花药培养及单倍体育种.ppt

第七章 植物花药和花粉培养及 单倍体育种,第一节 单倍体及单倍体育种 第二节 花药培养和花粉培养,一、单倍体的概念及其来源,1、概念 单倍体(haploid)：是指具有配子体染色体数（n）的孢子体(植物个体)。 单倍体有一元单倍体和多元单倍体。,第一节 单倍体及单倍体育种,南瓜的单倍体和二倍体的雄花和雌花,单倍体植物的特点：,体细胞染色体数减半； 生长发育弱，体形小、各器官明显减小； 雌、雄配子严重败育，有的不能进入有性世代。,2、单倍体的来源,双单倍体(Double Haploid, DH) 指单倍体经过自然加倍或人工诱导加倍所获得的纯合二倍体。,双二倍体(Double Diploid) 指杂交F1代个体经过人工诱导加倍所获得的纯合多倍体（双亲的单套染色体组均加倍）。,二、单倍体育种,1、概念 单倍体育种：是将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯合二倍体，从中选出具有优良性状的个体，作为杂交育种的原始材料，称为单倍体育种。,2、单倍体的优点 遗传的稳定性，经人为加倍，可得到纯和的二倍体 。 隐性性状易于表现。 遗传的变异性。,3、单倍体在遗传和育种中的应用价值,（1）迅速获得纯合型材料，缩短的育种年限。 与常规的杂育种相比，单倍体育种技术可以加速纯系的获得，缩短4-5年的育种年限。,（2） 排除显、隐性干扰，提高选择效率，有利于筛选隐性突变体，消除致死基因。,当有 n 对独立遗传的隐性基因及重组体分离时，这些隐性性状及其重组体的出现几率在单倍体育种中将比常规的二倍体育种法高 2 倍，大大提高了选择效率。,与诱变育种相结合可以提高诱变频率，遗传类型丰富； 也可在花药培养过程中进行抗病、耐盐碱等方面进行细胞水平的突变体筛选。,（3）单倍体是诱变育种、突变体筛选的良好材料。,（4）单倍体在远缘杂交中的利用。,与细胞融合相结合 二倍体。 克服远缘杂交不育性：远缘杂交后代高度不育，但可产生部分有活性的花粉。,基因工程上：花药和花粉培养系统可用于转基因。 染色体工程上：可以创造二体附加系、代换系。,（6）单倍体用作基础遗传研究的各个领域。 基因定位、绘制遗传图谱。,（5）单倍体作为遗传工程受体更为有效。,第二节、花药培养和花粉培养,花药培养（anther culture）： 以花药为外植体进行离体培养，获得单倍体植株的技术。（属于器官培养的范畴。） 花粉培养（pollen culture）或小孢子培养（microspore culture）： 是将处于一定发育阶段的花粉细胞从花药中分离出来，加以离体培养获得单倍体植株的技术。（属于细胞培养的范畴。）,两者的异同点,共同点：培养目的相同，获得单倍体植株。 不同点：花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养；花粉培养没有药壁组织干扰，易于观察雄核发育的全过程，技术更复杂。,一、花粉的发育过程,花药的发育阶段,幼花粉囊,成熟花粉囊,单核花粉粒（小孢子）的形成,雄配子体（成熟花粉粒）及 雄配子（精子）的形成,成熟的花粉粒即为雄配子体，其中的精细胞为有性生殖中的雄配子。 大多数被子植物(约70%)发育到2-细胞花粉粒时期花粉粒即发育成熟，如百合、棉花等。 也有少数植物其生殖细胞再进行一次有丝分裂形成2个精细胞，即花粉粒成熟时含有3个细胞，为3-细胞花粉粒，如向日葵、小麦等。,烟草,拟南芥,2细胞花粉 3细胞花粉粒,雄配子体的发育,二、花药培养,花药培养的一般程序 材料准备 花药接种及诱导培养 分化培养 生根、壮苗培养及驯化移植 单倍体植株的鉴定及其二倍化,1、材料准备,（1）供体材料选择： 供试材料的遗传背景：选择易培养的材料、杂合性的材料。 供试材料的生理状态：开花期的早晚、生长环境、营养状态等。,（2）花粉的发育时期选择： 只有花粉发育到一定时期对离体培养最敏感，才可能被诱导产生愈伤或胚状体。 一般情况下，对大多数植物来说，在单核期的花粉比较容易培养成功。 单核中晚期到有丝分裂期是最适培养时期。,花粉发育简图,对花药培养适宜时期的解释,一，认为小孢子有丝分裂形成成熟花粉的初期是胚胎形成的临界期，若在接种时花药发育已超过了此阶段，胚状体就不能形成。 二，认为小孢子发育过程中花药内源激素平衡在不断改变，随花药的成熟，激素平衡变得不适合小孢子的生长和分裂，或脱分化必须的一些物质被消耗尽，从而引起培养效果不佳。,花粉发育时期的确定,鉴定花粉发育时期的方法可用涂片法来进行。 为方便起见，可找出与花粉发育时期相对应的形态学指标。,（3） 花药预处理,预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。大量试验证明，花药培养前的预处理可以提高诱导频率与分化率。 预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括物理因素处理和化学因素处理。,烟草、茄子 35C 3d 水稻 10C 1014d 柑橘 3C 510d 马铃薯 4C 2d 小麦 13C 714d,低温处理：是最常用的一种预处理方法。,：物理因素处理,低温处理的作用 降低了小孢子新陈代谢，延长花粉的寿命,中断正常的配子体发育，促进花药营养成分的转运； 低温能改变纺锤丝的轴向, 破坏纺锤丝的微管蛋白而阻止纺锤丝形成，打破有丝分裂正常过程, 导致细胞分化； 阻止了细胞在预处理时的细胞周期，一旦培养在25度-28度下重新返回有丝分裂； 低温、饥饿胁迫作用。,高温预处理： 小麦：32-33C，培养38d，再转到26-28C正常培养。 油菜：30C，培养23d 玉米：30C，14d，再转到27C培养，能促进体胚的形成 。,射线处理：Y射线 、激光 、氦氖原子等。 离心法 毛叶曼陀罗：离心+低温处理 小麦：接种前幼穗2000转/min，20min,：化学因素处理,供体植株预处理 ：乙烯 、化学杀雄剂。 添加到培养基中的预处理： 水稻：秋水酰碱、乙烯利+低温处理 小麦：放线菌素D，处理1-2d,甘露醇预处理：是最常用的一种化学预处理方法。 方法：将花药或游离收集的花粉粒，先培养在甘露醇水溶液中适宜的时间，再转入正常的诱导培养基中进行培养。 优点：缩短了花药的预处理时间，促进花粉粒的释放，可在一般条件下进行。 大麦花药：32g/L甘露醇，4d，效果优于4，14d的低温处理。,甘露醇预处理的作用 不易降解, 通过维持细胞内部渗透压的平衡。 比低温预处理明显提高花药存活率。 一定的渗透压可以破坏前胚期细胞的胞间连丝。,温度和甘露醇预处理能引发饥饿作用。推论碳饥饿是启动雄核发育的重要因素。 预处理引发了小孢子细胞内源激素、酶活性等一系列生理生化变化，可能作为一个信号或刺激启动小孢子发育方式的转换，导致小孢子细胞离开配子体发育途径而转向孢子体发育途径。,2、花药接种及诱导培养,（1）表面消毒和接种 接种前，需要对预处理过的幼穗或花蕾进行表面消毒。通常对整个幼穗或花蕾进行消毒处理，消毒后的材料应立即接种。 在超净工作台上，小心剥取整个花药，接种于培养基中。,接种密度,花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此，每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。 大麦：60枚/ml 小麦：2040枚/ml,（2）诱导培养基的选择,花药培养常用的基本培养基 MS 、Nitsch ：大多数双子叶植物 N6：禾谷类作物 B5：十字花科和豆科植物 C17：小麦、大麦和高粱,烟草和毛曼陀罗：仅含蔗糖的琼脂板 茄子花药培养中： MS2,4-D 0.5 mg/LKT 1mg/L n 93.8% 2n 6.2% MS2,4-D 2 mg/L KT 1mg/L n 64,1% 2n 35.9%, 激素选择,烟草和油菜：23诱导花粉胚； 水稻：36诱导愈伤，分化时23； 小麦：811麦芽糖诱导愈伤，分化时58蔗糖； 玉米：1215诱导愈伤； 甘蔗：高达20。, 蔗糖：一般为315,NO3-离子及NH4+离子的含量及比例对雄核发育有很大影响，降低培养基中铵态氮的浓度对培养有利； 一些有机N源，如谷氨酰胺、复合氨基酸可促进培养效果。, 氮源,活性炭 烟草：1活性炭可使花粉植株的产量提高12倍。,其它 琼脂糖、马铃薯提取液、水解乳蛋白、酵母提取物等可以提高诱导效果。,培养方式： 固体培养 半固体培养 液体培养 固液双层培养 条件培养,（3）培养方式和培养条件,利用条件培养基进行的培养为条件培养。 “条件培养基”：预先培养过其它组织的液体培养基，以此培养基进行培养可以提高培养效率。,温度：大多数控制在2528。 光照：诱导期间，以暗培养或散射光培养；分化阶段，一般在光下培养。, 培养条件,3、分化培养,方法：将诱导形成的直径1.5-2mm大小的愈伤组织或胚状体及时转入固体分化培养基中，诱导不定芽分化或促进胚状体发育成苗。 分化培养基：一般去掉或降低2,4-D浓度，降低蔗糖浓度至3%。 培养条件：25 ，光照10-14h/d。,4、生根、壮苗培养及驯化移植,生根培养：将分化出的芽苗转入含NAA的生根培养基中，一般2周左右可形成根。 烟草花粉植株的生根培养基： 1/2 MS + 2%蔗糖 + 0.5%琼脂。 壮苗培养：在生根培养基或基本培养基中添加多效唑（1-3mg/L），提高蔗糖浓度（5-8%）。 培养条件： 25 ，光照下。,生根壮苗后，花粉苗形成具有根茎芽的完整植株，生长健壮，经过5-7d的炼苗后可以移植到营养钵或苗床上，管理至成活。 夏季高温季节试管苗可储藏于4-6 下越夏，至秋季移栽。,花粉植株的驯化移植,5、单倍体植株的鉴定及其二倍化,（1）花药和花粉植株的倍性 在花粉植株群体中，除单倍体外，还有二倍体、多倍体和非整倍体，单倍体所占比例不高。 花药植株倍性混杂的原因 ： 体细胞干扰 生殖细胞的自发加倍 培养过程的各种影响因素,（2）单倍体植株的鉴定,形态鉴定：根据植株外貌形态，结实性，花粉粒、气孔大小等鉴定 。 细胞学鉴定：取根尖、茎尖或幼叶，采用压片法，根据细胞有丝分裂中期染色体数目和行为鉴定。,（3）单倍体植株的二倍化,加倍时间：培养阶段或移栽成活后。 常用的化学诱变：秋水仙素 处理部位 ：根、分蘖节 、生长点 使用浓度：试管外0.020.4，培养基中250mg/L或用0.010.1处理后培养。 处理时间：数小时到几天。,三、花粉培养技术,花粉培养（pollen culture）：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。 从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。,1、花粉或小孢子的分离,2、花粉培养方式,液体浅层培养 平板培养 看护培养 微室培养 固-液双层培养 条件培养,培养密度：104105 个/ ml,培养方法,四、影响离体花药和花粉培养的其他因素,药壁因子： 花粉胚发育过程中药壁起着重要作用，在看护培养、条件培养中，花药及花药浸提液，能显著的刺激、促进花粉胚的形成。,花粉的“二型性”：,天然花粉群体（同一花药）中，存在两类不同的花粉。一类为正常花粉，它们的细胞质较浓，发育较一致，染色较深；另一类为异常花粉，其特征是花粉体积较小，细胞质较淡、染色较浅，发育迟缓 (Dunwell，1992)。 Sunderland等在研究花药培养的发育途径中发现后一类花粉具有雄核发育能力，形成花粉胚，因此称为胚性花粉或E花粉 。,禾谷类植物花粉植株中的白化苗现象 ：,遗传上的原因：白化苗含有质体基因组的大量缺失, 而且核基因也影响白化现象。 生理上的原因：培养基的成分、培养温度、花粉发育时期等对白化苗的形成有影响。,1、培养初期小孢子的发育途径,五、离体培养下小孢子的发育途径,第一次分裂为均等分裂，形成两个等同的子细胞，以后不断发育，都参与孢子体的发育。营养核和生殖核区分不明显。 如，在毛曼陀罗、水稻、小麦等植物上存在 。,途径： 小孢子发育途径,第一次有丝分裂通过正常的非均等分裂形成一个生殖核、一个营养核。由营养核进一步发育形成单倍体植株。 如，在烟草、大麦、水稻、小麦、甜椒等植物上普遍存在。,途径： 营养核发育途径,第一次有丝分裂通过正常的非均等分裂形成一个生殖核、一个营养核。由生殖核进一步发育形成单倍体植株。 如，在天仙子中。,途径： 生殖核发育途径,第一次有丝分裂通过正