番茄抗青枯病自交系选育及其杂交配组试验-硕士论文

B a c t e r i a lW i l ta n dC o m p a r i s o no ft h e i rC r o s s e s 研究 生 ：魏仕伟 指导老师： 叶志彪教授 指导小组： 李汉霞教授 王涛涛副教授 张俊红副教授 张余洋副教授 专业：蔬菜学 获得学位名称：农学硕士 方向：蔬菜遗传育种 获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学园艺林学学院 二零一零年六月 一毒一苓年六月 ii?y_ni l l I I II I 1I i l1 11I i t1 1 1I Il Y 17 9 9 7 9 9 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 纪 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生张规么伟 帆2 口J 。年月3 日 签名日期：2 口，o 年月2 日签名日期：M 年匀p 日 注t 请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 番茄抗青枯病自交系选育及其杂交配组实验 目录 摘要I A B S T R A C T I I 第一章文献综述。1 l 课题的提出1 2 番茄常见的几种病害1 2 1 番茄青枯病的有关进展1 2 1 1 青枯病的鉴别和抗性机制2 2 1 2 番茄青枯病的抗病性鉴定2 2 1 3 青枯病的分子标记3 2 1 4 番茄青枯病的相关育种4 2 1 5 青枯病的生物防治4 2 2 番茄枯萎病的进展5 2 2 1 番茄枯萎病生理小种的划分及抗性鉴定方法5 2 2 2 枯萎病标记的进展5 2 - 3 烟草花叶病毒病。6 2 3 1 番茄烟草花叶病毒病的症状6 2 3 2 烟草花叶病毒的标记进展6 3 配合力的初步预测7 第二章番茄抗青枯病自交系选育8 1 材料与方法8 1 1 试验材料8 1 1 1 植物材料8 1 1 2 病原材料8 1 2 试验方法。9 1 2 1 抗青枯病品种F 4 代自交材料的进一步纯化9 1 2 2 青枯病菌的分离、纯化及接种9 1 2 31 - 2 、T M 2 4 标记检测9 1 2 4 田间性状调查1 0 2 结果与分析1 0 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 2 1 青枯病菌接种分离群体结果1 0 2 2 抗烟草花叶病毒及枯萎病的分子检测1 2 2 3 番茄自交系农艺性状。1 4 3 讨论1 5 3 1 自交系抗性的分离1 5 3 2 番茄青枯病的发病1 6 3 3 基因标记的可靠性1 6 3 4 自交系的经济性状1 6 第三章番茄抗青枯病株系的杂交配组试验1 7 1 材料与方法17 1 1 试验材料。1 7 22 试验方法。17 2 1 栽培与管理1 7 2 2 贮藏实验生理指标的测定18 2 3 青枯病菌的分离、纯化及接种1 8 3 结果与分析1 8 3 1 产量18 3 2 果实性状和营养成分1 9 3 2 1 果实性状1 9 3 2 2 营养成分1 9 3 3 早熟性2 0 3 4 杂交组合青枯病的抗性2 l 3 5 果实贮藏试验结果2 2 3 5 1 贮藏期间果实的硬度变化2 2 3 5 2 贮藏期间果实颜色的变化2 3 3 5 3 贮藏期间果实可溶性固形物的变化2 3 3 5 4 贮藏期间果实V c 含量的变化。2 4 3 5 5 贮藏期间好果率的变化2 4 4 讨论2 5 4 1 产量2 5 4 2 果实性状、品质及熟性2 5 4 3 对青枯病的抗性2 5 4 4 贮藏实验2 6 第四章抗青枯病杂交配组试验2 7 1 实验材料2 7 2 试验方法2 7 2 1 杂交组合比较试验2 7 2 2 杂交组合抗性分子检测和青枯病田间发病率调查2 7 3 结果与分析2 7 3 1 产量分析2 7 3 2 果实性状分析2 8 3 3 品质性状2 9 3 4 早熟性3 0 3 5 抗病接种与分子检测3 1 3 6 贮藏实验3 2 3 6 1 贮藏期间果实硬度的变化。3 2 3 6 2 贮藏期间a 值变化。3 3 3 6 3 好果率变化3 3 3 7 主成分分析3 4 3 8 结论3 6 第五章讨论3 7 5 1 番茄青枯病优良自交系的在杂交组合中的利用3 7 5 2 春秋两季部分相似杂交组合比较3 7 5 3 有关番茄青枯病的抗性遗传机制3 7 参考文献：3 9 致谢4 5 番茄抗青枯病自交系选育及其杂交配组实验 摘要 番茄是我国种植规模最大的蔬菜种类之一，以其漂亮的外观，较高的营养价值而 深受人民群众喜爱。但是在番茄生产中，存在的最大问题就是病害严重，据调查番茄 在生长期间病害种类多达4 0 多种，以烟草花叶病毒病、枯萎病、青枯病等发病严重， 在长江流域及华南地区，青枯病已经对番茄的生产造成了巨大的破坏，产量下降甚至 绝收，商品性状降低，严重制约了番茄产业的发展。由于物理防治、化学防治等效果 差，对环境破坏严重，且成本较高，而培育优良的抗病品种是防止番茄各种病害最有 效的方法。 本实验采用传统的人工接种和分子标记检测技术，对相关材料进行筛选，以期得 到包含抗青枯病在内的多抗性番茄优良自交系，为抗青枯病的育种打下基础。利用选 育的多抗自交系与经济性状优良的品系配制杂交组合，并进行比较，得到若干优良杂 交组合。主要研究结果如下： 1 以番茄抗青枯病的商业品种金钻、粤星、东方红、0 4 9 5 、0 4 9 6 的F 4 代为材 料，进行了三代自交，经过对其F 4 、F 5 、F 6 代植株进行人工接种鉴定、T m 2 口、 二2 基因标记的辅助选择，并结合田间经济性状，采用单株选择法，选育出 经济性状较优良并且含有三抗和双抗基因的自交系，得到三抗的番茄自交系 1 2 份，双抗自交系1 0 0 份，为抗青枯病的下一步的育种创造了材料。 2 从上述选育的F 4 代抗青枯病的株系中，选取性状有差异的优良自交系为母 本，以经济性状优良的自交系为父本，配制了1 0 个杂交组合。通过组合的 比较试验，筛选出2 个抗青枯病，在产量、果实风味、早熟性以及耐贮性方 面都表现较好的杂交组合。 3 从上述选育的F 5 代抗青枯病中的株系中，选取抗青枯病的自交系和经济性状 优良的自交系为亲本，配制了1 5 个杂交组合。通过组合的比较试验，筛选 出3 个抗青枯病、枯萎病、烟草花叶病毒病，在产量、果实风味、早熟性都 表现较好的杂交组合。 关键词：番茄：自交系：青枯病：组合比较；标记辅助选择 R i v e rb a s i na n dS o u t h e r nC h i n a , d e c r e a s e sp r o d u c t i o na n dl o w e r sc o m m o d i t yc h a r a c t e r s C h e m i c a la n dp h y s i c a lc o n t r o l st ob a c t e r i a lw i l th a v eas i d ee f f e c to ne n v i r o n m e n t ， l l i g h c o s ta n dp o o r - e f f i c i e n c y n l em o s te f f e c t i v e m e t h o di st oc u l t i v a t et h eg o o d d i s e a s e r e s i s t a n c ev a r i e t y I nt h i ss t u d y , t h et r a d i t i o n a la r t i f i c i a li n o c u l a t i o nc o m b i n a t i o nw i t hm o l e c u l a rm a r k e r d e t e c t i o nw e r eu s e dt os e l e c tr e l e v a n tm a t e r i a l s ，w ea i m e dt og e tm u l t i - r e s i s t a n tp l a n t s i n c l u d es e l e c t i o n so fr e s i s t a n tt ob a c t e r i a li n b r e dl i n e s ，a n dl a yt h ef o u n d a t i o nf o rb r e e d i n g r e s i s t a n c et ob a c t e r i a lw i l t B a s e do nt h em u l t i r e s i s t a n ti n b r e dl i n e sa n dg o o de c o n o m i c c h a r a c t e rl i n e s ，w eg o tt h ef i n eh y b r i dc o m b i n a t i o n s ，t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 T o m a t oF 4g e n e r a t i o n so ft h eb a c t e r i a lw i l t r e s i s t a n tc o m m e r c i a lv a r i e t i e ss u c ha s D i a m o n d ，G u a n g d o n gs t a r , o r i e n t a lr e d ，0 4 9 5 ，0 4 9 6 ，w em a d et h e ms e l f i n gf o rt h r e e g e n e r a t i o n s ，i n o c u l a t e dt h e i rF 4 ，F 5a n dF 6g e n e r a t i o n s ，t h e nb a s e do nt h ei n d i v i d u a l p l a n ts e l e c t i o nm e t h o d , w eg o tt h e12i n b r e dl i n e sw i t hg o o de c o n o m i cc h a r a c t e r s a n dr e s i s t a n c et ot h r e ed i s e a s e s 10 0i n b r e dl i n e sr e s i s t a n c et ot w od i s e a s e s ，w h i c h W a st h ef o u n d a t i o nf o rb r e e d i n gt or e s i s t a n c eb a c t e r i a lw i l ti nt h ef u t u r e 2 W r e s e l e c t e d t h eg o o de c o n o m i cc h a r a c t e r si n b r e dl i n e sa sm a l ep a r e n t ，d i f f e r e n t c h a r a c t e r so fi n b r e dl i n e sa sf e m a l ep a r e n tf r o mt h eF 4g e n e r a t i o no fi n b r e dl i n e s w h i c hr e s i s t a n c et ob a c t e r i a lw i l t , a n dg o t10h y b r i dc o m b i n a t i o n s ，t h e nw e o b t a i n e d2h y b r i dc o m b i n a t i o n sw i t hg o o dc h a r a c t e r e ss u c ha sr e s i s t a n tt ob a c t e r i a l w i l t ，t h ey i e l d ，f r u i tf l a v o r e a r l ym a t u r i t ya n ds t o r a b i l i t y 3 W es e l e c t e di n b r e dl i n ew i t hr e s i s t a n c et ob a c t e r i a lw i l ta so n eo ft h ep a r e n tf r o mt h e F 5g e n e r a t i o no fb r e e d i n gl i n e s ，t h eo t h e rp a r e n ti s t h ei n b r e dl i n ew i t hg o o d e c o n o m i cc h a r a c t e r s ，m a d eu p15h y b r i d s T h e nw eg o t3h y b r i dc o m b i n a t i o n sw i t h g o o de c o n o m i cc h a r a c t e r sa n dr e s i s t a n c e st ob a c t e r i a lw i l t ，f u s a r i u mw i l t ，t o b a c c o m o s a i CV I R U S K e yw o r d s ：T o m a t o ；I n b r e dl i n e s ；B a c t e r i a lw i l t ；C o m b i n a t i o nc o m p a r i s o n ； M a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n 番茄抗青枯病自交系选育及其杂交配组实验 第一章文献综述 1 课题的提出 细菌性青枯病是一种土传性病害，广泛存在于热带、亚热带和温带等温暖湿热的 地区，它是多种农作物减产，甚至绝产的主要原因( S m i t h , 1 8 9 6 ) 。青枯病可危害以 茄科为主的多种作物，而番茄则是受到其影响最大的作物之一。 南美洲西海岸地区是番茄的起源地，番茄大约1 6 世纪传入欧洲，中国引种栽培 番茄历史相对较短，抗青枯病种质资源极度贫乏，遗传基础狭窄等诸多因素的限制是 我国番茄育种取得重大突破的瓶颈。中国番茄青枯病抗源大部分引自亚洲蔬菜研究与 发展中心，这些材料在中国番茄抗青枯病品种选育中发挥了巨大作用。但是，现有 品种多数单果重偏小，难以满足长江流域及南方地区的消费市场对大果型的要求。 对于抗病虫性状的选择，传统方法是根据植物表现型进行选择，主要是通过自然 发生条件下田间病虫害的调查和人工接种鉴定。然而这种育种方法耗费时间多，需要 大量的资源，诸如人力以及物力，而且由于人为因素、环境因素以及鉴定标准的不同， 造成鉴定结果的可靠度不理想，导致实验的可重复性较差，与此同时在品种选育过程 中，病原菌的生理小种在不停地分化，结果可能是经过长时间培育出来的抗病品种很 快被新的病原菌克服，选择效率低。而分子标记辅助选择，只需少量D N A ，结合抗 病虫基因标记或与之紧密连锁的分子标记，就能够在植株早期对抗病虫性进行准确的 的鉴定，并且不受环境的干扰，选择的准确性得到了提高，同时也大大加快了育种进 程。 实践证明，培育抗青枯病病品种是防治番茄青枯病的一项经济有效的措施。在番 茄抗青枯病育种过程中，对番茄抗青枯病优良自交系的筛选，无疑是极其重要的环节， 随之筛选抗青枯病的优良杂交组合，为以后的抗青枯病育种工作打下基础。本实验以 商业抗青枯品种的分离群体为材料，利用青枯菌接种和分子标记辅助选择的方法，以 期得到抗青枯病在内的多抗性番茄自交系。以分离群体中的优良抗青枯病自交系和经 济性状优良的自交系进行杂交，通过杂交组合比较实验，以期得到抗青枯病，经济性 状优良的杂交组合。 2 番茄常见的几种病害 2 1 番茄青枯病的有关进展 青枯雷尔氏菌可以导致二百多种植物得青枯病。尤其是经济作物中的茄科，比如 番茄、辣椒、马铃薯等( K e l m a ne ta l ，1 9 9 4 ) 。茄科植物的细菌性青枯病是多种农作物 减产主要的原因。青枯病可危害以茄科为主的多种植物，在我国福建、台湾、广西、 2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 广东、四川、云南、浙江、湖南、上海、江苏、江西、安徽等省市区广泛分布。一般 以马铃薯、番茄、茄子、辣椒等茄科蔬菜以及烟草、香蕉、桑等经济作物受害较重( 苗 立祥，2 0 0 9 ) 。 2 1 1 青枯病的鉴别和抗性机制 青枯菌在侵染寄主一段时间后，寄主植物在发病时表现出明显的青枯病症状，即 植物的枝叶由于失水萎蔫下垂，但叶子仍是绿色。具体顺序如下：首先是上部叶片萎 蔫，再是下部叶片慢慢萎蔫，而中部叶片失水萎蔫最迟。在连日阴雨的条件下，土壤 含水较多时候番茄病株可以持续大约一周死亡。有症状的茎下端通常表皮粗糙不平， 会发生很多的不定根。天气潮湿时部分病茎上可出现水渍状，随之出现褐色的斑块。 维管束由于青枯病菌侵染变褐，经过挤压，从切口处有白色菌脓溢出，该特征可作为 田间快速诊断是否为青枯病的方法之一。 研究证明，青枯病的发病机制如下，青枯菌通常可从植物各个器官的伤口入侵， 但没有受过伤的根冠部位也是青枯病菌侵入的重要部位。植物的次生根根冠与主根之 间形成一层鞘，青枯病菌在穿过这层鞘后，慢慢侵入皮层并在细胞间隙生长，细胞间 中胶层被破坏后，使细胞间隙形成空腔，木质部薄壁组织也被青枯病菌侵染，侵填体 由导管附近细胞受刺激形成，青枯菌入侵填体，侵填体在破裂后释放进入导管，并在 导管内大量繁殖和快速扩张，由于导管阻塞使植物吸水困难，从而引起植株失水萎蔫 死亡( 苗立祥，2 0 0 9 ) 。 番茄青枯病抗性材料具有多筛孔板结构的主根，多筛孔板的结构能减缓菌体的扩 展繁殖，病菌和根部组织有粘连现象，根细胞壁附近有着较多的浓密的物质，入侵的 青枯病菌则被该物质所包围而被阻止其进一步活动，当青枯菌入侵抗性材料，侵填体 由多筛孔板结构迅速形成，堵塞病菌繁殖导管，病菌的繁殖与扩展则可以得到限制或 减缓( G r i m a l L1 9 9 4 ) 。而感病材料无筛孔板结构，病菌则可较容易的入侵细胞间隙， 细胞壁以及原生质膜被破坏。 2 1 2 番茄青枯病的抗病性鉴定 在番茄抗青枯病病育种和抗性资源筛选的过程中，抗病性鉴定是一个极为重要的 环节，也是选育优良的抗青枯病品种的基础，如何反映材料的抗性水平是抗病性鉴定 的核心。选育作物抗青枯病品种至关重要的是合适的抗青枯病筛选方法。由于青枯病 原菌对外界环境因素特别敏感，所以病原菌的保存增殖、接种浓度、接种方法以及接 种时期不相同，可能使病菌在致病力产生变异，导致接种结果的不一致。如果接种浓 度过大会使经济性状优良、抗性中等的资源被筛选掉，但是接种浓度过小，可能会将 不具抗性或抗性较小的材料误认为是抗性材料。在实际生产中青枯病抗病材料的筛 选，由于接种方法、病菌的株系、接种苗龄、外界环境的温度湿度不同，致使鉴定结 2 番茄抗青枯病自交系选育及其杂交配组实验 果不能重复，影响抗病育种的进程。特别是接种方法对抗性的影响也是很大的( 苗立 祥，2 0 0 9 ) 。 根据在植株上接青枯病菌的位置可以把接种方法划分为茎接法、根接法和叶接 法，除此之外李乃坚等( 2 0 0 0 ) 还发明了水培法，把作物根部的泥巴清洗后，剪去部 分幼根，然后栽于含有青枯菌的水培池内，显著的优点是植株根系接触青枯菌浓度很 均匀，并且极大减少其他土传病害的影响，而且人工控制环境相对比较容易。 李海涛等( 2 0 0 1 ) 认为伤根接种法是幼苗抗青枯病鉴定的首选方法，二叶番茄的 幼苗( 苗龄2 0 d 左右) 最适宜做青枯病苗期抗性鉴定，要选育出优异的抗青枯病番茄 品种，抗青枯病鉴定最好将幼苗期与成株期结合起来进行，番茄对青枯病的抗性机制 比较复杂，遗传背景不太清晰，苗期可能存在抗性分化，番茄中抗及耐病材料易丧失 抗性。 2 1 3 青枯病的分子标记 在番茄青枯病的抗性研究中，已报道的文献包括针对某些菌丝的专化抗性位点和 广谱性位点，D a n e s h ( 1 9 9 4 ) 等通过对F 2 代采用刺茎法和伤根发两种接种方式，得出 的结论如下：刺茎法接种时，显示抗病作用的位点在第6 、7 、1 0 染色体上；在进行伤 根接种时，起抗病作用的位点分布在第6 、1 0 染色体上，1 个抗性Q T L 在第6 、7 、1 0 染色体上分别被发现。T h o q u e t ( 1 9 9 6 ) 对H 矾面i 7 9 9 6 W V a 7 0 0 的F 2 代群体进行接种 鉴定后，使用4 6 2 个R F L P 探针进行基因定位，研究表明其多态性的分布是不均匀的。 除了主效Q T L 位点存在第6 条染色体上外，发现了新的Q T L 位点在第4 条染色体上，而 且所有抗性位点都来源于抗性亲本H a w a i i 7 9 9 6 。M a n g i n ( 1 9 9 9 ) 通过两种不同的分析 方法( 双Q T L 模型和时序分析) ，对H a w a j i 7 9 9 6 W V a 7 0 0 的F 3 代群体进行分析，找到 了第6 条染色体上相距3 0 c M 的2 个Q T L 位点，通过时序分析表明，发病程度与最大L O D 峰移向染色体的近末端的移向程度成正比。Y u i 等( 1 9 9 9 ) 的研究发现了4 个R A P D 标 记与抗性基因连锁，其中标记R A1 2 2 9 ( 1 6 0 0b p ) 和R A1 2 1 3 ( 4 5 0b p ) 与抗性基因 连锁距离最小。W a n g 等( 2 0 0 0 ) 通过对H a w a i i 7 9 9 6 W V a 7 0 0 的F 3 代进行群体分析， 一个效应较大的Q T L 在第1 2 染色体上被发现，主要的抗性位点依旧在第6 条染色体。 B a l a t e r o 等( 2 0 0 0 ) 对H a w a i i7 9 9 6 x W v a 7 0 0 组合1 8 9 个R I L s 接种，使用的青枯菌为 青枯病生理小种1 生化变种3 ，结果得到与抗性基因紧密连锁的1 个R G A 标记和7 个 A F L P 标记，其中A F L P 标记a f 0 2 b a f 0 2 c 与抗性基因连锁紧密。国内研究者寿森炎等 ( 2 0 0 6 ) 对T 9 2 3 0 和T 5 1 A 正进行反交F l 和F 2 代接种分析，研究认为对青枯病菌的抗性 是细胞质遗传，而且受到l 对杂合基因加性控制。用A F L P 的方法对两个亲本以及F 2 代进行分析，筛选到的标记与青枯病基因的遗传连锁距离为6 7 c M ，并将其转化为 S C A R 标记。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 2 1 4 番茄青枯病的相关育种 化学药物被证明对青枯病是无效的( M u r a k o s h ia n dT a k a h a s h i19 8 4 ) ，因此抗青 枯病番茄品种的选育成了防治青枯病唯一有效的手段。使用抗病的砧木来防治青枯病 已经在日本取得了良好的效果( Y a m a k a w a , 1 9 7 8 ) 在世界的其它地方也取得了成功 ( G r i m a u l ta n dP r i o r ，2 0 0 8 ；H a y w a r d1 9 9 1 ；L e ei 9 9 4 ) - O + 美国、日本等国家率先对番茄 抗青枯病开展育种工作，早在1 9 7 4 年发表的K e w a l o ，作抗病亲本是由野生型亚种育成 的，抗性比较理想；从哥伦比亚收集的作抗病番茄和在波多黎收集的小果种在育成了 美国北卡罗莱纳的金星和土星。杂种一代B W N 2 1 是用金星和土星杂交育成的，它具 有比双亲更强的抗性。日本的蔬菜试验场以兴津1 0 1 作抗病砧木，经嫁接后其抗性表 现良好。 在育种方法方面，虽然抗病性状选育的主流方法是常规的系统选育、杂交育种等， 抗病育种中渐渐使用到了远缘杂交育种、诱变育种以及生物技术等新方法，G o p i m o n g ( 1 9 8 5 ) 用杂交育种和射线照射相结合的技术，选育出抗青枯病的花粉不育群体植株： W i l d o m ( 1 9 8 9 ) 利用番茄组织培养得到抗青枯病材料，用不同菌株在田间接种后抗 性较为理想；S a l m e r o n ( 1 9 9 4 ) 得到的番茄青枯病抗性改变的突变体是通过细胞工程 获得的，康耀卫等( 1 9 9 5 ) 利用转座子诱变青枯病菌，获得了青枯菌的突变体，这为 番茄抗青枯病育种提供了基础材料。随着市场上对樱桃番茄消费需求量的日益增加， 广东省马上开展了抗青枯病樱桃番茄品种的培育研究。广东省农业科学院取得的成果 如下，耐病的樱桃番茄品种( 汪国平，2 0 0 3 ) ，如红箭、红樱桃2 号等。湘番茄3 号( 张 战泓，2 0 0 3 ) 是由湖南省蔬菜研究所选育出的，南昌市农科所选育出了洪抗1 号、5 号( 韩海东，2 0 0 1 ) ，抗性也较为理想。 2 1 5 青枯病的生物防治 最近，生物防治已经用到抗青枯病上，比如P y t h i u mo l i g a n d r u m ( P O ) 菌株可以 对番茄的青枯病起到抑制作用( T a k e n a k ae ta l ，2 0 0 8 ) ，P O 菌株有一些优良的生防因 素，包括对植物病原菌有广泛的寄生作用( B e n h a m o ue ta l ，1 9 9 9 ；L e w i se ta l , 1 9 8 9 ) ， 它们可以产生一些抗生素，包括水解酶类，在植物根层周围与植物病原菌进行竞争， 并且诱导植物产生抗性( B e n h a m o ue ta l ，1 9 9 7 ；T a k e n a k ae ta l ，2 0 0 3 ) ，在很多研究中， P O 抑制青枯病主要是通过诱导细胞产生抗性，P O 的细胞壁含有细胞壁蛋白诱导子 ( T a k e n a k ae ta l ，2 0 0 3 ，) 用细胞壁蛋白诱导子对番茄的处理或是用P O 进行接种，使三 个诱导乙烯表达的相关防卫基因的大量增加，都可以引起乙烯水平的瞬间升高( H a s e e ta l ，2 0 0 6 ) ，而且通过野生种和突变种的防卫相关基因表达和生物学鉴定对比分析， 显示P O 诱导的抗性依赖于茉莉酸信号途径的完善( H a s ee ta l ，2 0 0 8 ) 。 4 2 2 番 自1 9 世纪初发现番茄枯萎病( F u s a r i u mo x y s p o r u mf s p 1 y c o p e r s i c i ) 以来，已经 在世界各地广泛分布，成为影响番茄生产进一步发展的重要病害。番茄枯萎病是由枯 萎病菌引起的维管束病害，枯萎病发病期在番茄开花结果期，发病初期茎一侧由下而 上出现了凹陷区，引起一侧叶片发黄，随后植株变褐后枯死；部分植株半个叶序或半 边叶片变黄；部分植株距是由地面近地叶序发病，慢慢向上扩展，除顶端少数几片叶 完好外，其余大多均枯死。湿度大较时，病症部出现一层粉红色霉层，分生孢子梗和 分生孢子是霉层的组成部分。该病的病程进展较慢，植株会在1 5 3 0 d 后枯死，无白 色粘液流出，这有别于青枯( 徐艳辉，2 0 0 8 ) 。 2 2 1 番茄枯萎病生理小种的划分及抗性鉴定方法 大多数研究认为，侵入番茄的枯萎病菌主要有2 个生理小种( G a b e ，1 9 7 5 ；C o n w a y , 1 9 7 8 ；G e r d e m a n n 1 9 5 1 ) 。大多学者认为枯萎病是由显性单基因控$ i J ( B e c k m a n , 1 9 7 2 ) ， 小种l 和2 广泛分布于美国，日本、澳大利亚、加拿大、以色列等地。除此之外J a v i s ( 1 9 7 8 ) 等在美国，G r a t t i d e g e ( 1 9 8 2 ) 在澳大利亚，S a t o ( 1 9 7 4 ) 等在日本先后发现 了新小种，对生理小种l 和2 有抗性的番茄品种却对新发现的生理小种感病，被认为 是生理小种3 。 番茄枯萎病苗期抗性鉴定方法有4 种：土壤接种、灌根、浸根、病原菌毒素的滤 液浸苗。G r a t t i d g e 等在比较4 种方法后得出的结论认为，土壤接种法发病速度慢，浸 根法发病速度快，接种效率高，而且试验结果较稳定，因此国内外在番茄枯萎病抗性 鉴定上主要采用此法。W e l l m a n 等( 1 9 4 0 ) 、陈卫东等( 1 9 8 2 ) 、刘辉等( 1 9 9 1 ) 、G e r d e m a n n 等( 1 9 9 5 ) 等都采用浸根法进行抗性与番茄枯萎病生理小种鉴定。 2 2 2 枯萎病标记的进展 上个世纪9 0 年代，国外报道番茄枯萎病菌( Fo x y s p o r u mf s p 1 y c o p e r s i c i ) 的相关 研究，抗性基因二J 和二2 的R F L P 分子标记已经开发出来( S a r f a t t i ，19 9 1 ；S a r f a t t i ，19 8 9 ) 。 目前在番茄上已找$ U 3 个不同的抗枯萎病的基因( G r a t t i d g ea n dO B r i e n ，1 9 8 2 ； A l e x a n d e ra n dT u c k e r 1 9 4 5 ；B o h na n dT u c k e r ，1 9 3 9 ) ，分别为二J ，厶2 、二3 ，植物自身 的防御系统和病源原物相互作用的A v r 基因相互识别，研究者认为它们的抗性是由显 性或半显性单基因控制的( E l l i se ta l ，2 0 0 0 ；V a n d e re ta l ，2 0 0 2 ) 。 二J 基因抗生理小种1 的特性，该基因被定位到第7 ( B o h na n dT u c k e r ，1 9 3 9 ；P a d d o c k , 1 9 5 0 ) 条和第1 l 条染色体上，但是由于相关信息较少，所以该基因目前还没有被克隆。 二2 基因( 抗生理小种2 的基因) 被分离获得( S i m o n se ta l , 1 9 9 8 ) ，- 2 基因是在醋栗 番茄的ll 号染色体( Sp i m p i n e l l i f o l i u m ) 克隆到的( S t a l l ，1 9 6 5 ) 。- 3 基因先后被R F L P ( T a n k s l e y 。1 9 9 2 ) 、C O S 、A F L P 等多种分子标记找到，但是由于A F L P 、R F L P 成本 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 ，且操作复杂，为了减少劳动强度，而且可以在后代中稳定遗传，通过杂交等手 获得抗性资源是一种最为常见的方法。利用分子标记，筛选抗病资源对加快抗枯 品种选育具有重要意义，它可以大大加速育种的进程。中国研究者拴仓( 2 0 0 8 ) 二2 的基因序列设计特异引物对二2 ，5 鹃1 - 2 5 R ，通过该特异引物对可快速区分出 抗病材料，从而建立了心基因的共显性分子标记。 烟草花叶病毒病 在世界各地均分布有烟草花叶病毒属( T o b a c c om o s a i cv i r u s ) 病毒，葫芦科、茄 科、十字花科等多种作物易被感染并引起严重危害( 薛朝阳等，2 0 0 0 ：雷彩燕等，2 0 0 5 ) ， 而花叶病是由烟草花叶病毒侵染植物引起的病害。 2 3 1 番茄烟草花叶病毒病的症状 植株苗期受害，呈现出浓绿色与淡绿色相嵌的花斑，浓绿部分稍隆起，叶片变得 细长狭窄，叶脉变紫，扭曲畸形，幼叶稍稍歪曲，顶端叶片生长停滞，植株矮缩，下 部多卷叶。感染花叶病植株的花芽分化能力减退，伴有落花、落蕾的现象，植株下部 的果实发育不良，果小质劣，大多呈花脸状，对产量和品质的影响较大。( 郭彩颖， 2 0 0 9 ) 。 2 3 2 烟草花叶病毒的标记进展 目前研究者在番茄中已鉴定出了显性抗病基因有3 个，分别是砌，、T m 一2 和T m 一， ( 又名为T m 丁) ，并找到了与这些基因紧密连锁的标记，此项进展对抗病植株筛选 和基因克隆都是必要和有益的。1 9 8 9 年，部分研究者就用R F L P 技术来分析跟随T m 一2 或T m 夕进入番茄的染色体片段，以T m 一2 座位两侧的R F L P 标记，检测了T m 2 和T m 2 口 品系分别来自1 2 个不同育种材料，发现渗入片段，图距可达5 1 c M ，最短的仅有4 c M 左右。O h m o r i 等( 1 9 9 5 ) 找到了与T m 2 紧密连锁的4 个R A P D 标记，并把O P G 0 9 7 0 0 、 O P B l 2 1 2 0 0 、O P E l 6 9 0 0 、O P l l8 9 0 0 等四个P A P D 标记成功的转化为S C B l 2 1 2 、 S C G 0 9 7 、S C E l 6 9 0 0 和S C l l 8 9 0 0 等4 个S C A R 标记。M o t o y o s h i 等( 1 9 9 6 ) 找N T 两个标 记O P E l 6 9 0 0 和O P N 3 1 1 0 0 0 ，它们与T m 2 紧密连锁，并把其中的6 个克隆测序，通过 S o u t h e r n 杂交分析得出的结论为：一个为单拷贝序列，其余为高拷贝序列或中度拷贝 序列。S o b i r 等( 2 0 0 0 ) 研究了与T m 2 基因紧密连锁的S C 腓记的特征。与T m J 紧密 连锁的6 个R A P D 标记被O h m o r i 等( 1 9 9 6 ) 找到，而且将其高效的转为与T m J 基因共 分离的S C A R 标记。 Y o u n g 等( 1 9 8 8 ) 将与砌夕基因紧密连锁的两个标记转换为探针，对植株后代 的选择提供了方便，在距离T i n - 2 0 4 c M 的进行作图，该探针成为T m 2 口的克隆起点。 D a x 等( 1 9 9 8 ) 通过两个近等基因系T o m 1 R 与T o m 1 S ，找到了长度分别为5 0 0 b p 和 6 番茄抗青枯病自交系选育及其杂交配组实验 4 5 0 b p 的两个共显性R A P D 标记，而且将其高效的转化为稳定的S C A R 标记，这为鉴定 分离群体的纯合性、杂和性提供了一种方便、快速的方法。田苗英等( 2 0 0 0 ) 通过运 用R A P D 技术和B S A 法，找到了一个与T m 少基因连锁的分子标O P D 2 0 1 7 0 0 ，其遗传连 锁距离为7 0 6 7 c M 。D a x 等( 1 9 9 4 ) 利用R A P D 技术找到了标记L A l 7 9 1 ，该标记与T m 2 口 紧密连锁，经研究表明F 2 代符合1 ：3 的分离比例。华中农业大学番茄课题组根据基因 特异序列设计引物，得到了T m 2 8 的基因标记，为番茄的烟草花叶病毒病间的检测了 新的标记( 孙亚林，2 0 0 8 ) 。 3 配合力的初步预测 特殊配合力和一般配合力的概念是由S p r a g u e 等( 1 9 4 2 ) 提出的。配合力是指亲 本杂交后F l 表现优劣的能力。配合力可以划分为一般配合力与特殊配合力两种。一 般配合力的概念是指一个品种、自交系在杂交组合中的产量( 或其他农艺性状) 的平 均值；特殊配合力的概念是指针对所有杂交组合的平均数，特定杂交组合所表现的性 状与平均数相比表现为优良与否的结果( 马育华，1 9 8 2 ) 。R o j 弱等( 1 9 5 2 ) 的研究 表明特殊配合力主要是由非加性效应引起的，一般配合力主要是由加性效应引起的 的。 配合力是衡量杂交组合各性状配合能力的重要指标，也是选择亲本的重要依据。 配合力的分析方法大致有如下几种，如测交法、顶交法以及双列杂交法等( 李加纳， 1 9 9 5 ) 。由于测交法、顶交法只能鉴别参加实验的材料配合力，不能提供材料更多的 遗传信息，现在配合力分析主要用的是双列杂交法。其优点在于应用统计模型后，即 可以推断出特殊配合力和一般配合力，也能对群体的遗传特性有个初步的了解。 在选育品种的过程中，自交系的选育和杂交配组同时进行，但是在自交系尚未纯 合的情况下，在进行杂交配组实验的杂种一代的遗传背景较为复杂，杂种优势具有不 稳定性而且不能完全体现出来，无法对配合力进行精准分析，所以在自交系尚未纯合 的杂交配组实验只能对参与杂交株系的配合力进行初步预测，虽然不是真正的配合力 分析，但是初步测配可以为亲本的杂交组合提供科学依据，让育种者对亲本的配合力 有初步鉴定，为以后的育种工作节省大量的时间，提高了品种选育的效率，为下一步 的配合力分析和品种比较试验奠定基础。 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 第二章番茄抗青枯病自交系选育 目前，病害已经成为番茄生产过程中最大的障碍( 李景富，2 0 0 5 ) ，而青枯病被 称为番茄上的癌症，青枯病在中国南方地区给番茄生产带来了极大的危害，严重制约