皮肤真菌检查技术.ppt

病原性真菌检验,河北省望都皮肤病防治院 张维娜,真菌（Fungus） 具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁） 细胞壁含几丁质和（或）纤维素 无根、茎、叶，不含叶绿素 以腐生或寄生方式摄取养料 能进行有性生殖和（或）无性繁殖,第一部分 病原性真菌概述,对人类致病的真菌分为： 浅部真菌：侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性，对 治疗有顽固性，但影响身体较小， 深部真菌：可侵犯全身内脏，严重的可引起死亡。 此外有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中，能产生毒素引起中毒性真菌病。,一、生物学性状 （一）形态结构,真菌细胞结构比细菌复杂 细胞壁为几丁质(Chitin)（多聚N乙酰葡萄糖组成），并含葡聚糖，甘露聚糖及蛋白质，某些酵母菌还含类脂体。 细胞内有较为典型的核结构和细胞器。,真菌形态分单细胞和多细胞两类,单细胞真菌主要为酵母和类酵母菌（如隐球菌、念珠菌），呈圆形或椭圆形。以出芽方式繁殖。 多细胞真菌由菌丝和孢子组成 菌丝分枝交织成团，形成菌丝体（Mycelium），并长有各种孢子，这类真菌即一般称为霉菌（Mold）。 由于生活环境（如营养、温度、氧气等）的改变，有些真菌的孢子与菌丝两种形态可以互变，这类真菌称为二相性真菌（dimorphic fungus），如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生菌。,真菌孢子和细菌芽胞的区别,真菌的形态构成,真菌菌丝形态,真菌孢子形态,（二）培养特性,大多数真菌营养要求不高，常用沙保氏培养基 （SDA）培养。 浅部病原性真菌的最适温度为2228，生长缓慢，大多于14周出现典型菌落。 深部病原性真菌培养在37中生长最好，生长较快，经3-4天即长出菌落。,真菌菌落类型,（三）变异性,真菌易发生变异，在人工培养基中多次传代或孵育过久，可出现形态结构、菌落性状、色素及毒力等改变。,（四）抵抗力,真菌对干燥、阳光、紫外线及一般化学消毒剂有一定的耐受力，但充分暴露于阳光，紫外线及干燥情况下大多数真菌可被杀死，且对2.5%碘酒，10%福尔马林都敏感，一般可用福尔马林薰蒸被真菌感染的房间。 对热敏感，一般601小时可杀死真菌菌丝和孢子。,二、致病性与免疫性 （一）致病性,真菌引起的疾病大致包括 真菌性感染：主要是外源性感染 浅部真菌侵犯皮肤、指甲及须发等组织，顽强繁殖，发生机械刺激损害，同时产生酶及酸等代谢产物，引起炎症反应和细胞病变。 深部真菌侵犯皮下，内脏及脑膜等处，引起慢性肉芽肿及坏死。 2条件致病性真菌感染： 主要是内源性感染（如白色念珠菌），亦有外源性感染（如曲霉菌）。,3过敏性真菌病： 由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过敏症，如哮喘，变态反 应性肺泡炎和癣菌疹等。 4真菌毒素中毒症： 侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。,（二）免疫性,1非特异性免疫：人类对真菌感染有天然免疫力。皮肤分泌短链脂肪酸和乳酸、血液中转铁蛋白、中性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬作用，以及正常菌群的拮抗作用。 2特异性免疫：真菌感染中细胞免疫是机体排菌杀菌及复原的关键，T细胞分泌的淋巴因子、以T细胞为主导的迟发型变态反应引起免疫病理损伤能局限和消灭真菌，以终止感染。,三、微生物学诊断 （一） 直接检查,1不染色标本的直接镜检： 直接采取标本制片、显微镜下直接观察，若发现真菌菌丝或孢子存在时，即可初步判定为真菌感染。 1）标本制备： 2）检查方法： 3）封固液：,KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。 墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等） 。 水合氯醛石炭酸乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。 生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。,2染色标本检查： 1）革兰氏染色： 各种真菌均为革兰氏阳性，为深蓝色。常用于酵母菌、白色念珠菌、孢子丝菌、诺卡菌及组织胞浆菌等。 2）乳酸酚棉蓝染色 3）糖原染色：菌体均染成红色。用于标本直接涂片及组织病理切片染色。 4）嗜银染色（GMS）：染成黑色。,5）粘蛋白卡红染色法（MCS）： 主要用于新型隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。 6）荧光染色： 主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。,（二）培养检查,本法可确定菌种，辅助直接检查的不足； 通常用沙保氏培养基（SDA）（2228）； 深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37培养；,（三）免疫学试验,用于检测深部感染真菌的抗体，作为辅助诊断组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。 检测深部感染真菌的抗原，用于早期、快速、特异的诊断。 乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原 ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原 免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原,四、防治原则,真菌感染尚无特异预防，主要注意公共卫生和个人卫生； 碘化物治疗孢子丝菌病、毛霉菌病有一定疗效； 制霉素、灰黄霉素、克霉唑（三苯甲霉唑）等外用或内服对癣症和白色念珠菌病等有较好疗效； 近年报道5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗单细胞真菌感染疗效显著； 二性霉素B可用于深部全身真菌感染。,第二部分 浅部真菌,浅部真菌主要为皮肤丝状菌（Dermatophytes），侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织引起癣症，又称癣菌(Ringworm)，分为三属，共37个种。,(一)、生物学特征,（二）检验方法：,1直接镜检：直接采取病变部位的标本，用显微镜检查有无菌丝及孢子的存在，本法迅速简便，是临床真菌检查最常用的方法,2分离培养： 取毛发、皮屑、甲屑等标本，用70乙醇消毒，接种沙保氏琼脂斜面培养基，25培养714天，根据菌落形态及颜色、并挑取菌落镜检菌丝及孢子的特征进行鉴定。,毛癣菌属,小孢子菌属,表皮癣菌属,3荧光检查：本法主要用于头癣检查。病发在滤过紫外灯照射下可发出不同色泽的荧光，如黄癣菌病发呈暗绿色荧光，白癣小孢子菌属的病发呈亮绿色荧光等。,第三部分 深部感染真菌,深部真菌是侵犯皮下组织和内脏，引起全身性感染的真菌。 多数能引起慢性肉芽肿样炎症、溃疡及坏死等病变,深部感染真菌分两大类： 1. 致病性真菌： 此类真菌在正常人体内部不存在，一旦侵入机体，即可致病，如组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌等，属外源性，我国少见； 2. 条件致病性真菌： 是人体正常菌群的成员，当机体抵抗力下降时才致病，如新型隐球菌、白色念珠菌、曲霉菌和毛霉菌等。,一、白色念珠菌,白色念珠菌（canidia Albicans）又称白色假丝酵母菌，广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病 。 为条件致病性真菌。,（一）生物学特性,卵圆形，大小2m4m，革兰氏染色阳性。 有假菌丝。,培养特性：典型类酵母型菌落，表面光滑，呈灰白色或奶油色，有酵母气味。 涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。,（二）致病性和免疫性,白色念珠菌可侵犯人体许多部位，可引起： 1. 皮肤念珠菌病：好发于皮肤皱褶处； 2. 粘膜念珠菌病：鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见。 3. 内脏及中枢神经念珠菌病：肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等。 机体可产生一定免疫力。,（三）检验方法及鉴定,1直接镜检：革兰氏染色镜检 2培养特点：典型的酵母菌落。,3鉴定试验,1）芽管试验：取少许待检的白色念珠菌接种于0.5ml人或兔血清中，混匀，直37水浴2-3h后，取出一接种环菌液，涂片、镜检。有芽管产生者为白色念珠菌，其他念珠菌不产生芽管。,2）TZC试验：将白色念珠菌接种于含0.005氯化三本四氮唑的沙保培养基中，经2225，2448h培养， 白色念珠菌不变色或仅淡红色，其他念珠菌或酵母菌呈红色或深红色。 3）糖发酵和糖同化试验： 根据这两种试验可将常见的几种念珠菌进行鉴别。,4）动物实验： 本菌对兔有致病力。给兔耳静脉注射本菌，经45天死亡。解剖可见肾、肝肿胀、充血，并有小脓肿，涂片及培养均可见本菌及其假菌丝存在。 5）厚膜孢子形成试验： 本试验亦是鉴定白色念珠菌的重要方法之一，在玉米粉聚山梨酯80琼脂培养基培养本菌，镜检观察到厚膜孢子及假菌丝。,4血清学诊断,用于诊断全身性念珠菌病。以念珠菌为抗原测定机体抗念珠菌抗体,二、新型隐球菌,新型隐球菌又名溶组织酵母菌，是土壤，鸽类，牛乳、水果等的腐生菌，也可存在人口腔中。 可侵犯人和动物，一般为外源性感染，但也可能为内源性感染，对人类而言，它通常是条件致病菌。,（一）生物学特性,较大球形，直径可达520um， 有肥厚的荚膜，折光性强，一般染料不易着色，难以发现，称隐球菌， 用墨汁阴性显影法镜检 ，可见到透明荚膜包裹着菌细胞， 菌细胞常有出芽，但不生成假菌丝。,在沙保氏琼脂及血琼脂培养基上，于25及37皆可生长，而非病原性隐球菌在37不能繁殖。 酵母型菌落，呈白色。 本菌能分解尿素，以此与酵母菌和念珠菌鉴别。,（二）致病性,本菌大多由呼吸道转入，在肺部引起轻度炎症，或隐性传染。 侵犯中枢神经系统，发生脑膜炎、脑炎、脑肉芽肿等。 此外可侵入骨骼、肌肉、淋巴结、皮肤粘膜引起慢性炎症和脓肿。,（三）微生物学检验,1直接镜检：常用墨汁涂片法。 2分离培养： 在沙保培养基上，室温、3723天即可长出