梅毒实验检测-检验科.ppt

梅毒的实验室诊断,检验科,梅毒概况,梅毒是由梅毒螺旋体引起的一种慢性、系统性性传播疾病。人体受感染后，螺旋体很快播散到全身，几乎可侵犯全身各组织与器官，临床表现多种多样，且时显时隐，病程较长 中华人民共和国传染病防治法规定要管理的性病是艾滋病、淋病和梅毒，应加以重点防治。卫生部性病防治管理办法则规定除上述3种病以外，还有生殖器疱疹、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎（NGU）、性病淋巴肉芽肿均为监测性疾病 梅毒早期主要侵犯皮肤及粘膜，晚期除侵犯皮肤、粘膜外，还可侵犯心脏血管系统及中枢神经系统等全身各个系统；另一方面，梅毒又可多年无症状而呈潜伏状态,梅毒的分期,一期梅毒：主要表现为单个、无痛性的硬下疳，通常在感染梅毒螺旋体后34周出现 二期梅毒：一期梅毒不经治疗，梅毒螺旋体在几周至几个月后会播散至血液中，引起二期梅毒。二期梅毒的临床表现多种多样，常见的有发热、淋巴结病、弥漫性皮疹、生殖道或会阴湿疣等。一、二期梅毒统称为早期梅毒 三期或晚期梅毒：一般在最初感染的数年至十数年后发生，可累及任何器官，常见的有梅毒瘤性梅毒、心血管梅毒及神经梅毒 隐性梅毒：无症状但梅毒血清学试验呈阳性。分为早期隐性梅毒（病程一年以内）和晚期隐性梅毒（病程一年以上）,生物学特性,梅毒螺旋体即苍白密螺旋体的苍白亚种，人是其唯一宿主。直径0.10.15m，全长7-8m。在电镜下可见有细胞壁和细胞膜。新鲜标本在暗视野显微镜下可观察其形态和活泼的运动方式。 梅毒螺旋体主要有两种抗原：1、密螺旋体抗原即梅毒螺旋体表面的特异抗原，与雅司、地方性梅毒、品他病等3种密螺旋体有共同抗原，可交叉反应。2、非螺旋体抗原即磷脂类抗原，可刺激机体产生反应素，其与牛心肌的心脂质抗原发生反应，此法敏感性高，但有假阳性。 梅毒螺旋体对外界的抵抗力极弱，离体后12小时即死亡，对热和干燥特别敏感，在体外干燥环境下12小时或加1.5经1小即死亡。血液中4放置3天可死亡，因此4血库存放3天以上的血液无传染梅毒的危险。对肥皂水和常用化学消毒剂亦敏感，1%-2%石炭酸内数分钟就死亡。 梅毒的免疫属感染性免疫，有梅毒螺旋体感染时才有免疫力，一旦螺旋体被杀灭，其免疫力随之消失。机体对梅毒螺旋体感染可产生细胞免疫和体液免疫反应，体液免疫中有两种抗体：一种是梅毒特异性抗体，主要是IgG、IgM，对螺旋体有制动作用，当有补体存在时，可将其杀死和溶解，对机体的再感染有保护作用。另一种是抗脂质抗体的反应素，为IgG和IgM的混合物，对机体无保护作用。,期梅毒病人取硬下疳渗出液，期梅毒取梅毒疹渗出液或局部淋巴抽出液。对期梅毒末期以后（大约感染34周以后）的病人可分离血清检查有无梅毒螺旋体抗体和反应素。 检验方法： 1、 显微镜镜检 渗出液涂片后可直接用暗视野显微镜检。直接镜检适合期梅毒的检查。（现已经不常用） 2、 血清学试验 包括非螺旋体抗体和密螺旋体抗体两类 1） 非螺旋体抗体试验（NtrAT） 用正常牛心肌脂质作为抗原，测定病人血清中的反应素。均为初筛试验。 2） 密螺旋体抗体试验（TrAT） 采用Nichols株梅毒螺旋体作为抗原，测定血清中梅毒螺旋体特异抗体，特异性强，可用作梅毒证实试验。,送检标本和检验方法,梅毒的治疗,非口服途径的青霉素可用于各期梅毒的治疗 早期梅毒的治疗首选240万单位苄星青霉素G单次肌肉注射。对青霉素过敏者，替代治疗方案有强力霉素（口服，100mg一次，每日2次，持续2周）或四环素（口服，500mg一次，每日4次，持续2周） 早期隐性梅毒的治疗方案与早期梅毒相同。晚期隐性梅毒的首选治疗方案为每周一次肌肉注射240万单位苄星青霉素G，持续3周；对青霉素过敏者，替代治疗方案有强力霉素（口服，100mg一次，每日2次，持续4周）或四环素（口服，500mg一次，每日4次，持续4周） 合并HIV感染者的治疗方案同晚期隐性梅毒 梅毒瘤性梅毒和心血管梅毒的治疗方案与晚期隐性梅毒相同。神经梅毒的治疗只能采用青霉素，具体方案为静脉注射水溶性青霉素G（每4小时300万400万单位，持续1014天）或肌肉注射普鲁卡因青霉素G（240万单位一天，持续1014天）同时口服丙磺舒（500mg一次，每日4次，持续1014天） 孕妇的治疗只能采用青霉素，青霉素过敏者需经脱敏后再进行治疗,暗视野显微镜检查法：主要的梅毒病原学诊断方法。是最特异的一期梅毒检测方法。取材部位以硬下疳为主，亦可从宫颈、阴道、淋巴结等处取材。阳性可确诊，阴性不能排除梅毒（须在3周内不同的3天采样检测，才能得出阴性结果）。暗视野显微镜法诊断的准确性受操作者的经验、病灶中活螺旋体的数量及口腔、肛门破损处存在的非致病性螺旋体等因素影响 镀银染色法：与暗视野检查法的临床意义基本相同。利用梅毒螺旋体具有亲银性，可被银溶液染成棕黑色，再通过普通高倍显微镜进行观察 直接免疫荧光法（DFA)：是目前国外采用较多的方法，其特异性及敏感性均优于暗视野检查法。将特异性的抗梅毒螺旋体单克隆抗体用荧光素标记，如标本中存在梅毒螺旋体，则通过抗原抗体特异性结合，在荧光显微镜下可见到发苹果绿色的梅毒螺旋体。此法可区分梅毒螺旋体和其他非致病性或条件致病性螺旋体,梅毒的病原学检测（一）,聚合酶链反应（PCR）：PCR能对生殖器溃疡进行早期的鉴别诊断，区分梅毒、生殖器疱疹和软下疳。它又可分为PCR和RT-PCR。PCR的设计主要针对编码梅毒螺旋特异性抗原和TpN47的DNA开放编码区，常见的引物有K03A、K04、47-1、47-2、47-3、47-4等。由于在PCR中会偶然出现非特异的PCR产物而干扰结果，这就必须用特异性的DNA探针进行DNA-DNA杂交来提高PCR的特异性及敏感性。此外，由于TpN47的保守性，雅司螺旋体可产生类似的PCR产物，所以这种设计的PCR不能区分梅毒和雅司；但可以区分梅毒螺旋体和引博氏疏螺旋体，这就可以解决梅毒与莱姆病之间血清诊断中的免疫交叉问题。另一种是RT-PCR，常见的设计是针对梅毒螺旋体的16s rRNA 366bp片段，这种方法污染少，特异性敏感性高，但价格稍高。PCR在梅毒持续感染中的诊断价值目前尚无一致意见，理论上PCR可查出死亡的TP，所以治疗后PCR阳性并不意味着治疗失败，但死亡的TP从机体内清除较快（1530天），而存活的TP从机体内清除至少需120天，所以治疗数周后PCR阳性意味着持续感染的可能 。此外，也有将PCR用于产前诊断和神经梅毒诊断的报道,梅毒的病原学检测（二）,人类对梅毒无先天免疫性，尚无疫苗接种进行人工免疫，仅能在受感染后产生感染性免疫。已完全治愈的早期梅毒患者仍可以再感染 感染梅毒后，首先产生IgM型抗梅毒螺旋体抗体，感染2周后即可测出，早期梅毒抗梅治疗39个月后或晚期梅毒治疗2年后，大部分病人IgM可转阴性，再感染时又出现阳性，故IgM型抗体的存在是活动性梅毒的表现 感染梅毒4周左右产生IgG型抗梅毒螺旋体抗体，即使经足量抗梅治疗，梅毒螺旋体抗原消失后很长时间，IgG抗体仍可通过记忆细胞的作用继续产生，甚至终生在血清中可测出,梅毒的免疫性（一）,梅毒的免疫性（二）,另一种具有抗体性质的物质叫反应素（reagin），是梅毒螺旋体破坏人体组织过程中释放出的一种抗原性心磷脂刺激机体所产生的抗体。反应素一般在感染后57周（或下疳出现后23周）产生。经正规治疗后可逐渐消失 胎儿在宫内感染梅毒螺旋体后，胚胎晚期（69个月）已能合成IgM型抗体，出生后第3个月开始形成IgG型抗体；IgM抗体不能通过胎盘，而IgG抗体能通过胎盘，如在患儿血清中检侧出IgM抗梅毒螺旋体抗体是诊断先天性梅毒的有力证据（但IgM阴性并不能排除先天性梅毒）,NTrAT非梅毒螺旋体抗原血清试验：是以心磷脂、卵磷脂及胆固醇作为抗原检查血清中的反应素，用于初筛试验及疗效观察。可以分为以下四种试验，原理基本相同 1、性病研究实验室玻片试验（VDRL) ：试剂需现配现用，且要在显微镜下观察结果，故国内实验室很少采用。但VDRL是诊断神经性梅毒最特异的血清学方法 2、不加热血清反应素试验（USR)：试剂无需现配现用，但仍要在显微镜下观察结果，现已很少使用 3、快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR)：在特制的纸片上进行，加入一定量特制的炭粉，可使抗原抗体出现凝集，用肉眼可观察结果 4、甲苯胺红不加热试验（TRUST)：在试剂中以红色的甲苯胺红颗粒代替黑色的炭粉颗粒，使结果更易于观察,非特异性梅毒血清学试验（一）,非梅毒螺旋体抗原血清试验的缺陷 1、特异性：在多种疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、结缔组织病、肿瘤、静脉吸毒者、老年人以及怀孕妇女中均可出现反应素，所以此类试验有时会出现假阳性反应 2、敏感性：感染梅毒后反应素的出现时间晚于特异性梅毒螺旋体抗体，因此非梅毒螺旋体抗原血清试验对一期梅毒的漏检率较高。RPR或TRUST有时出现弱阳性或阴性结果，而临床上又像二期梅毒，此时应将此血清稀释后做定量试验，如出现阳性结果，则为抗体过量引起的“钩状效应”，12的二期梅毒病人可出现此现象而发生假阴性反应。此外，晚期梅毒反应素转阴率高，再加上这类试验对隐性梅毒也不太敏感，因此用此类试验进行梅毒筛查时，存在着相当数量的漏检 非梅毒螺旋体抗原血清试验的优点 1、非梅毒螺旋体抗原血清试验阳性的患者往往是梅毒现症感染者，临床上即可开展治疗 2、非梅毒螺旋体抗原血清试验表现为滴度随成功的治疗而逐渐下降，故可以作为疗效观察的指标 3、此类方法价格低廉,非特异性梅毒血清学试验（二）,测定非梅毒螺旋体抗原血清试验的滴度进行疗效观察 1、治疗成功：早期梅毒患者在治疗后6个月内症状消失且非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度有至少4倍的下降。晚期梅毒或隐性梅毒患者在治疗后1224个月内非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度有至少4倍的下降 2、治疗失败：治疗后症状持续或重新出现；治疗后非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度反而上升了4倍或以上；非梅毒螺旋体抗原血清试验初始滴度较高（1:32或以上）但在六个月内没有达到4倍的下降。抗梅毒治疗失败的病人应考虑合并HIV感染及神经梅毒的可能性 3、血清固定：经正规治疗后，梅毒患者非梅毒螺旋体抗原血清试验一般都会转为阴性，但有13%的病人即使经足量抗梅治疗，非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度仍持续呈低滴度阳性，这种现象称为血清固定，其原因尚不明了。血清固定患者的滴度重又上升则提示再次感染梅毒,非特异性梅毒血清学试验（三）,TrAT梅毒螺旋体抗原血清试验：用梅毒螺旋体作为抗原检测血清中的抗螺旋体IgM和/或IgG抗体，其敏感性和特异性均高于非梅毒螺旋体抗原血清试验，但不能用作疗效观察的指标。常用的有以下五种方法： 1、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS) 2、梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA） 3、梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA) 4、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA） 5、梅毒螺旋体化学发光免疫测定（TP-CLIA) 6、梅毒螺旋体快速诊断试验（TP-RT）,特异性梅毒血清学试验（一）,荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS) FTA-ABS是所有螺旋体试验中最敏感的方法，特异性也很高，被认为是检测梅毒的“金标准”。且该试验可分开检测IgM和IgG 但是，该方法在技术操作上也是最困难的，试验的操作以及结果的判读都必须加以核实。试验可靠性的关键是标准化的结果判断、高质量的荧光标记抗体以及适当的稀释度。由于实验室操作繁琐以及主观判读经常产生错误结果，因此增加标记荧光标记染料的复染可以减低标准化过程中的错误并增加其可读性及重复性 由于该试验需有优质的荧光显微镜和技术熟练的操作人员才能得到准确的结果，故常不被临床实验室作为常规方法开展,特异性梅毒血清学试验（二）,梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA） 原理： 用超声裂解的梅毒螺旋体为抗原，致敏经醛化、 鞣化的羊或禽类红细胞，此致敏红细胞与人血清 或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可观 察的凝集反应 优点：该方法比FTA-ABS易操作且稳定性好，它的敏感 性除早期梅毒外与FTA-ABS相似，对大样本进行 批量检测时，TPHA也比FTA-ABS易操作 不足：由于红细胞具有生物活性，可能产生非特异性凝 集，且保存时间较短，批间差较大，故实际使用中 也存在一些问题,特异性梅毒血清学试验（三）,梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA） 原理： TPPA的原理与TPHA基本相同，但它以人工合 成的惰性明胶颗粒代替TPHA中的红细胞作为载 体，是TPHA的升级产品 优点： 1、试剂稳定，批间差小 2、结果判读更为清晰明确 3、敏感性和特异性较TPHA进一步提高 不足：较难实现自动化，结果判定主观,特异性梅毒血清学试验（四）,梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA） 原理：以梅毒螺旋体抗原包被聚丙乙烯板，再加入待检 血清以及酶标记抗原，形成双抗原夹心，同时检 测 IgG和IgM抗体。少数试剂采用间接法，使用 酶标记抗人IgG或IgM，分开检测IgG或IgM 优点：1、敏感性和特异性较高 2、价格较低，适合于对大量样品的筛查 3、可实现操作的自动化、客观化 不足：ELISA试剂盒品牌众多，各家采用的抗原和工艺 不同，使敏感性和特异性产生较大的差异，临床 实验室在选用ELISA试剂前应认真进行评估,特异性梅毒血清学试验（五）,酶联免疫吸附试验检测梅毒螺旋体IgM抗体 原理：ELISA间接法或捕获法，以捕获法的敏感性和特 异性为佳。由于血液中 IgG 的量大大高于 IgM， 为避免交叉反应所引起的假阳性，一般须对样本 进行预处理，先去除其中的 IgG 然后再进行IgM 测定。分离去除 IgG 的常用方法为柱层析法或免 疫沉淀法（沉淀剂为抗人IgG等） 用途：1、先天性梅毒的诊断 2、活动性梅毒（新近感染）的诊断及疗效观察 3、梅毒再感染的诊断 结果解释：IgM阳性是先天性梅毒或活动性梅毒的重要证 据，但阴性结果并不能排除感染的可能性,特异性梅毒血清学试验（六）,梅毒螺旋体化学发光免疫测定（TP-CLIA） 原理：目前以微孔板式的化学发光免疫测定最为常见，其原理与ELISA方法基本相同，只是以化学发光底物取代了发色底物，检测的信号则由光密度（A值）变为光子数 优点：较之ELISA方法，其分析敏感性更低，可报告范围更宽 不足：与ELISA试剂盒的不足基本相同,特异性梅毒血清学试验（七）,梅毒螺旋体快速检测试验（TP-RT） 原理：双抗原夹心免疫层析试验或间接法免疫渗滤试验， 多采用胶体金进行标记，同时检测IgG、IgM抗体 （双抗原夹心法）或单测IgG抗体（间接法） 优点：1、简便、快速，不需要特殊的仪器 2、适合于单人份操作，可用于较紧急和实验室条 件差的场合 不足：1、临床评估资料不多，敏感性、特异性尚有待进 一步考查 2、无法实现自动化，结果判断主观 3、测定结果受温度和时间的影响较大 4、价格较高,特异性梅毒血清学试验（八）,免疫印迹试验,梅毒的免疫印迹试验（Western blot）与作为HIV抗体确认的免疫印迹试验采用相同的原理和技术 既可检测IgG抗体，也可检测IgM抗体 目前已有商品化的试剂盒供应，但价格高昂 检测特异性的梅毒抗体条带，其分子量分别为15.5、17、45.5和47kd 梅毒IgG免疫印迹试验的敏感性和特异性均可达到甚至超过FTA-ABS的水平 有文献报道，梅毒IgM免疫印迹试验对先天性梅毒的诊断可能很有意义，其特异性至少达到90%，而敏感性达83%以上，高于FTA-ABS 19S IgM 73%的水平,方法学比较,1. 非螺旋体抗体试验（NtrAT） 这类方法敏感性高，其抗体滴度与病变活动性有关，病灶出现后1-2周就可测出反应素，期梅毒阳性率约为70%，期梅毒阳性率可达100%，期梅毒阳性率较低，先天性梅毒阳性率可达80%-100%，但此类试验特异性不高，常有假阳性反应。因此，在分析结果时应结合病史和临床症状，并做密螺旋体抗原试验加以确诊。 2. 密螺旋体抗体试验（TrAT） 1） TPHA（梅毒螺旋体血凝试验） 是一种间接血凝试验，以SRBC为载体，将梅毒螺旋体Nichols株，经纯化后超声击碎成密螺旋体抗原，致敏SRBC，加入待检病人血清作间接血凝试验，具有敏感性高，快速，简便，易于观察等特点。 2） TPPA（梅毒螺旋体明胶凝集试验）与TPHA基本相同。 3） WB（免疫印迹试验） 是分子水平的试验，本法综合了SDS-PAGE的高分辩力和ELISA的高特异性和敏感性，对梅毒的确诊，尤其对早期梅毒的确诊具有特殊的价值，对二期，三期梅毒的诊断率很高。 4） FTA-ABS（荧光密螺旋体抗体吸收试验）为间接荧光抗体检测法。本法敏感性和特异性均高，是期，期梅毒首先出现阳性反应的血清学试验，且病人经药物治疗后，反应仍不转阴，可用于确诊但不能用作疗效评价。 密螺旋体抗原试验的特异性虽强，但仍不能区分雅司、地方性梅毒、品他病，也可有1%生物学假阳性存在。因此，这些试验的结果的判定，仍需结合临床资料来分析。,梅毒血清学试验假阳性的原因,非梅毒螺旋体抗原血清学检测试剂评估结果,参比试剂：美国BD公司生产的RPR试剂盒（批号8095883）,梅毒螺旋体抗原血清学检测试剂(ELISA)评估结果,参比试剂：日本富士公司生产的TPPA试剂盒（批号VN80807） + 免疫印迹法（批号D081009A1）,梅毒螺旋体抗原血清学检测试剂(快速法)评估结果,参比试剂：日本富士公司生产的TPPA试剂盒（批号VN80807） + 免疫印迹法（批号D081009A1）,关于梅毒血清学试验程序的探讨（一）,先以非梅毒螺旋体抗原血清试验（RPR、TRUST等）进行初筛，再以梅毒螺旋体抗原血清试验（TPPA、TPHA、ELISA等）进行确认 优点：非梅毒螺旋体抗原血清试验价格低廉，使梅 毒检测的成本可以保持在低水平 缺点：非梅毒螺旋体抗原血清试验的敏感性较差， 导致临床上易出现漏检的情况 同时进行梅毒螺旋体抗原血清试验和非梅毒螺旋体抗原血清试验 优点：这是从技术上而言的最佳方案 缺点：人力和试剂成本较高 先进行梅毒螺旋体抗原血清试验，阳性时再进行非梅毒螺旋体抗原血清试验,关于梅毒血清学试验程序的探讨（二）,TrAT梅毒螺旋体抗原血清试验（TPPA等）,关于梅毒血清学试验程序的探讨（三）,一些适合使用梅毒螺旋体抗原血清试验 (TPPA等)进行筛查的情况： 皮肤、性病门诊 输血前检查 手术前检查 入院检查 产前检查 检验检疫,先天性梅毒的诊断,先天性梅毒的诊断要结合临床表现、物理检查、影像检查、血清学检查和直接显微镜检查进行综合判断 先天性梅毒的临床症状主要包括鼻音、肝脾肿大、皮损、骨软骨炎等，50%的梅毒患儿出生时无异常表现，多数在3周至6个月时出现上述症状中的一项或几项。可能更晚出现（2年以后出现）的其它特征有畸型、耳聋、失明、弱智等 由于母体的螺旋体直接进入胎儿的血循环，因此先天性梅毒均直接表现为二期梅毒 从脐带、胎盘、新生儿皮损处采样，在显微镜下直接检查到梅毒螺旋体可确诊断先天性梅毒 新生儿的梅毒抗体滴度若高