液相色谱串联质谱的小知识.doc

1、 开机water 2695/micromass zq4000:开机步骤1. 分别打开质谱、液相色谱和计算机电源，此时质谱主机内置的CPU会通过网线与计算机主机建立通讯联系，这个时间大约需要1至2分钟。2. 等液相色谱通过自检后，进入Idle状态，依照液相色谱操作程序，依次进行操作。（具体根据液相色谱不同型号来执行，下面以2695为例）。a.打开脱气机 (Degasser On)。b.湿灌注(Wet Prime)。c.Purge Injector。d.平衡色谱柱。3.双击桌面上的 MassLynx 4.0图标进入质谱软件。4.检查机械泵的油的状态（每星期），如果发现浑浊、缺油等状况，或者已经累积运行超过3000小时，请及时更换机械泵油。5.点击质谱调谐图标（MS Tune） 进入质谱调谐窗口 。6.选择菜单“Options Pump”，这时机械泵将开始工作，同时分子涡轮泵会开始抽真空。几分钟后，ZQ就会达到真空要求，ZQ前面板右上角的状态灯“Vacuum”将变绿。7.点击真空状态图标，检查真空规的状态 ，以确认真空达到要求。8. 确认氮气气源输出已经打开，气体输出压力为90 psi。9.设置源温度 （Source Temp）到目标温度。关机1点击质谱调谐图标进入调谐窗口。2.点击Standby 让MS 进入待机状态时，这时状态灯会由绿变红，这一过程是关质谱高电压的过程。3停止液相色谱流速，如果还需要冲洗色谱柱，可以将液相色谱管路从质谱移开到废液瓶。4等脱溶剂气温度（ESI）或APCI探头温度降到常温，点击气体图标关闭氮气。5 逆时针方向拧开机械泵上的Gas Ballast 阀，运行20分钟后关闭（镇气）。a) 对于ESI源，至少每星期做一次。b) 对于APCI源，每天做一次。6再次确认机械泵的Ballast阀是否已经关闭。7选择Option / Vent，这时质谱开始泄真空，ZQ 前面板的状态灯“Vacuum”开始闪烁，几分钟后机械泵会停止运行，这时可以关闭质谱电源。FINNIGEN DECA 开关机及校正流程1 开机前准备事项（1） 确保质谱总电源开关（白色开关）及主板电源开关（黑色开关）处于关闭状态（O）；（2） 检查真空泵油液面，确保泵内油页面处于标定的上下两线之间；（3） 查看离子源洁净程度，ESI源查看喷口是否有固体析出，毛细管口是否完好；APCI喷口是否有积液；（4） 气体压力，打开高纯氮气钢瓶总阀，调节出口压力调至0.65MPa，打开高纯氦气钢瓶总阀,调节出口压力调至0.25Mpa;（5） 检查壳气及辅助气接口连接紧固，松开液相管路与离子源的接口；（6） 开启动力电源，电压稳定，正常；（7） 确保室内温度在1825度。二 找方法a、 其实做方法不是很难的，先找的条件，然后建立连上液相找液质方法就可以了，然后在优化离子源气体流量，以及温度就可以了。b、首先，我们应该知道被测化合物的结构式，pKa，溶解度等理化性质。1，根据化合物极性和分子量大小选择离子源，非极性强的化合物可用APCI源，非极性弱的用ESI，此外ESI可形成多电荷离子，适合检测多肽等分子量大的化合物（APCI则不行）。2，根据化合物的酸碱性选择用正离子或负离子：一般碱性化合物用正离子，酸性或中性化合物选择负离子。正离子条件下：流动相一般加0.010.1的甲酸，负离子条件下：流动相一般加0.010.1的甲酸铵。3，离子源和正负条件确定好后即可优化化合物的质谱参数：建议先搞清楚各个参数是与流速相关还是与分子量相关，与TSQ Quantumn为例：与流速相关的参数有：Spray voltage，Sheath gas， Aux gas，Capillary temperature等参数，如果流速在较低范围内变动，这些参数就不用优化，使用厂家的推荐值即可。与分子量相关的参数有Tube lens offset等参数，这个一般也不建议优化。使用校正表上的值即可。所以这一步最关键的是找到母离子，如有加合离子建议加大Source CID试试，给一定能量，看看打碎的主要子离子。注意：如让仪器自动找子离子也能找到，但其优化的碰撞能量一般偏高，一般需要在其基础上减去Source CID的值大小即可C、如果是简单的定性，对于锥孔电压没什么太苛刻的要求。但是如果是要对样品进行定量，特别是低含量的，要讲究灵敏度，那就我对单个样品直接进样，分别优化毛细管电压和锥孔电压。三 质谱仪按质量分析器(或者磁场种类)可分为静态仪器和动态仪器，即稳定磁场（单聚焦及双聚焦质谱仪）和变化磁场（飞行时间和四极杆质谱仪）。MS仪器一般由进样系统、电离源、质量分析器、真空系统和检测系统构成。 1、真空系统 质谱仪中所有部分均要处高度真空的条件下(10-4-10-6Torr或mmHg), 其作用是减少离子碰撞损失。真空度过低，将会引起：a) 大量氧会烧坏离子源灯丝；b) 引起其它分子离子反应，使质谱图复杂化；c) 干扰离子源正常调节；d) 用作加速离子的几千伏高压会引起放电。 2、进样系统对进样系统的要求：重复性、不引起真空度降低。进样方式：a) 间歇式进样：适于气体、沸点低且易挥发的液体、中等蒸汽压固体。如图所示 注入样品(10-100g)-贮样器(0.5L-3L)-抽真空(10-2 Torr)并加热-样品蒸分子(压力陡度)-漏隙-高真空离子源。b) 直接探针进样：高沸点液体及固体探针杆通常是一根规格为25cm6mm i.d.,末端有一装样品的黄金杯(坩埚)，将探针杆通过真空闭锁系统引入样品，如图所示。 我们试验室用的是ABI 3000质谱仪，主要定量分析生物样品。 LC-MS/MS方法学开发的一般步骤是 首先通过微量注射泵获得母离子和子离子以及DP CE这四个主要参数然后利用梯度程序考察流动相组成（包括有机相的比例，甲酸或缓冲盐的加入量）对质谱响应的影响。 流动相的组成确定后利用FIA优化确定其他参数，主要是气体参数和TEM IS。一台LC/MS由以下几部分组成：HPLC、离子源接口、离子束聚焦、质量分析器、离子检测器、数据处理、化学工作站。HPLC就不说了，先说离子源，目前比较好的离子源设计为Agilent的直角喷雾技术，好处：1。去溶剂效果好,耐受液相高流速；2。雾化针零电位,位置免调整,操作安全简便,重现性好;3。离子截取面积大,灵敏度高;4。反吹干燥氮气,有效阻挡中性分子,减少污染并保护真空;5。大口径非加热石英毛细管,离子传输效率高,有利于高灵敏度检测；有效防止样品热降解；调谐稳定，碰撞诱导解离（CID）谱图重现性好；6。铰链设计,不同离子源的切换,简单方便,易于操作。下面说质量分析器：没有一种质量分析器可以适用于所有领域，目前的质量分析器有：单四极杆质谱、三级串联质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱、四极-飞行时间质谱。离子检测器：电子倍增管（EMT）：经质量分析器分离出来的离子首先撞击高能转换打拿极发射二次粒子，正、负离子转换的二次粒子最终均为电子；随后发射的电子进入电子倍增器的弯曲形内壁，撞击管壁涂层，产生更多的二次电子；最后以电信号输出。电子倍增管的放大倍数约为107。 光电倍增管（PMT）：经质量分析器分离出来的离子首先撞击倍增管最前端的闪烁晶体发射光子，光子照射光阴极射线管而发射电子，随后发射的电子进入电子倍增管进行信号放大，最终同样以电信号输出。 微通道板（MCP）：由一组圆柱形微通道管组成，每个微通道管的作用与电子倍增管类似。当离子进入微通道管时，产生二次电子，反射通过这些微通道管时，不断产生更多的电子。MCP的最大优点在于具有超快的时间响应。如果将几块微通道板用适当的方法叠在一起，放大倍数将达108。ESI是气相离子化过程，主要包括三个步骤：1、在喷雾毛细管尖端产生带电液滴；2、通过溶剂蒸发和雾滴分裂使带电液滴变小，这个过程反复进行；3、由很小的带电雾滴产生气相离子。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185205nm处检测的要求，因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。四液质经验我认为要维护好仪器，首先流速不能过大，液质是不能承载过大流速的；其次电压不要加到极限，尤其是正负离子转换时要适当调整；最后是做完样一定要及时冲洗和吹扫管路。做液质时跑一针的时间最好不要超过45分钟，否则仪器会很累。另外我认为API4000定量很准，但是打多级碎片时最好用的是离子阱，因为它能够在一次进样后同时分析多个离子，很方便，而不像四级杆一次只能进行一种离子的多级研究。1、由于液质的流速较小（ESI一般为0.2ml/min），所以配置样品的溶剂强度不能太大，尽量小于起始比例，否则，会出现保留时间偏移等问题。2、如果在液相上摸好的条件，注意尤其是流动相的组成要转化成合适LCMS分析的。3、磷酸盐及其他不挥发缓冲盐在离子源会沉淀并堵塞毛细管等，要更换成可挥发的有机缓冲盐。4、缓冲盐会导致离子抑制，因此要控制缓冲液的强度，10mM。5、去污剂、表面活性剂会有离子抑制现象发生， 表面活性剂产生的加合物和离子簇会干扰质谱数据，因此作液质联用仪时，不要使用洗涤剂清洗玻璃器皿等容器，如果一定要用，建议超声清洗多次。比如分析的样品必须要干净，这样既可以保护色谱柱，也可以防止污染质谱；分析了大量的生物样品后，冲洗系统时，先用高比例的水相冲洗，把源也给洗一下，然后再换用高比例的有机相，这时要把柱后管路从源上拿下来，避免柱中的杂质给冲进质谱1. 前处理：样品一定要干净，不管是为了质谱还是为了保护柱子，生物样品提取的好些，如果直接沉淀，一定要注意，尽量高转速12000rpm以上，低温离心，最好离2次（保险一点），转移样品也要仔细，从中间慢慢吸，有时会有漂浮物，岛津的质谱好像做直接沉淀的源比较容易堵，Waters的好些。2.样品浓度：质谱是灵敏度很高的仪器，进样浓度一定不能太高，12ug/ml已经可以啦，太高的浓度对仪器来说比较容易造成残留，而且定量也会不准啦。3.流动相:流动相中尽量加易挥发的盐，尽量不要加表面活性剂之类的，容易离子抑制，如果遇到离子抑制，可以试试把你的样品峰往后推推或者改变提取方法，也可以试试用APCI源。如果你的液相是低压混合的，尽量不要跑梯度，那样很费时间，如果没办法，一针又要走很长时间的话，可以考虑切换，只测样品出峰前后的那段时间，这样可以保护质谱。但是如果你用粗柱子，较高流速的也可以考虑跑梯度，如API4000，但要尽量减小死体积。4.冲洗:冲柱子自然不用说了，低有机相和高有机相分别冲一定时间（各至少半个小时以上吧），柱子保存在高有机相中。做完试验，冲源也是很重要的，也是低有机相和高有机相冲，但是时间可以不用那么长，你可以先冲源再冲柱子，或者两者分开冲，个人觉得分开冲好些，这样柱子上的脏东西就不会进到源里面去啦。冲源的时候气可以关小些。waters的液质有在线除盐的功能1、样品必须过0.22um滤膜过滤，不得有颗粒物；2、上样的溶剂，必须是色谱纯，最好和你的流动相比例一致；3、反相体系，不允许用正己烷之类极性弱的溶剂溶解样品并上样。4、水，自然是纯净水了；5、样品不允许含有金属离子、表面活性剂（不要用洗洁精洗瓶子）、磷酸盐、硼酸盐等不挥发盐；6、淋洗液缓冲溶剂必须用可挥发的，如乙酸、乙酸铵、氢氧化四丁基铵等，色谱纯级别。7、样品pH57严禁含有无机或有机强酸强碱。8、六通阀处变三通，最好把没有信号的区域，切换到废液，这样减少源的污染9、定期振气、清洗离子源，换油、1.峰漂移的程度与进样体积有关，一般体积越小，对峰漂移的影响越小，缺点是响应也减小。2.峰漂移与其出锋时间流动相的组成有关，如果出峰时间流动相强度很大影响就很小。个人观点，仅供参考。一般气源检查，总压力不能过大，检查泵油位置，查看真空度等，勤冲洗管路。1. 定期震气，更换机械泵油、滤网，必要时仪器除尘等。2.每个项目做完，大约1000个样品后，清洗离子源、样品锥孔、预四级杆等。3.定期对质谱进行期间核查、校准等。仪器状态正常时，以上是最基本的维护。还有一些注意事项：1.每次进完样后，液相和质谱部分都要冲洗干净。2.样品前处理一定要干净。3.非挥发性的盐不能用在质谱中。4.如果遇到放长假，实验室没有人，最最保险的办法就是关机，以免遇到停电的情况。5.质谱所处的工作环境最好要无尘，温、湿度要严格控制。6.样品浓度不能太高，以免污染离子源和四级杆。7.做实验时，经常关注真空、柱压、碰撞气压力等，如遇情况可以及时处理。8.操作人员一定要培训后才能上岗。一般也就是勤冲洗，特别是测完样品后多冲，离子源多清洗，泵油定期检查、更换，滤网及时更换清洗，其它的也没什么好做的了。首先流速不能过大，液质是不能承载过大流速的；其次电压不要加到极限，尤其是正负离子转换时要适当调整；最后是做完样一定要及时冲洗和吹扫管路。注意：做液质时跑一针的时间最好不要超过45分钟，否则仪器会很累。做液质三年了，岛津、waters、ABI和finigan的都摸过，经验谈不上，说点自己的注意点吧。1.前处理：样品一定要干净，不管是为了质谱还是为了保护柱子，生物样品提取的好些，如果直接沉淀，一定要注意，尽量高转速12000rpm以上，低温离心，最好离2次（保险一点），转移样品也要仔细，从中间慢慢吸，有时会有漂浮物，岛津的质谱好像做直接沉淀的源比较容易堵，Waters的好些。2.样品浓度：质谱是灵敏度很高的仪器，进样浓度一定不能太高，12ug/ml已经可以啦，太高的浓度对仪器来说比较容易造成残留，而且定量也会不准啦。3.流动相：流动相中尽量加易挥发的盐，尽量不要加表面活性剂之类的，容易离子抑制，如果遇到离子抑制，可以试试把你的样品峰往后推推或者改变提取方法，也可以试试用APCI源。如果你的液相是低压混合的，尽量不要跑梯度，那样很费时间，如果没办法，一针又要走很长时间的话，可以考虑切换，只测样品出峰前后的那段时间，这样可以保护质谱。但是如果你用粗柱子，较高流速的也可以考虑跑梯度，如API4000，但要尽量减小死体积。4.冲洗：冲柱子自然不用说了，低有机相和高有机相分别冲一定时间（各至少半个小时以上吧），柱子保存在高有机相中。做完试验，冲源也是很重要的，也是低有机相和高有机相冲，但是时间可以不用那么长，你可以先冲源再冲柱子，或者两者分开冲，个人觉得分开冲好些，这样柱子上的脏东西就不会进到源里面去啦。冲源的时候气可以关小些。日常维护:注意用流动相HPLC级,水用超纯水,不含磷酸盐等缓冲液.防湿防尘(用除湿机各遮布).用UPS电源以防临时停电影响.样品分析后用异丙醇液清洗雾化室.此外,定期清洗雾化针和查看泵油液面等.液相部分：应勤过滤流动相或更换新流动相，一般配制一次水相使用时间不要超过三天；及时清洗流动相滤头；若发现排空压力增大应及时更换泵头滤芯；每天做完样应及时冲洗管路及色谱柱。质谱部分：勤洗离子源，并定期进行一次彻底的清洗维护，不定时检查雾化针的情况并可定期用异丙醇（或异丙醇：水）悬空超声清洗；每天进样时检查雾化状况；每天检查气源情况，防止气源不足造成断气既影响工作又影响仪器使用寿命；定期检查前级泵泵油情况，及时震气使油回流；若长时间分析样品，每天或每隔几天应重启电脑及与质谱的通讯设备，防止因通讯故障造成质谱采样出错或无法连接。简单说说IT-TOF日常维护：1 每分析完一批样品（大概30-40个生物样品），IT-TOF中的离子源及Heat Block模块要用甲醇或异丙醇清洗2 每隔一段时间要进行一次仪器调谐以保证准确质量数；平时可只做TOF的调谐；调谐完毕之后要先用乙腈以0.2mL/min的流速冲洗30min以上并清洗离子源。3 LC中若使用缓冲盐，实验结束之后先用水冲洗柱子，柱子最后要保存在有机相中；用于洗泵头的溶剂要经常更换5 每4个月更换一次泵油；每隔两星期打开真空泵放气阀约30min，关阀后要再往回旋2圈。说说我们在建立方法时感触最深的几点：1. 选择的离子对一定要稳定，质谱的参数要细细优化：尤其在选择用加合离子定量时，尤其要注意这一点，一般加合离子需要在一定的条件下（酸碱度、离子强度等）才能保持离子化程度一样，就响应一样。用对照品溶液测定时可能一致，可实际样品中要复杂的多，其他物质对离子化可能有影响。2.确定待测物在柱上是否有保留：计算一下管路的死体积、柱的死体积之和，除以你的流速所得到的值，一定要小于你的待测物的出峰时间，最好差值在0.5min以上。因为液质不同液相，柱上没有保留在前面流出的物质喷雾时不稳定，会导致低浓度点、尤其定量下限附近同一样品响应不稳定。我们在测得时遇到低浓度点的QC能相差双倍，怎么也不符合要求（80120），于是就将同一样品重复进样，发现重复性非常差，也是成倍的差异，于是就寻找原因，什么都试了就是不行，后来咨询了应用工程师，才怀疑是否有保留。于是，改变比例，推迟出峰，嘿，问题就解决了。就此问题，浪费了我们一个多星期来找原因。3. 样品的处理方法及内标的选择：当测定复杂样品时，如生物样品血浆、胆汁、尿等，一定要考察在不同的实际样品中，内标、待测物是否能保持一致。我们就遇到特别郁闷的事情，在空白血浆中内标提取后响应非常一致，线性及QC样品都很好，可加入不同时间点采得的血浆后，发现内标出现高低不平的现象，有时甚至相差1倍。可能为不同时间点的血浆中的背景物质、或pH等不一致、导致其在提取、离子化过程中存在差异。质谱仪所能检测的最小到最大的质量范围： 不同仪器： 四极杆 1600Da，14000Da，磁质谱：110000Da，飞行时间质谱：无上限，离子阱质谱：12000Da，14000Da，质谱图中的横坐标，质量与电荷之比。若离子所带电荷为z = 1，则质荷比等于该离子的质量数。离子是以12C原子的1/12定义为一个质量单位，用u表示。 1u=1.66054x10-27kg其它常用符号，Da, 道尔顿 1Da=1u 分辨力(Resolution Power, RP) 分辨力：分开两个邻近质量峰的能力。 何为分开：若两个相邻峰的峰谷低于峰高的10%(或5%，50%)，则认为是分