猪囊尾蚴的实验室诊断.doc

猪囊尾蚴的实验室诊断 董杰 （黑龙江省拜泉县长春镇畜牧兽医站164724） 1酶联免疫吸附试验 抗原采用猪囊尾蚴的囊液，经亲和层析纯化、浓缩、分装后，于-20保存，使用前，用0.1MpH值9.6醋酸盐缓冲液稀释，使蛋白含量为30毫克/分升.酶结合物用兔抗猪IgG免疫血清，经硫酸铵盐析沉淀，再经DEAE?纤维素纯化提取免疫抗猪IgG抗体，用辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG，经酶活力测定，应用时最适稀释浓度为11000。 操作方法为，以40孔聚苯乙烯微量反应为固相载体，每凹孔加稀释抗原液0.2毫升，置于4冰箱过夜，或302小时，用pH值7.4PBS?吐温20洗涤3次，每次3分钟，抽干，加以PBS?吐温20稀释的被检血清0.2毫升，同份血清同同时试验2孔，置于37水浴箱孵育30分钟，同前洗涤，加11000稀释的酶结合物0.2毫升，37水浴箱孵育30分钟，同前洗涤，加底物过氧化氢?邻苯二胺溶液0.2毫升，3715分钟后加2M硫酸0.05毫升终止反应。之后，将微量反应板移入酶标记光度计内，于492纳米波长测定光密度（OD值），每次试验均设置阳性阴性参考血清和PBS?吐温20空白对照。以参考阳性血清的OD值作0.1.待测血清的OD值大于或等于阳性参考血清的OD值时为阳性，低于此值为阴性。阳性猪反应液呈鲜明的橙黄色，阴性猪反应液呈浅的淡黄色，两者眼观对比有明显差别，易于判定。经反复试验，选定抗原的稀释度为30微克/毫升，血清稀释度为150。 间接血凝集试验是一种敏感度很高的血清学试验，在猪囊尾蚴病的诊断上取得了很好的效果。从新鲜的猪囊尾蚴猪肉剥离整个虫体，吸取囊液混合后离心沉淀，取上清液即为囊尾蚴液抗原。用2.5%戊二醛处理过的2.5%鞣酸化羊红细胞与等量稀释的囊尾蚴液抗原混合，于37水浴中搅拌30分钟，离心去上清液，磷酸盐缓冲液洗3次，再悬浮于含2%灭活兔血清的磷酸盐缓冲液中，制成1%羊红细胞悬浊液即为致敏羊红细胞，4保存备用。将2.5%鞣酸化羊红细胞离心去上清液，用含2%灭活兔血清的磷酸盐缓冲液制成1%羊红细胞悬液，作为对照羊红细胞，4保存备用。 取受检血清0.05毫升，加9倍量的对照羊红细胞放室温10分钟，以吸收嗜异性抗体。离心沉淀后，取上清液，即为110受检血清，再用磷酸盐缓冲液稀释为150。每份受检的稀释血清，用9支试管作2倍递减稀释：向1、2、9三支试管内各加入上述稀释血清0.1毫升，向28管各加入磷酸盐缓冲液0.1毫升，从第2管吸出0.1毫升放入第3管，同法依次稀释至第8管，最后从第八管吸出0.1毫升弃去，使18管分别含150，1100，1200，16400的稀释血清0.1毫升，第9管作为血清对照管。第18管加致敏羊红细胞1滴（0.050.06毫升），第9管加对照羊红细胞1滴，充分混匀后，放置室温内静置23小时，待红细胞完全沉淀后记录结果。 效价测定：依凝集程度分为0，0.25，0.50，0.75和100%共5个等级，分别以0、1、2、3、4数字代替。管底出现均匀紧密的颗粒性凝集、细边，红细胞沉集范围小于管底直径的2/3而仍大于1/2，即为3级凝集；若只有少量凝集，但边缘加粗，红细胞沉集范围等于管底直径的1/2者为2级凝集；同上，但其红细胞沉集范围小于管底直径的1/2者，为1级凝集；完全不凝集，管底中心呈清楚的暗红钮状者为0级。凡受检血清稀释150或更大，仍发生超2级反应者确定为囊尾蚴病间接血凝试验阳性，而对照均应为阴性，否则应当重做。 2环状沉淀反应 用新鲜的猪囊尾蚴经过丙酮、乙醚的处理，取其干燥的虫粉以生理盐水浸渍24小时后，经细菌滤斗过滤所制备的抗原，稀释到4000倍具有诊断价值，但阳性反应的滴度可高达3200倍。 为提高抗原的特异性，除了注意和防止可能出现的某些非特异性干扰因素外，进行了硫酸铵分层和荧光分析，其方法是将新鲜猪囊尾蚴的全虫置于荧光灯的暗室，在紫外光的照射下发出明亮的红色荧光。如分成头节、囊液和囊膜3部分，分别进行荧光检查，则只有囊液可以观察到明亮的荧光物质。为了从囊液中提取此荧光物质，用酒精混于囊液中，可将此物同蛋白质一样沉淀出来，取此