人参皂苷的提取.doc

第一章 综述1.1 人参皂苷的简介 人参为五加科植物人参(Panax ginseng C.A.Mey. )的干燥根，是传统名贵中药，始载于我国第一部本草专著神农本草经。其栽培者称为“园参”，野生者称为“山参”。人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神之功能，用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、内热消渴、久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷、心力衰竭、心源性休克等的治疗。人参的化学成分很复杂，有皂苷、挥发油、糖类及维生素等。经现代医学和药理研究证明，人参皂苷为人参的主要有效成分，它具有人参的主要生理活性。人参皂苷（ginsenoside，GS)是人参的主要有效成分，现已明确结果的GS单体约有40余种；在人参中的含量在4%左右。其中研究最多且与肿瘤细胞凋亡最为相关的为Rg3与Rh2。众多研究表明，它具有较高的抗肿瘤活性，对正常细胞无毒副作用，与其他化疗药物（如顺铂）联合应用有协同作用。人参皂苷通过调控肿瘤细胞增殖周期、诱导细胞分化和凋亡来发挥抗肿瘤作用。将肿瘤细胞诱导分化成正常细胞有利于控制肿瘤发展，诱导肿瘤细胞凋亡使细胞解体后形成凋亡小体，不引起周围组织炎症反应。Popovich等研究认为，人参皂苷可以促进人白血病细胞的凋亡，其途径与地塞米松相识，均为受体依赖性。目前我国对人参皂苷的提取分离方法、制剂工艺、抗肿瘤作用机制以及临床应用等方面做了大量研究，而且已经有人参皂苷的新产品推向市场。1.2 人参皂苷成分人参的根、茎、叶、花及果实中均含有多种人参皂苷(ginsenosides)。到目前为止，文献报道从人参根及其它部位已分离确定化学结构的人参皂苷有人参皂苷-Ro、-Ra1、-Ra2 、-Rb1、-Rb2、-Rb3、-Rc、-Rd、-Re、-Rf、-Rg1、-Rg2、-Rg3、-Rh1、-Rh2及-Rh3 等50余种人参皂苷。Rh2：具有抑制癌细胞向其它器官转移，增强机体免疫力，快速恢复体质的作用。对癌细胞具有明显的抗转移作用，可配合手术服用增强手术后伤口的愈合及体力的恢复. Rg：具有兴奋中枢神经，抗疲劳、改善记忆与学习能力、促进DNA、RNA合成的作用。 Rg1：可快速缓解疲劳、改善学习记忆、延缓衰老，具有兴奋中枢神经作用、抑制血小板凝集作用。 Rg2：具有抗休克作用，快速改善心肌缺血和缺氧，治疗和预防冠心病。 Rg3：可作用于细胞生殖周期的G2期，抑制癌细胞有丝分裂前期蛋白质和ATP的合成，使癌细胞的增殖生长速度减慢，并且具有抑制癌细胞浸润、抗肿瘤细胞转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长等作用。Rb1：西洋参(花旗参)的含量最多，具影响动物睾丸的潜力，亦会影响小鼠的胚胎发育，具有增强胆碱系统的功能，增加乙酰胆碱的合成和释放以及改善记忆力作用. Rb2：DNA, RNA 的合成促进作用、脑中枢调节具有抑制中枢神经，降低细胞内钙，抗氧化，清除体内自由基和改善心肌缺血再灌注损伤等作用. Rc：人参皂甙-Rc是一种人参中的固醇类分子。具有抑制癌细胞的功能。可增加精虫的活动力. Rb3：可增强心肌功能，保护人体自身免疫系统。可以用于治疗各种不同原因引起的心肌收缩性衰竭. Rh：具有抑制中枢神经、催眠作用，镇痛、安神、解热、促进血清蛋白质合成作用. Rh1：具有促进肝细胞增殖何促进DNA合成的作用，可用于治疗和预防肝炎、肝硬化. Ro：具有消炎、解毒、抗血栓作用，抑制酸系血小板凝结以及抗肝炎作用活化巨噬细胞作用.1.3人参的药理作用1.3.1对中枢神经系统的作用 人参能调节中枢神经系统兴奋过程和抑制过程的平衡。通过人参对动物脑电活动影响的研究，结果表明：其对兴奋和抑制两种神经过程均有影响，但主要加强大脑皮层的兴奋过程。由于同时作用于抑制过程，故使抑制趋于集中，使分化加速且更完全。人参可调节神经功能，使紧张造成紊乱的神经过程得以恢复。人参皂甙 Rb 类有中枢镇静作用，Rb1、Rb2、Rc 混合皂甙具有安定作用；Rg 类有中枢兴奋作用。人参皂甙对中枢的影响为小剂量兴奋，大剂量抑制。人参水浸剂5g/kg腹腔注射能明显减少小鼠的自发活动。人参水浸剂亦能对抗可卡因、士的宁及戊四氮所致惊厥，并能降低惊厥死亡率。有报告指出，人参粗制中性皂甙既有镇静安定作用，亦有镇痛、肌松和降温作用。人参对学习记忆的影响有双向性及成分依赖性。大鼠口服人参浸膏20mg/kg，连续3天，易化了大鼠Y-迷宫实验中30分钟学习获得和24小时记忆保留，但是剂量加大至100mg/kg，则学习记忆不但没有改善，反而损害了某些学习记忆指标。人参提取物可防止应激所致的小鼠学习能力的下降。有报告认为，人参提取物对樟柳碱和戊巴比妥钠造成的记忆获得不良有拮抗作用，亦能改善环己酰亚胺和亚硝酸钠造成的记忆巩固障碍及40乙醇造成的记忆再现缺陷。用人参茎叶皂甙200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg 给小鼠腹腔注射，可明显对抗樟柳碱的作用和改善小鼠的记忆，增加脑内的RNA，但对DNA和蛋白质含量无明显影响。人体实验证明：人参能提高工作能力，减少疲劳，并认为这是其兴奋中枢的结果。其作用强度超过苯丙胺，但无苯丙胺的缺点。服用人参，可提高思维能力和劳动效率。动物实验表明：人参能显著延长小鼠游泳的持续时间。先用各种方法使小鼠体力衰竭，然后给服人参，证明人参能明显加速其体力的恢复，增加运动能力。人参可使兴奋过程的疲惫性降低，表现为神经兴奋过程的灵活性加强，使神经疲惫程度降低，从而可消除各种无力综合征，显示抗疲劳作用。亦有报告认为，人参抗疲劳作用的机制可能与其升高血脂和促进蛋白质、RNA 合成有关。人参中含有的多种皂甙、人参多糖及人参挥发油具有抗肿瘤作用。红参中人参皂甙能使癌细胞再分化、诱导逆转为非癌细胞。人参茎叶总皂甙可抑制体外培养人胃癌细胞的生长速度和分裂能力，增加细胞内糖原含量，降低细胞内粘多糖和酸性磷酸酶活性，起到一定的阻碍胃癌细胞生长及增殖的作用。人参花、叶二醇组皂甙在体外亦有一定的抗肿瘤作用。人参地上部分挥发油成分能使体外培养的胃癌和肝癌细胞数减少、生长受到抑制、死亡癌细胞数目增加。长期口服红参浸膏可减少乌拉坦、N-甲基-N-亚硝基-N-硝基胍、黄曲霉素等化学物质对大、小鼠的致癌作用。长期口服朝鲜红参粉能减低用 DMBA、乌拉坦、AFF、MNNG和黄曲霉素等致癌物接触的动物中肿瘤发生率，并能抑制其生长。人参皂甙对小鼠肉瘤 S180 有抑制作用。实验表明：人参可明显减慢癌前病变或早期癌的发展速度，保护癌旁肝组织尤其是线粒体、内质网等亚微结构，减少癌前病变的发生，从而明显延长癌鼠生存期。体外试验表明：人参花、叶二醇组皂甙能明显抑制小鼠腹水型网状细胞肉瘤（ARS）细胞的DNA合成。人参茎叶皂甙、花皂甙和人参多糖对S180亦有明显的抑制作用。人参多糖还能抑制小鼠艾氏腹水癌细胞增殖，延长S180小鼠存活时间。人参须糖浆对二甲基奶油黄诱发的大鼠肝癌有预防和控制作用。 13.2 其他作用 人参皂甙有多方面的抗吗啡耐受和成瘾作用。肝脏中有一种吗啡6-脱氢酶，此酶能催化吗啡转化为吗啡酮。人参皂甙能抑制吗啡 6-脱氢酶，有效地阻断吗啡酮的生成，并且提高肝中谷胱甘肽的水平，解除吗啡对脑内释放神经递质的抑制，防止吗啡的耐受性和成瘾性，缓解戒断症状疗效显著。同时对吗啡的镇痛作用无影响。不同浓度的人参提取浓缩液对福氏痢疾杆菌、乙型溶血性链球菌、产紫青霉菌均有抑制作用。较高浓度对金黄色葡萄球、大肠艾希杆菌、炭疽杆菌、肺炎球菌、黑色曲霉菌、产黄青霉菌有抑制作用。人参茎叶皂甙对单纯疱疹病毒型感染细胞有保护作用。实验证明：人参茎叶总皂甙对细胞的保护作用主要是明显抑制病毒复制，而不是直接杀伤病毒。人参提取物对感染森林病毒的动物有保护作用，具有增强干扰素诱导产生的抗病毒能力。人参碱溶性多糖部分对盐酸/乙醇诱导的胃黏膜损伤有显抑制作用，其抑制率分别为57.3和 74.2；如预先给予消炎痛，该多糖部分对胃黏膜的保护作用不被消除。 人参皂甙有促进鼠和猴肾皮质细胞DNA的合成、促进肾脏代偿性生长的作用。实验提示，临床上随意增加人参的用量不一定都能达到相应提高疗效的目的。1.4 人参皂苷的三种类型 根据皂苷元的结构可分为A、B、C三种类型：人参二醇型（Panaxdiol）-A型，人参三醇型（Panaxtriol）-B型，齐墩果酸型（Oleanolicacid）-C型。A型和B型皂苷均属四环三萜皂苷，其皂苷元为达马烷型四环三萜，A型皂甙元称为20(S)-原人参二醇20（S）-protopanaxadiol。B型皂甙元称为20(S)-原人参三醇20（S）-protopanaxatriol。C型皂苷则是齐墩果烷型五环三萜的衍生物，其皂苷元是齐墩果酸(oleanolic acid)。第二章 人参皂甙的提取及甙元的分离鉴定的实验2.1目的要求通过实验掌握人参皂甙的提取、精制方法，进一步巩固和熟悉人参皂甙的性质。熟悉和掌握人参皂甙的水解条件和方法。熟悉和掌握柱层析分离人参皂甙元的原理方法及基本操作技术。2.2人参中人参皂甙元的提取和甙元的分离鉴定1.原理：人参皂甙元与多个分子糖结合成甙，具有较强的亲水性，易溶于水和低级醇类，实验室采用热水提取人参皂甙，提取液加碱（CaO）除杂。再用酸调至中性，上大孔树脂柱，先用水洗去色素至无色，再用70的氨性醇洗至无色，人参皂甙便溶于乙醇洗脱，回收乙醇，便得到人参总皂甙。人参总皂甙和稀HCl在醇液中进行温和酸水解，可得到三种皂甙元，齐墩果酸、人参二醇和人参三醇。而不能得到原人参二醇和原人参三醇，这是因为在酸水解过程中侧链的20位碳原子上的羟基（OH）与该链上的双键（CC）易闭环，而形成带有三甲基四氢吡喃环的人参二醇和人参三醇。水解后，除去醇、氯仿萃取物经硅胶柱层析分离即可得到三种单体皂甙元，经重结晶获得纯品，分别与已知皂甙的红外光谱相一致。2.人参皂甙提取和甙元分离工艺流程人参皂甙提取工艺：人参茎叶粗粉20g热水提取1小时，粗滤，（棉花）提取液 药渣加0.6g是会乳沉淀，并调至PH910，放置10分钟，抽滤沉淀物滤液浓硫酸调PH7，放置10分钟。中性提取液回收后，上大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用 70氨性醇洗至绿色。乙醇洗脱液回收乙醇人参总皂甙（黄白色）a) 人参皂甙元的水解和甙元的分离流程 人参总皂甙加含5HCl的50乙醇液，加热回流2小时沉淀 水解液（酸性皂甙元部分）加水稀释，水浴蒸去醇，氯仿萃取3次（10，5，5ml）水层氯仿层无水NaSO干燥，回收氯仿总皂甙元少量苯溶解，硅胶柱层析，用苯乙酸乙脂 （8：2）洗脱组分 组分 组分95乙醇重 95乙醇重丙酮结晶结晶3次结晶3次2次齐墩果酸人参二醇人参三醇mp299-301mp245-250mp244-2461. 操作方法（1）人参总皂甙的提取：取人参茎叶粗粉20g，放入烧杯用热水（8090）提取1小时，然后用棉花粗滤，在所得滤液中加入0.6g水石灰乳除杂并调PH910放置10分钟左右，过滤，再将滤液用浓硫酸（少量）调PH7，放置10分钟左右，回收提取液至少量（510ml），再上大孔树脂柱（注：此柱应提前洗好，清洗办法略）先用蒸馏水洗至无色，再用70的乙醇洗至无色，分别用小瓶接收。便得到了乙醇洗脱液，回收乙醇，便得到了人参总皂甙（黄白色）。（2）人参皂甙的水解称取人参皂甙45g（不足时由老师提供），加20倍量含5HCl的50乙醇溶液，加热回流2小时，放冷，加0.5倍水，水浴去醇，转入分液漏斗中，用氯仿萃取3此（10，5，5ml），合并氯仿层，加少量无水硫酸钠干燥，回收氯仿即得总皂甙元。（3）甙元柱层析分离称取100200目硅胶（105活化30分钟）50g，用苯做洗脱剂湿法装柱，柱顶放一层脱脂棉，压上数个玻璃球，放出多余的苯（至高于吸附剂1cm），计算保留体积。总皂甙元用少量苯溶解上柱，用苯乙酸乙脂（8：2）洗脱，薄层检识（与甙元标准品对照）相同组分合并，回收溶剂。齐墩果酸、人参二醇用95乙醇重结晶，人参三醇用丙酮重结晶，纯品80干燥，收集于小瓶中。 注：由于人参花、叶中人参皂甙含量高且廉价，所以本实验可用人参地上部分作原料进行实验，脱脂34次，由绿变棕红即可，其它操作同前。如果用人参根总皂甙元进行柱层析，要求学生精制人参二醇进行红外光谱鉴定。若用人参花、叶总皂甙元进行柱层析分离，则要求学生精制人参三醇进行红外光谱鉴定。2.3人参皂甙的检识（一）显色反应1.醋酐浓硫酸反应（Liebermamm-Burchand反应）取人参皂甙样品少许，溶于冰醋酸中，加醋酐浓硫酸试剂（19：1）数滴，混匀，呈红紫色。2.泡沫反应：取人参皂甙样品少许于试管中，加水23ml溶解，密塞，用力振摇1分钟，产生大量持久泡沫。（二）薄层层析1.人参皂甙TLC：吸附剂：硅胶G板展开剂：正定醇乙酸乙脂水（8：2：10）上层。氯仿甲醇水（13：7：2）下层。对照品：根、叶、花甲醇液(10mg/ml)显色剂：10乙醇液（V/V），110加热10分钟，至棕红色斑点出现。2.人参皂甙元TLC吸附剂：硅胶G板展开剂：苯乙酸乙脂（1：1）对照品：人参二醇、人参三醇、齐墩果酸甲醇液显色剂：同皂甙（三）光谱数据齐墩果酸：IR ：3301，1700NMR()：5.30，1.85，1.63，1.24，0.91，0.75人参二醇：IR ：3301，1626NMR()：3.60，3.13，1.88，1.65，1.33，0.90人参三醇：IR ：3340，1617NMR()：6.32，4.60，3.62，1.95，1.60，1.30，1.16，1.04，0.90，0.822.4 实验说明及注意事项1.萃取操作时，注意振摇不能过度剧烈，以防产生乳化现象。2.在使用旋转蒸发器进行甲醇提取液减压浓缩时，因含皂苷易产生大量泡沫发生倒吸现象。故应注意观察随时调整水浴温度及旋转蒸发器转速，避免事故的发生。3.在连续回流提取过程中，水浴温度不宜过高，应与溶剂沸点相适应。此外可加快冷凝水的流速，以增加冷凝效果。4.回收乙醚的蒸馏操作，不必另换蒸馏装置。只将索氏提取器中的滤纸筒取出，再照原样装好，继续加热回收烧瓶中的溶剂，待溶剂液面增加至高虹吸管顶部弯曲处1cm处，暂停回收，取下提取器，将其中乙醚移置另外容器中，如此反复操作，即可完成回收乙醚的操作。5.在连续提取过程中，欲检查有效成分是否提取完全，可取提取器中提取液数滴，滴于白瓷皿中，挥散溶剂，观察有无残留物，或滴于滤纸片上，然后进行醋酐浓硫酸反应或三氯化锑氯仿饱和溶液反应。若反应呈阴性，示已提尽。6.大孔树脂在使用前应按说明书处理好，加乙醇浸泡24 h后，再用乙醇洗脱至流出液与3倍水混合后不呈混浊，继续用蒸馏水洗至无醇为止备用。2.5 参考文献1.Luiz E;Bermuder Z;Martin Wu 1991（05）2.Bates EJ;Lowther DA;Handley CJ Oxygen free-radicals mediate an inhibition of proteoglycan synthesis in cultured cartilage 1984(03)3.Towheed T;Tanveer E Glucosamine and Chondroitin for Treating Symptoms of Osteoarthritis 外文期刊 2000(11) doi:10.1001/jama.283.11.1483 4.Lee YS;Chung 1 S;Lee IR Activation of multiple effector pathways of immune system by the antineoplastic immunostimulator acidicpolysaccharide ginsan isolated from panax ginseng 1997 5. 包峰;何维为;吕永利 大鼠下丘脑神经元突触的老龄性改变及人参皂苷对其影响的研究 1995(04)6. 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