a c i ni nd i f f e r e n tw a t e rs a m p l e sa n dt h et e s t i n gr e s u l t sw e r e c o m p a r e dw i t he l i s am e t h o d t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 8 8w a s o b t a i n e d ，d e m o n s t r a t i n gag o o dc o r r e l a t i o no fe l i s aw i t hh p l c k e y w o r d s ：e n z y m e li n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ：i n d o m e t h a c i n w a t e rs a m p l e ；e n v i r o n m e n t a la n a l y s i s 3 四川大学硕士学位论文 1 引言 1 1 免疫分析概述 免疫分析是将免疫学的知识和化学中的分析手段有机的结合，为高特异性 以及超微量的分析提供了有效可行的方法。它的基本原理是利用抗原和抗体的 特异性结合作用来选择性识别和测定可以作为抗体或抗原的待测物。由于样品 中存在的其他干扰物不会产生免疫识别，因此免疫分析具有高特异性和高分辨 率的特点，应用广泛。 1 2 抗原 1 2 1 定义 抗原( a n t i g e n ，a g ) 是指可被t 淋巴细胞，b 淋巴细胞识别，能够刺激 机体免疫系统诱导免疫应答产生相应的抗体和或致敏淋巴细胞等免疫物质，同 时又能在体内、外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质。它是形成特 异性免疫反应的必备条件，没有抗原的刺激，就没有特异性免疫的形成。一个 完整的抗原称为完全抗原，它包括两方面免疫性能：免疫原性( i m m u n o g e n i c i t y ) 和免疫反应性( i m m u n o r e a c t i v i t y ) 。具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅 具有免疫反应性的物质被称为半抗原( h a p t e n ) 。 1 2 2 免疫原性 免疫原性指抗原进入体内刺激免疫系统产生抗体或形成致敏淋巴细胞的特 性。免疫原性是完全抗原非常重要的特性之一一种抗原能否成功诱导免疫动 物( 宿主) 产生免疫应答取决于三个方面的因素：抗原结构和性质，宿主的反 应性和免疫方式。一般而言，抗原物质的来源和宿主的亲缘关系越远，抗原性 越强，这是由于正常成熟宿主机体对自身物质一般不产生免疫应答，而只对非 自身物质产生免疫应答。其外，分子质量越大，免疫原性越强，可能的原因是 高分子物质在水溶液中容易形成胶体，在宿主体内停留时间长，与免疫细胞接 触机会多，有利于刺激机体产生免疫应答。此外，宿主的反应性和免疫方式也 6 璺型查兰堡主堂垡丝三 影响着抗原的免疫原性，宿主的个体发育，生理状态和遗传性等都对免疫原性 有很大的影响，所以不同种动物，甚至同种动物的不同个体对同一抗原的免疫 均有差异。免疫方式是免疫动物的机体与抗原的相互作用方式对抗原的免疫应 答也有很大影响，主要包括抗原的进入途径，剂量，次数，间隔时间。 1 2 3 特异性 抗原的特异性( s p e c i f i c i t y ) 表现在两方面：在免疫原性上，一种抗原只 能诱发一种特异的免疫应答，形成特异性抗体或致敏淋巴细胞；在反应原性上， 抗原只能与抗原诱导产生的特异性抗体或致敏淋巴细胞进行反应。 抗原特异性是由抗原决定簇( a n t i g e n i cd e t e r m i n a n t ) 决定的。抗原决定簇 也称为抗原表位，它是位于抗原物质分子表面或者其他部位的具有一定组成和 结构的特殊化学基团，是引起机体特异性免疫应答和免疫原与抗体特异性反应 的基本构成单位。多数天然抗原分子上通常存在多种抗原决定簇，一般不同的 抗原其抗原决定簇是不同的。但是有时某一种抗原决定簇也会出现在其他抗原 分子上，这称为共同抗原决定簇，这种抗原决定簇是抗原抗体交叉反应的基础 1 2 a 抗原的分类 根据抗原的免疫原性和反应性分类可以分为完全抗原和半抗原。 根据抗原与机体的亲缘关系分类可以分为：( 1 ) 异种抗原：指来自另一物 种的抗原：( 2 ) 异嗜性抗原：是指一类与种属无关，存在于不同种属动物，植 物和微生物细胞之间的所共有的性质相同的抗原，又称f o r s s m a n 抗原；( 3 ) 同 种异型抗原：指来自同种生物、不同个体的抗原；( 4 ) 自身抗原：能引起自身 免疫应答的自身组织成分；( 5 ) 肿瘤抗原：可分为肿瘤特异性抗原和肿瘤相关 抗原两大类 根据抗体产生是否需要t 细胞依赖性分类可以分为：( 1 ) 胸腺依赖性抗原 ( t d 抗原) ：含t 细胞决定簇，需要在t 细胞辅助下才能刺激b 细胞产生抗体 的抗原物质；( 2 ) 非胸腺依赖性抗原( t i a g ) ：只含b 细胞决定簇，不需要t 细胞辅助，可直接激活b 细胞产生抗体的抗原物质；( 3 ) 超抗原( s u p e r a n t i g e n ， s - g ) ：少量分子就可以使大量t 细胞活化的高效能抗原称为超抗原，活化效率 特别高。 四川大学硕士学位论文 1 2 5 抗原的制备 半抗原只具有免疫反应性，无免疫原性，因此不能诱导抗体产生，包括多 肽，药物，脂肪胺，核苷酸，甾族激素等小分子物质。只有将它们与蛋白质或 其他高分子量物质结合后形成完全抗原才能刺激机体产生相应的抗体。常用的 载体有蛋白质类如牛血清白蛋白，人血清白蛋白，血蓝蛋白等。 半抗原与载体交联应掌握以下3 个基本原则；1 带有游离氨基或游离羧 基，或两种基团都有；2 带有羟基，羰基的半抗原，它们不能直接与载体连接， 需用化学方法在半抗原上引进羧基才能与载体连接；3 芳香族半抗原由于环上 带有羧基，它邻位上的氢很活泼，极易取代。 1 3 抗体嘲 1 3 1 定义 抗体( a n t i b o d y ，a b ) 是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产 生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白( i m m u n o g l o b i n ，i g ) 。 免疫球蛋白通常是一组具有抗体活性和抗原样结构的球蛋白。从定义中可以看 到，所有的抗体都是免疫球蛋白，但不是所有的免疫球蛋白都是抗体。比如骨 髓瘤蛋白，虽然其结构与抗体相似，但没有免疫活性，就不是抗体。 免疫球蛋白包括很多种类，根据i g 的理化特性和与抗原结合方式的不同， i g 可以分为类和亚类。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白( y 一 球蛋白) 中。可分为五类，即免疫球蛋白g ( i g g ) 、免疫球蛋白a ( i g a ) 、免疫 球蛋白m ( i g m ) 、免疫球蛋白d ( i g d ) 和免疫球蛋白e ( i g e ) 。其中i g g ( 结构 见图1 1 ) 是最主要的免疫球蛋白，约占人血浆丙种球蛋白的7 0 ，分子量 约1 5 万，含糖2 3 。i g g 分子由4 条肽链组成。其中分子量为2 5 万的肽链， 称轻链( 1 i g h tc h a i n ，l ) ，分子量为5 万的肽链，称重链( h e a v yc h a i n ，l i ) 。 轻链与重链之间通过二硫键( s _ - s 一) 相连接。肽链的n 端，在l 链1 2 和 h 链1 4 处( 约在1 1 0 位前) 氨基酸的种类和顺序各不相同，称为可变区 ( v a r i a b l er e g i o n ，v 区) ；肽链c 端其余部分的氨基酸，在种类和顺序上彼 此间差别不大，称为稳定区或恒定区( c o n s t a n tr e g i o n ，c 区) v 区位于n 端， 璺型查兰堡主兰垒丝塞 h 链和l 链各有3 个超变区( h y p e r v a r i a b l er e g i o n ) ，其中的氨基酸残基种类 和顺序特别多变。抗体分子与相应抗原结合时，抗体v 区氨基酸构型，特别是 超变区的氨基酸残基，与抗原决定簇的立体构象必须互补吻合，所以抗原抗体 结合具有高度特异性，通过各种非共价键，如氢键，静电引力，范德瓦尔斯力 等的作用，使抗原抗体分子彼此结合在一起。 貌基靖 圈1 1 免疫球蛋白( i g g ) 的结构图 f i g1 1s t r u c t u r eo fi m m m o g l o b i n ( i 删 匿 1 , 3 2 抗体的生物活性 抗体的生物活性主要体现在：( 1 ) 结合特异性抗原；( 2 ) 具有抗原性：抗 体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应答的性能。不同的免疫球蛋 白分子，各具有不同的抗原性；( 3 ) 抗体不耐热，6 0 7 0 c 即被破坏。各种酶 及能使蛋白质凝固变性的物质，均能破坏抗体的作用。 1 3 3 抗体产生的规律 ( 1 ) 初次反应产生抗体：当抗原第一次进入机体时，需经一定的潜伏期才- 能产生抗体，且抗体产生的量也不多，在体内维持的时间也较短。 9 婴型奎兰堡主堂垡堡奎 ( 2 ) 再次反应产生抗体：当相同抗原第二次进入机体后，开始时，由于原 有抗体中的一部分与再次进入的抗原结合，可使原有抗体量略为降低。随后， 抗体效价迅速大量增加，可比初次反应产生的多几倍到几十倍，在体内留存的 时间亦较长。 ( 3 ) 回忆反应产生抗体：由抗原刺激机体产生的抗体，经过一定时间后可 逐渐消失。此时若再次接触抗原，可使已消失的抗体快速上升。如再次刺激机 体的抗原与初次相同，则称为特异性回忆反应；若与初次反应不同，则称为非 特异性回忆反应。非特异性回忆反应引起的抗体的上升是暂时性的，短时间内 即很快下降。 1 3 4 主要抗体类型 1 3 4 1 多克隆抗体 多克隆抗体( p o l y c l o n a la n t i b o d y ，p a b ) 是抗原或抗原与佐剂的混合物按 一定程序直接免疫动物后获得的抗血清。由于天然抗原中常含有多种不同的抗 原表位，可以刺激体内多个b 细胞增殖，产生多种不同抗原表位的抗体并释放 于血清中，抗血清又未经免疫纯化，因此其为多种抗体的混合物，称为多克隆 抗体。所采用的动物多为鼠，羊，兔，马等动物。 1 3 4 2 单克隆抗体 抗体主要由b 淋巴细胞合成。每个b 淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。 动物脾脏有上百万种不同的b 淋巴细胞系，含遗传基因不同的b 淋巴细胞合成 不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具 有不同基因的b 细胞。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就 可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种 决定簇的抗体，称为单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y ，姒b ) 。 1 3 5 抗体的制备方法 1 3 5 1 多克隆抗体的制备 ( 一) 用于免疫的动物 作免疫用的动物分哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、 l o 璺型奎堂塑主兰垡笙苎 鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的 生物学特性和所要获得抗血清数量，蛋白质抗原适合于家兔和山羊，因动物反 应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感 染性疾患，最好为雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差 异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只， 兔的体重以2 3 k g 为宜。 ( 二) 免疫途径，剂量，方法 免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结 内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0 i m l 左右。途径的 选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗 原，一般不宜采用静脉注射。 大动物抗原剂量约为0 5 - 1 o m g 只，小动物约为0 1 _ 0 6 m g 只。注射动物 时一般采用多点注射，一只动物注射总点数约为8 - 1 0 点。 首次免疫用完全佐剂，加强免疫时用不完全佐剂。每2 - 3 周加强免疫一次。 在第3 次加强免疫后1 0 天，从耳缘静脉取2 3 m i 血，制备血清，检测抗体效 价如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到 预期水平时，即可放血制备抗血清。 ( 三) 抗体的鉴定 在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清 效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须采血测试。只有在对抗血 清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。 1 抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法 常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子( 如蛋白类) 抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。而后 者则粗糙得多。 放射免疫法：以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育2 4 h 后， 测定其结合率。通常以结合率为5 0 的血清稀度和为效价。 双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产 生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。 2 抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物 质的识别能力。特异性好就是抗血清的识别能力强。通常，特异性是以交叉反 1 l 璺型查堂婴主兰垡丝奎 应率来表示的。交叉反应率低，表示抗血清的特异性好，反之则特异性差。交 叉反应率一般是用竞争抑制曲线来判断的。以不同浓度的抗原和近似抗原物质 分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率( b b 0 ) ，求出各自在i 岛时的浓度， 例如某抗原的i c ”浓度为一值，而一些近似抗原物质i 浓度几乎是无限大， 可以说这一抗血清与其它抗原物质的交叉反应率近似零，即无交叉反应，该抗 血清的特异性是好的。 抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生交叉反应的原 因有以下几个方面：1 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗 原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质 只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血 清发生交叉反应。2 两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。3 两种不同 的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗 体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原与抗体之间构象相似时的 结合力小于吻合时的结合力。 1 3 5 2 单克隆抗体的制备 要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆b 淋巴细胞，但这 种b 淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应 用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨 髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有b 淋巴细胞合成 专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源 于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗 体。其制备原理如图1 2 所示： 四川大学硕士学位论文 图1 2 单克隆抗体制各示意图 f i g1 2p r o d u c t i o no fm o n o c l o n a la n t i b o d y 1 3 6 抗原抗体结合反应 1 3 6 1 原理 抗原抗体的相互作用是所有免疫化学技术的基础。它们之间的反应是指抗 原与相应抗体之间发生的特异性结合反应。抗原抗体分子之间存在着结构互补 性和亲和性。抗原抗体的反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特 异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒钟。第二阶段为可见反应阶段，抗 原一抗体复合物在环境因素的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集，沉淀， 溶解等肉眼可见的反应，此阶段反应速度慢，往往需要数分钟至数小时。 抗体和大多数抗原均为蛋白质，它们易溶于水而形成胶体溶液。当抗原抗 体相互结合时，电荷减少或消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体，形成抗 原一抗体复合物。 抗原抗体结合完全依靠非共价键的相互作用，并且抗原一抗体复合物和游离 成分保持动态平衡。 1 3 四川大学硕士学位论文 1 3 6 2 特点 特异性：抗原一抗体结合反应的专一性称为特异性。这是由于抗原表位与抗 体超变区中抗原结合点之间在化学结构和空间构型上成互补关系。 按比例：在抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。 无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗 体，均可发现只有在两者分子比例合适时才出生现最强的反应。从图1 3 中可 见，曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等 价带( z o n eo fe q u i v a l e n c e ) 。在此范围内，抗原抗体充分结合，沉淀物形成 快而多。其中有一管反应最快，沉淀物形成最多，上清液中几乎无游离抗原或 抗体存在，表明抗原与抗体浓度的比例最为合适，称为最适比( o p t i m a lr a t i o ) 。 在等价带前后分别为抗体过剩则无沉淀物形成，这种现象称为带现象。出现在 抗体过量时，称为前带( p r e z o n e ) ，出现在抗原过剩时，称为后带( p o s t z o n e ) 。 捷体t 饵窜。冀孽羞纛 图1 3 沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系 f i g1 3r e l a t i o nb e t w e e nd e p o s i tm o u n ta n dr a t i oo fa n t i g e na n da n t i b o d yi n d e p o s i tr e a c t i o n s 1 4 饵馥甜帮寂曩 婴型查兰婴主堂篁堡苎 可逆性：抗原抗体反应遵循生物大分子热动力学反应原则，其反应式为； a b - a g a b a g = k 。k 2 = k 。式中各反应项的单位以m o l 表示，k 。表示反应速 度常数，k 2 为逆反应速度常数，k 是反应平衡时的速度常数。由上式可知，k 值是反映抗原抗体间结合能力的指示，所以抗体亲和力通常以k 值表示。k 值 可以达到1 0 9 级，k 值越大，就说明抗原抗体结合能力越强，即使当 a g 很小时， a b 也可以将其识别，既说明方法的灵敏度很高。 1 3 6 3 影响因素 影响抗原抗体结合主要包含以下几个因素：( 1 ) 抗原抗体的性质：抗体对表 位的内在亲和力，抗原抗体的结和价以及参与反应成分的立体结构；( 2 ) 电解质： 电解质的存在会使抗原一抗体复合物失去电荷而沉淀或凝集。常用0 8 5 的氯化 钠或各种缓冲溶液作为抗原抗体的稀释液，中和胶体粒子上的电荷；( 3 ) 酸碱度： 一般为p h6 0 - 8 0 ，超出此范围会影响抗原抗体的理化性质，出现假阳性或假 阴性反应。( 4 ) 温度：一般来说，抗原抗体的最佳温度为3 7 0 c ，若高于5 0 0 c ，会使 结合的抗原抗体解离，变性：若温度太低，反应速度变慢。 1 4 免疫分析的类型 1 4 1 竞争反应 竞争免疫分析是测定样品未结合的位点数，一般是将样品与已标记待测物 混合后再去竞争结合位点，再将复合物与游离抗原或抗体分离后测定其相对量。 竞争反应式可如下表示： a g ( 样品) + a b = a g _ a b a g ( 定量加入) + a b = a g * - a b 式中，a g * 为标记抗原。若对抗体进行标记，则标记和非标记抗体共同竞争 与抗原的反应。 1 4 2 夹心反应 夹心模式是免疫分析中另一种常用的反应类型，该反应是将待测抗原先由 某种抗体( 第一抗体) 捕获而从样品中分离出来，再与过量的第二抗体结合在 婴型查兰曼主兰垒堕兰 一起形成夹心模式复合物。 由于夹心反应中要使用两种抗体，步骤上较为复杂，但是由于抗原一抗体反 应的特异性，使得测定结果往往比竞争法更为准确。夹心反应常用于生物大分 子如蛋白质的定量分析。 1 5 免疫分析方法 1 5 1 异相免疫分析 异相免疫分析是在抗原抗体反应后以物理方法将抗原一抗体复合物与游离 的抗原，抗体相分离，然后检测与复合物相结合的标记物。异相免疫分析中可 采用竞争模式或夹心模式。 1 5 2 均相免疫分析 均相免疫分析不必对自由抗原和结合抗原进行分离，对样品处理简单。几 乎所有的均相免疫分析都采用竞争模式，其基本原理是根据标记抗原和抗体反 应生成的抗原一抗体复合物后，标记物的活性降低，导致检测信号值降低。均相 免疫分析适合于测定低分子量的化合物如药物，激素等在人体内的浓度。与异 相免疫分析相比，它易受溶液中其他物质的干扰。 1 5 3 非标记免疫分析 非标记免疫分析又称传统免疫分析。其原理是利用抗原一抗体反应后理化性 质的改变对抗原抗体进行测定的方法。按测试手段分类，可分为沉淀反应，免 疫扩散，免疫电泳，凝集反应。沉淀反应是免疫检测中最早使用的方法，它是 基于可溶性抗原与相应抗体发生特异性结合而形成大分子抗原一抗体复合物沉 淀，以此来定性定量测定抗原。免疫扩散是利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶 中扩散，形成浓度梯度，在抗原和抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉 淀线或沉淀环。常用的凝胶为琼脂和醋酸纤维塑膜。免疫电泳是电泳分析和沉 淀反应的结合产物，它既加快了沉淀反应的速度，又将某些蛋白组分利用其所 带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应。凝集反应是在合适的电解质存 在下，细菌和红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，产生肉眼可见的特异性 四川大学硕士学位论文 凝集现象。 1 5 4 标记免疫分析 将抗原或抗体用可以微量检测的标记物如放射标记，荧光标记，酶标记等 进行标记后，再与样品中相应抗体或抗原反应后，通过对免疫复合物中的标记 物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。根据标记物有无放射性可将标记 免疫分析分为放射免疫分析和非放射免疫分析。其中非放射免疫分析包括：酶 免疫分析，荧光免疫分析，化学发光免疫分析，电化学免疫分析等。 1 6 酶联免疫分析方法“一 1 6 1 简述 光度酶联免疫分析常被称为e l i s a 法，即酶联免疫吸附分析 ( e n z y m e - l i n k e di 咖u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 。它最早由e n g v a l l 和 p e r l m a n n 与v a nw e e m a n 和s c h u u r s 同时建立，并用于医学研究。它利用酶标 记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催 化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大地提高了灵敏度。 e l i s a 是将抗原，抗体的免疫反应和酶的高效催化反应结合并发展起来的 一种综合性技术。它利用标记物的酶催化底物的显色反应来反映抗原抗体的结 合过程，将酶催化底物反应的灵敏性和抗原抗体反应德特异性相结合，是一种 定性和定量的综合技术。固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比 例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受 检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催 化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 整个e l i s a 试验可分为三个部分：一是免疫学反应过程；二是酶和底物反 应过程；三是检测方法的建立，对酶催化反应产生的产物进行定量分析。根据 产物的理化性质，可采用分光光度法，也可采用荧光分析法，化学发光分析法， 电化学分析法等分析方法。 四川大学硕士学位论文 1 6 2e l i s a 的基本类型 1 6 2 1 双抗体夹心法 双抗体夹心法( d o u b l ea n t i b o d ys a n d w i c h ，d a s e l i s a ) 是检测抗原最常 用的方法，原理如下：( 1 ) 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗 涤除去未结合的抗体及杂质。( 2 ) 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固 相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。( 3 ) 加酶 标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结 合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。( 4 ) 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原 的量。 1 6 2 2 间接法 间接法( i n d i r e c te l i s a ) 是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于 固相载体，加人待检标本( 含相应抗体) 与之结合。洗涤后，加人酶标抗球蛋白 抗体( 酶标抗抗体) 和底物进行测定。 操作步骤如下；( 1 ) 将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤 除去未结合的抗原及杂质。( 2 ) 加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结 合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其 他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去 ( 3 ) 加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上 酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。( 4 ) 加底物显色：颜色 深度代表标本中受检抗体的量。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶 标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 i 6 2 3 竞争法 竞争法( c o m p e t i n ge l i s a ) 可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于 测定抗体。以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和 一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结 合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关 操作步骤：( i ) 用已知特异性抗体包被固相载体；( 2 ) 测定管加待测抗原 堕型盔兰堡主兰垡丝苎 和一定量的酶标抗原，经过温育，使二者与固相抗体竞争结合；对照管只加一 定量酶标抗原与固相抗体直接结合。分别洗涤，除去未结合的成分；( 3 ) 加底 物显色，对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深； 测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。 如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶 标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。分别测定两管的光密度( o d ) 值，根据对照管与测定管0 d 值之比，计算标本中待测抗原含量。 i 6 2 4 间接双抗体夹心法 间接双抗体夹心法( i n d i r e c td a s - e l i s a ) 的测定原理是：( 1 ) 将第一种 动物制备的特异性抗体吸附在周相载体上，孵育后洗涤未吸附的抗体；( 2 ) 加 入含有待测抗原的样品，使之与固相载体上的抗体反应，孵育后洗涤：( 3 ) 加 入用第二种动物( 如家兔) 制各的特异性抗体与抗原反应，孵育洗涤；( 4 ) 加 入酶标抗体( 如羊抗兔兔免疫球蛋白) ，孵育后洗涤；( 5 ) 加入底物溶液。 1 6 2 5 抗酶抗体法 抗酶抗体法是利用免疫学反应而不是用化学交联反应来制备酶结合物，常 用辣根过氧化物酶( 积p ) 为标记酶作为抗原免疫动物制得抗h r p 抗体。可用一种 动物制备特异性抗体( 第一抗体) 和抗酶抗体( 第三抗体) ，再用另一种动物制 备抗第一种动物i g g 的抗体( 第二抗体) 。让第二抗体把第一抗体和第三抗体通 过免疫反应结合起来，通过对底物的作用而揭示在固相载体上待测抗原的存在。 1 6 3 常用e l i s a 的过程国 图1 4 中表示了e l i s a 法中最常用的三种方法( 间接e l i s a , 夹心e l i s a 及 竞争e l i s a ) 的过程图。其中：a n t i g e n 是抗原，a n t i b o d y 是抗体，a n t i g e nc o a t e d w e l l 是包被了抗原的酶标板，a n t i b o d yc o a t e dw e l l 是包被了抗体的酶标 板，s p e c i f i ca n t i b o d y 是特异性抗体( 一抗) ，e n z y m e c o n j u g a t e ds e c o n d a r y a n t i b o d y 是酶标二抗。s u b s t r a t e 是底物 四川大学硕士学位论文 图1 4 间接e l i s & 夹心e l i s a 及竞争e l i s a 的过程图 f i g 1 4p r o c e d u r e so fi n d i r e c tp l i s & s a n d w i c he l i s aa n dc o m p e t i t i v ee l i s a 1 6 4e l i s a 常用的标记酶 酶联免疫分析酶技术具有高敏感性的关键是选用有生物放大作用的酶作为 标记物。在实验室目前最常用的示踪酶有辣根过氧化物酶( 陬p ) ，碱性磷酸酶 ( a l 【p ) 以及葡萄糖氧化酶等。本实验采用的是h r p 。h r p 的催化反应需要底物过 氧化氢( h 2 0 2 ) 和供氢体( d h 2 ) 。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成 有色的氧化型染料( d ) 。酶促反应的过程如下： m 獬 阴2 + 1 2 m 一d + 2 1 1 2 0 目前用得较广泛和较满意的供氢体是：o p d ( 邻苯二胺) 和t 船( 四甲基联苯 胺) 。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均 好。本实验采用的供氢体是t m b 。 璺坐奎堂堡主兰垡堡三 由于h r p 的底物h 2 晚本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的h 2 0 2 不 能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰( 说明h ：o ：已消耗殆尽) 。 这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。 1 6 5 酶标仪工作原理 光是电磁波，波长1 0 0 彻4 0 0 珊称为紫外光，4 0 0 n m 7 8 0 n m 之间的光可 被人眼观察到。大子7 8 0 加称为红外光。酶标仪测定的原理是在特定波长下， 检测被测物的吸光值。光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉 的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。检 测单位用o d 值表示，o d = c d e ，其中：c 为检测物的浓度；d 为检测物的厚 度；e 为摩尔因子。 在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能 够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。 因此，在测定检测物时，选择特定的波长进行检测，称为测量波长。 但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特 异性吸收，再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测 物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。 1 7 免疫分析技术在环境分析中的应用 ( 一) 荧光免疫技术：以荧光物作为标记物的免疫分析技术。传统的免疫 荧光技术由于存在非特异性荧光干扰，存在不能精确定量等缺点，在环境分析 中用得很少。随着一些荧光蛋白的发现和分子生物学及单克隆抗体技术的发展， 免疫荧光技术得到进一步完善，敏感性和稳定性都有了很大提高，目前主要应 用于细菌，病毒，寄生虫及其生物毒素的快速鉴定。 ( 二) 放射免疫分析：是根据同位素分析的敏感性和抗原一抗体反应的特异 性两大特点综合起来建立的一种超微量的分析技术。放射免疫分析具有准确度 高，样品用量少，易规范化和自动化等优点，但有一定放射危险。在环境分析 中多用于病毒中和抗原的结构蛋白进行定位及位点分析。已明确的病毒中和抗 原的结构蛋白有：脊髓灰质炎病毒，甲型肝炎病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒， 轮状病毒等。 2 t 璺型查兰堡圭堂垡堡苎 ( 三) 酶联免疫分析：是利用标记物的酶催化底物的显色反应来反映抗原 抗体结合的过程，将酶催化底物反应的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合， 是种定性和定量的综合技术。本文即采用此法进行水环境中的药物分析。由 于环境样品组成复杂，含量低，因此，对环境样品的分析是一项十分复杂的工 作。由于e l i s a 具有灵敏度高，成本低，检测方法简便，快速等优点，被广泛 应用于环境样品的检测，其中包括环境激素，化工试剂，细菌啪，药物。1 ， 杀虫剂睁埘等。 1 8 环境中微量物质的存在咖 1 8 1 环境污染 在长期的历史发展过程中，人与环境之间形成了相互渗透，相互