线粒体蛋白质组学研究进展.pdf

第 4 3卷 2 0 1 5年 9月 分析 化学 ( F E N X I H U A X U E ) 特约来稿 C h i n e s e J o u rna l o f An y t i c a l C h e mi s t r y 第 9期 1 25 71 2 64 DOI ：1 0 1 1 8 9 5 j i s s n 0 2 5 3 8 2 0 1 5 0 4 7 9 线粒体 蛋 白质组学研究进展 许静怡 陈超翔 韩锦艳 杭 纬 颜晓梅 ( 厦门大学化学化工学院化学生物学系， 谱学分析与仪器教育部重点实验室， 化学生物学福建省 重点 实验室 ， 厦 门 3 6 1 0 0 5 ) 摘要线粒体是细胞能量代谢、 生物合成和细胞死亡的调控中心， 其功能异常会导致许多疾病的产生。线 粒体蛋 白质组学研究为解析线粒体 的生理 功能 、 探索线 粒体相 关疾病 的发病 机制及 促进线 粒体为 靶 向的药 物研发提供重要理论依据。本文对线粒体蛋 白质组学的研究方法， 尤其是近年的技术发展以及线粒体蛋白质 组学的性质及其应用进行总结 ， 并对其未来的发展前景和挑战进行展望。 关键词线粒体 ； 蛋白质组学；质谱 ； 疾病； 评述 1 引 言 线粒体是真核细胞重要的细胞器 ， 其在细胞 能量代谢 、 生物合成和细胞死亡 ( 包括细胞凋亡 和细胞程序性坏死 ) 的调控中起关键作用。此外 ， 线粒体还参与三羧酸循环 、 脂肪酸和氨基酸氧化 、 钙 离子稳态调节等重要生理过程 。由于线粒体在维持生命稳态中发挥重要作用 ， 因此其功能异常与许 多人类疾病相关 ， 如神经退行性疾病、 癌症 、 心脏病 和糖尿病等 。由于线粒体蛋 白质表达异常是其 功能紊乱的主要原因 ， 而线粒体蛋 白质组学正是从整体角度 ， 分析线粒体 的蛋 白质组成 、 表达水平与修 饰状态等的动态变化， 旨在阐明线粒体内全部蛋白质的表达模式和功能模式， 包括蛋白质的表达与存在 方式( 修饰方式) 、 结构与功能、 以及蛋 白质相互作用等 ， 从而在蛋 白质水平探索线粒体生理功能和相关疾 病的联系 。通过线粒体蛋 白质组学可系统研究正常和病变组织 中线粒体蛋白分布与表达 的差异 ， 从 而为研究线粒体相关疾病的分子机制和以线粒体为靶标 的药物研发奠定理论基础L 1 。近年来 ， 人类基 因组测序的完成 、 串级质谱和蛋 白质数据库的发展加速 了线粒体蛋 白组学 的研究 。本文对线粒体蛋 白 质组学的研究方法， 尤其是近年 的技术发展进行总结 ， 分析并讨论蛋 白质组学的性质及其应用 。 2 线粒体 蛋 白质组学 的研究方法与技术 2 1 线粒体蛋白质的提取策略 提取大量高纯度的线粒体蛋 白质是开展线粒体蛋 白质组学研究的重要前提 ， 线粒体的纯度及其 结构的完整性是保 障实验结果准确的关键所在 。如图 1所示 ， 线粒体 由外膜、 膜间隙、 内膜和基质构成 ， 基质或者膜间隙蛋白质组学可促进线粒体蛋 白质的定位和功能研究 ， 但 同时也对提取策略的选择性和 特异性提出了更高要求 。 差速离心结合密度梯度离心是分离纯化线粒体的经典方法 。差速离心用于分离不同大小 、 体积 和重量的细胞器 。通过差速离心可初步分离得到线粒体 ， 为尽量避免其它细胞器组分 的干扰 ， 需通 过密度梯度离心对得到的线粒体进一步分离纯化 1 。密度梯度离心是在离心管内通过特定介质形成 连续或不连续的密度梯度 ， 将差速离心得到的线粒体悬液置于介质顶部 ， 悬液通过重力或离心力场作用 进一步分层和分离。线粒体密度梯度离心常用介质有氯化铯、 蔗糖 、 F i c o l l 、 P e r c o l l 及碘化介质( 如 N y c o d e n z ) 等 。其 中蔗糖黏度大且渗透性 高，易使细胞器破裂 ； 而 P e r c o l l 和 N y c o d e n z介质形成 的梯度十分 2 0 1 5 6 1 1收稿 ； 2 0 1 5 7 1 5接受 本文 系国家 自然科学基金 ( N o s 9 1 3 1 3 3 0 2 ， 9 0 9 1 3 0 1 5， 2 1 2 2 5 5 2 3 ) 资助项 目 E ma i l ：x my a n x mu e d u c n 第 9期 许静怡等 ： 线粒体蛋白质组学研究进展 l 2 5 9 2 2 线粒体蛋白质的分离策略 对于线粒体蛋白质组学研究 ， 无论通过上述何种策略获得线粒体蛋白质组 ， 都需要对蛋 白质混合物 进行分离 ， 分离后酶解成多肽片段 ， 再通过质谱进行鉴定。分离线粒体蛋 白质 昆 合物的方法主要是电泳 和色谱法。 二维电泳是分离线粒体蛋 白质最广泛最经典 的方法 ， 它是一种高分辨率的蛋 白质分离技术。二维 凝胶电泳的第一相常为等 电聚焦电泳( I E F ) ， 根据蛋 白质等电点的不 同进行分离 ； 第二相是 S D S 聚丙烯 酰胺凝胶电泳( S D S P A G E ) ， 根据蛋 白质分子量 的不 同进行分离。1 9 9 8年 R a b i l l o u d等首先利用 I E F S D S P A G E分离人胚胎组织线粒体蛋 白质并结合肽指纹 图谱鉴定 了 4 6种线粒体蛋 白质 。王媛等通 过双向凝胶电泳在小鼠心脏 、 肝脏和肾脏 3种组织中发现了 8 7种组织特异 的差异蛋 白 。此外 ， 有报 道采用双向荧光差异凝胶电泳( 2 D D I G E) 分析蛋 白表达量的变化 ， 即利用不同荧光染料标记不同处理 方法 的蛋白质 ， 再等量混合标记不同荧光染料 的蛋 白质进行双向电泳 ， 通过荧光强度的变化可测定蛋 白 表达量的变化。如 v a n L a a r 等提取小鼠脑线粒体并分成有无多巴胺醌处理 的两组 ， 通过 2 D D I G E结合 质谱分析发现 1 8种蛋 白质 的表达量发生显著变化 。R a m i r e z - T o r t e s 等分别提取两组膳食 中“ 含 ” 与 “ 不含” 鲨烯 的小 鼠肝脏线粒体 ， 利用 2 D D I G E分离蛋 白质结合质谱分析 ， 发现鲨烯处理的小鼠肝脏线 粒体中有 l 8种蛋 白质表达量发生改变 。然而，I E F S D S P A G E技术难 以分离强酸性 、 强碱性、 相对 分子质量过大或过小 的蛋 白质或者膜蛋 白和一些低 丰度 蛋 白质等 。通过蓝绿温 和非变性凝胶 电泳 ( B N P A G E ) 结合 S D S P A G E可以弥补 I E F S D S P A G E的技术缺陷 ， 可分离线粒体膜蛋 白复合物等。该 技术是在非变性状态下根据相对分子质量分离膜蛋白复合体且不改变膜蛋白复合物的生理活性和结合 状态 ， 再通过 S D S P A G E将各个复合物 的亚基或蛋 白质分离 出来。F e r r e i r a等通过综合使用 2 D I E F S D S P A G E MS MS和 2 D B N S D S P A G E M S MS对腓肠骨骼肌中肌膜和肌纤维的线粒体蛋白质进行分 离和鉴定 ， 识别 3 2 5种线粒体蛋白质 1 6 。C h o u等综合 B N S D S P A G E和 I E F S D S P A G E两种分离方法 对小鼠的大脑皮质线粒体蛋 白质进行分离并结合质谱分析 ， 发现 2 3种与三羧酸循环 ( T C A) 相关蛋 白质 在 A D模型小 鼠中表达失调 。 色谱是将线粒体蛋 白质用蛋 白酶水解后 ， 根据不同多肽在流动相和固定相之间的分配系数不同 ， 使 其在两相 间反复多次分配 ， 以不 同速度迁移 ， 从而分离不 同肽段。多维液相色谱组合 了两种或两种 以上 不同分离机制， 根据样品不同特性( 如分子大小、 亲水性、 等电点等) 对混合多肽进行分离。多维液相色 谱具有快速、 高通量 、 自动化、 重现性高等优点 ， 且能够检测疏水性 以及低丰度蛋 白质 ， 但难 以提供翻译 后修饰等信息 。 通过将凝胶电泳与色谱两种策略以合理方式组合， 可使混合物达到更好分离效果。即先将线粒体 的蛋 白混合物通过 S D S P A G E分离并切割条带水解成多肽， 最后用一维或多维液相色谱 串联质谱来鉴 定水解得到的肽段。例如 ， T e c h r i t z 等从 鼠脑 、 骨骼肌 、 心脏 、 肝脏和肾五种组织 中提取线粒体并纯化 ， 通 过 I E F S D S P A G E和 L C E S I MS及 M S MS分离鉴定 ， 发现有 4 8种蛋 白质在不 同组织中存在不 同表达 程度 。 2 3 线粒体蛋白质的鉴定 质谱是鉴定蛋 白质的首选方法 ， 其可以准确测量肽段和蛋 白质 的分子量 、 氨基酸序列及翻译后修饰 等信息。目前 ， 根据蛋 白质或多肽分子离子化的方式不同可分为电喷雾离子化质谱 ( E S I MS ) 和基质辅 助激光解吸离子化质谱 ( MA L D I MS ) 。MA L D I 产生的离子可 以用飞行时间质量分析器( T O F ) 检测 ， 即 基质辅助激光解吸飞行 时间质谱 ( M A L D I T O F MS ) 。M A L D I T O F MS可 以检测肽段的分子量 ， 获得蛋 白质的肽质量指纹图谱( P M F ) ， 通过与相应的线粒体蛋白质数据库比对来鉴定蛋白质 引 。此外， 通过 串级质谱技术 ( MS MS ) 可对质谱分析的肽段进行碎裂再用质谱分析 ， 从而得到肽段序列信息。质谱技 术还可与双向凝胶电泳 、 二维液相色谱等蛋 白质或肽段分离技术联用 ， 实现“ 在线” 式分离鉴定蛋白质 ， 具有灵敏度高、 准确度高和 自动化程度高的优点。如 T a y l o r 等通过蔗糖密度梯度法提取人心脏线粒体 ， 利用 S D S P A G E结合质谱和生物信息学 分析 ， 识别 6 1 5种线粒体蛋 白质 ， 这些蛋 白质 主要参 与生物合 成 ， 离子转运及脂代谢 。L a mb等通过 L C MS MS发现 4 0种以上线粒体蛋 白质在癌干细胞 中表达量 1 2 6 0 分 析 化 学 第 4 3卷 无限上调 。Mo o t h a等通过串级质谱技术 L C MS MS鉴定来 自小鼠脑 、 心脏、 肾、 肝脏的 3 9 9种线粒体 蛋白质 。但这些检测到的大部分是高丰度蛋 白质， 随着 串联质谱技术灵敏度 等的提高 ， 也促进了低 丰度蛋白质的检测。如 P a g l i a r i n i 等提取小鼠的1 4种组织结合 M S M S 技术鉴定了3 8 8 1 种线粒体蛋白 质 。因为 2 D D I G E在样品处理上费时费力 ， 不利 于大规模的蛋 白质组定量 ， 而通过 同位素标记 、 化 学标记( I C A T或 i T R A Q) 或 l a b e l f r e e 方法 ， 质谱也可定量分析线粒体蛋 白组的改变。例 如 ， B u g g e r 等通 过 l a b e l f r e e方法和 L C M S MS发现心衰过程中脂肪酸氧化酶表达量减少 ， 而丙酮酸脱氢酶亚基和两种 T C A循环关键酶表达量均上调 ， 实现对线粒体蛋 白组的定量分析 。为了探索氧含量对神经元线粒体 功能的影响 ， V i l l e n e u v e等分别提取 5 和 2 1 氧含量培养 S H S Y S Y( 神经母细胞瘤细胞) 的线粒体 ， 利 用同位素标记结合 I E F P A G E及 L C MS MS分离鉴定蛋 白质， 鉴定 出 7 1 4种线粒体蛋 白质 ， 且 5 氧含 量培养的细胞的线粒体呼吸链复合物亚基等显著高于 2 1 氧含量培养的细胞 ， 前者所产生 的活性氧水 平也低于后者 ， 说明 S H S Y 5 Y更适合在 5 氧含量条件下培养 J 。线粒体蛋白质的合成与降解过程之 间的动态平衡是维持线粒体稳态的重要 因素 ， 因此 K i m等通过重水标记策略结合 S D S P A G E， L C MS ， M S MS分离鉴定来 自鼠心脏和肝脏 4 8 5种“ 转换蛋 白质” 。实验结果表明，肝线粒体蛋 白质转换速率 快于心脏组织 ， 这些信息可以促进线粒体蛋 白翻译及稳态维持的机理研究 。 显微镜技术是与质谱互补的蛋白质鉴定方法 ， 其主要作用是对线粒体蛋 白质进行定位分析 ， 即通过 荧光标记抗体或者转染荧光蛋 白( 如 G F P ) 等进行 观察 ， 已成功运用于酵母菌的线粒体蛋 白质组学研 究 ，4 。2 0 1 3年 T e c h r i t z 等 从鼠脑、 骨骼肌 、 心脏、 肝脏和肾 5种组织 中提取线粒体 ， 质谱鉴定后再 结合显微镜观察 G F P标记的蛋白质 ， 识别了 6种新的线粒体蛋 白质 。该技术的缺陷在于高质量抗体的 数量和种类有限， 转染实验周期较长且引入外源蛋白质 ， 只能对少量几种蛋 白进行观察 ， 无法实现高通 量分析 川 。 总之 ， 质谱和显微镜技术的发展促进了线粒体蛋 白质组学的研究 ， 既可进行高通量分析 ， 也可选择 性地观察目标蛋白， 促进未知线粒体蛋白的发现， 完善线粒体蛋白组的“ 目录” ， 也使线粒体蛋白质组学 在相关疾病的研究中得以应用。 3 线粒体蛋白质组学的性质及其应用 随着线粒体蛋 白质组提取、 分离和鉴定技术 的发展 ， 目前 已建立 了较为完善的线粒体蛋 白质 “目 录” 。已检测到 1 0 0 0多种人类线粒体蛋 白质 ， 并发现线粒体蛋 白质 的丰度变化非常大， 最丰富的内 膜和外膜蛋 白分别是 A N T 1 和 V D A C 4 。以下对线粒体蛋 白质组的蛋 白数 目、 丰度 、 定位、 翻译后修饰 、 组织分布、 生化途径归属及其应用进行介绍 。 在线粒体蛋 白质的定位方面 ， 一部分蛋 白质只存在于线粒体中， 而另一部分线粒体蛋 白质可以“ 双 重” 定位， 即同一基因编码的蛋白质除了定位于线粒体， 还出现在胞质或其它细胞器中 46 J 。如在凋亡信 号刺激下 ， t B I D被凋亡蛋 白酶一 8切割后转位到线粒体外膜上 ； 线粒体膜 间隙细胞色素 C借助凋亡蛋 白 B a x等形成的孔道转位到胞浆 。 在线粒体蛋 白质的翻译后修饰方面 ， 主要采用 3种方式 ： 乙酰化 、 磷酸化和羟基化。S I R T 3是依赖 N A D 的线粒体去乙酰化酶 ， 为了解其作用底物 ， R a r d i n等利用 L a b e l f r e e 定量方法检测到小鼠肝脏组织 中4 8 3种乙酰化线粒体蛋白质， 2 1 8 7 个赖氨酸乙酰化位点， 且发现1 3 6 种蛋白质中2 8 3 个乙酰化位点在 S I R T 3基因敲除小鼠模型中显著上调 ， 说 明 S I T R 3可对 多种蛋 白质以及同一种蛋 白质上 的多个位点去 乙酰化。进一步分析发现，这些乙酰化线粒体蛋 白质主要参与脂肪酸氧化 、 T C A循环等 ， 表 明 S I T R 3是 一 种广谱的线粒体蛋 白质去乙酰化酶 。G r i m s r u d等通过对不 同生理状态小 鼠肝脏磷酸化线粒体蛋 白组进行多参数分 析， 结 合 i T R AQ定量标 记策 略及 L C MS M S技术分 离鉴 定磷酸 化多 肽 ， 共识别 2 9 5种磷酸化线粒体蛋白质， 包括 8 1 1个磷酸化位点 ， 且这些线粒体蛋 白质的磷酸化在肥胖症及 T 2 D相 关的酮体合成中起重要调节作用 。D e n g等提取 T 2 D模 型小 鼠的肝脏线粒体 ， 通过 L C MS MS技术 分离鉴定 出3 5 5种羟基化线粒体蛋 白质 ， 且羟基化程度在 T 2 D病变过程 中显著提高 ， 这种高程度 的羟 基化与 R O S过量产生和氧化应激相关 ， 可加速凋亡速率 ， 这些蛋 白质组学研究也促进了 T 2 D发病机理 l 2 6 2 分 析 化 学 第4 3卷 体蛋白质表达量的改变与凋亡规避 、 肿瘤侵染和转移等生理活动相关 。线粒体蛋白质组学也可用于 药物副作用的研究 ， L e e等通过 i T R A Q定量并结合 2 D - L c分离 、 MA L D I 。 T O F T O F MS M S鉴定线粒体蛋 白质 ， 说 明曲格列酮会损伤线粒体功能 。综上所述 ， 线粒体蛋 白质组学 的发展促进了线粒体相关疾 病的发病机制的系统研究和药物研发。 4结论与展望 随着线粒体蛋 白质组提取、 分离和鉴定技术的发展 ， 目前既能对整个线粒体蛋 白质组进行分析 ， 也 可针对膜间隙或基质亚区间蛋 白质组分析 ， 进一步完善线粒体蛋 白质组学 的“目录” 。蛋 白质组学 的发 展为我们提供 了大量线粒体基 因和蛋 白信息 ， 通过结合临床特征 ， 有利于发现与疾病相关 的基 因和蛋 白， 为我们系统研究线粒体与人类疾病的关系奠定基础。线粒体蛋白质组学需要在以下几个方向进一 步发展 ： 第一 ， 进一步完善线粒体蛋 白组 目录。一些蛋 白质可能由于丰度太低无法使用传统方法检测 ， 一 些蛋白质 由于侧链包埋于封闭结构 中而无法对其进行生物素化检测。因此需要改进实验技术与方 法 ， 提高线粒体蛋 白质提取方法的覆盖率和特异性 ， 鉴定、 识别之前难 以检测 的蛋 白质 ； 第二 ， 除鉴定线 粒体蛋白质的氨基酸序列， 还需完善蛋白质翻译后修饰和线粒体亚区间定位等信息， 因为这些信息与蛋 白质 自身功能紧密相关 ； 第三， 通过 R N A干扰 、 蛋白一 蛋 白相互作用 、 理论计算结合数据库等方法研究蛋 白质在线粒体能量代谢 、 生物合成 、 细胞死亡中所起 的作用( 功能预测 ) ； 最后 ， 借助生物及化学 的新技 术 、 新方法和数据库资源等将线粒体蛋 白质组学中蛋 白质序列突变等信息与线粒体 的生理功能和相关 疾病的临床特征及特定表型关联起来 ， 这不仅对于线粒体相关疾病发病机理 的研究和药物研发意义重 大， 而且也正是发展线粒体蛋 白质组学的 目的所在 。总而言之， 线粒体蛋 白质组学对线粒体全部蛋 白质 的“ 破译 ” 将会为人类疾病研究和线粒体生物学开辟一个崭新时代 。 Re f e r e nc e s 1 Wa e r B K，K i t a mi T，Gi l b e r t T J ，P e c k D，Ra ma n a t h a n A，S c h r e i b e r S L，Go l u b T R，Mo o t h a V KNa t Bi o t e c h n o 1 ， 2 0 0 8，2 6：3 4 3 3 5 1 2 S o r i a n o M E ，S c o n a n o L C e f 2 ， 2 0 1 1 ， 1 4 5 ( 1 ) ：1 5 1 7 3 He n g a r t n e r M 0N a t u r e， 2 0 0 0，4 0 7：7 7 0 7 7 6 4 D e t m e r S A C h a n D C N a t R e v Mo 1 f 2 B i o 1 ， 2 0 0 7 ， 8 ( 1 1 ) ： 8 7 0 - 8 7 9 5 H e l l e r A， B r o c k h o ff G， G o e p f e r i e h A E u r P h a r m B i o p h a r m ， 2 0 1 2 ， 8 2 ( 1 ) ： 1 一 l 8 6 A b r a mo v A Y，S mu l d e r s S r i n i v a s a n T K，K i r b y D M，Ac i n P e r e z R，En r i q u e z J A，L i g h t o w l e r s R N，Du c h e n M R， T u r n b u l l D MBr a i n，2 0 1 0，1 3 3： 7 9 7 - 8 0 7 7 We i n b e r g S E C h a n d e l N S N a t C h e m B i o 1 ， 2 0 1 5， 1 1 ( 1 ) ： 9 1 5 8 C a l v o S EMo o t h a V KAn n u R e v G e n o m Hu m G， 2 0 1 0，l 1 ： 2 5 4 4 9 W a l l a e e D CF a n W P r o c a c c i o VAn n u Re v P a t h o 1 Me c h ，2 0 1 0，5：2 9 7 3 4 8 1 0 J i a n g Y J ，Wa n g X He ma t o 1 On e o 1 ， 2 0 1 2， 5：1 一l 3 1 1 F o me r F ， F o s t e r L J ， C a m p a n a r o S ， V a l l e G， Ma n n MM o 1 C e l l P r o t e o m i c s ， 2 0 0 6 ， 5 ( 4 ) ： 6 0 8 - 6 1 9 1 2 B a r d e l J ，L o u w a g i e M， J a q u i n o d M，J o u r d a i n A， L u c h e S，R a b i l l o u d T， Ma c h e r e l D，Ga r i n J ，B o u r g u i g n o n J P r o t e o mi c s ， 2 0 0 2 2( 7)：8 8 0 8 9 8 1 3 S t i mp s o n S EC o o r s s e n J R，My e r s S J A n a 1 B i o c h e m， 2 0 1 5， 4 7 5：1 3 1 4 F o s t e r L J ， d e Ho o g C L ， Z h a J 1 g Y， Z h a n g Y， X i e X， Mo o t h a V K，Ma n n M f 2 ， 2 o o 6 ，1 2 5 ( 1 ) ： 1 8 7 1 9 9 1 5 Ha r t w i g S ，F e c k l e r C ，L e h r S ，Wa l l b r e e h t K，Wo l g a s t H，Mt i l l e r Wi e l a n d D，K o t z k a J P r o t e o m i c s ，2 0 o 9 ，9( 1 1 ) ： 3 20 9-321 4 1 6 F e r r e i r a R， V i t o r l n o R，A l v e s R M，A p p e l l H J ，P o w e r s S K，D u a r t e J A，A ma d o F P r o t e o m i c s ，2 0 1 0 ，1 0( 1 7 ) ： 31 4 2-31 5 4 1 7 C h e n X L ， We i S S ， Ma Y，L u J ，N i u G， X u e Y H， C h e n X Y，Y a n g F Q T h e r a n o s t i c s ， 2 0 1 4 ， 4 ( 1 2 ) ：1 1 6 4 1 1 7 5 1 8 Z h a n g S Y， Z h u S B， Y a n g L L ， Z h e n g Y， G a o M， Wa n g S ， Z e n g J Z ， Y a n X MA n a 1 C h e m ， 2 0 1 2， 8 4 ( 1 5 ) ： 6 4 2 1 6 42 8 第 9期 许静怡等： 线粒体蛋白质组学研究进展 1 2 6 3 1 9 Ma r t e l l J D， De e r i n c k T J ， S a n c a k Y， P o u l o s T L，Mo o t h a V K， S o s i n s k y G E， E l l i s ma n M H，T i n g A Y Nat Bi o t e c h n o 1 ，2 0 12，3 0：11 43-1 1 4 8 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 40 41 42 43 4 4 45 46 47 48 49 M o n e n s e n A S k i b s t e d L H， A g r F o o d C h e m ， 1 9 9 7， 4 5 ( 8 ) ： 2 9 7 0 - 2 9 7 7 B e n d a y a n MS c i e n c e ， 2 0 0 1， 2 9 1 ：1 3 6 3 1 3 6 5 Ma y e r G B e n d a y a n M Hi s t o c h e m C y t o c h e m，1 9 9 7， 4 5：1 4 4 9 -1 4 5 4 Mi n a mi h a t a K，Got o M， K a m i y a N B i o c o n j u g a t e C h e m ， 2 0 1 1 ， 2 2 ( 1 1 ) ： 2 3 3 2 2 3 3 8 Rh e e H W ，Z o u P，Ud e s h i N D，Ma r t e l l J D，Mo o t h a V K，Ca r r S A，T i n g A YS c i e nce ，2 0 1 3，3 3 9：1 3 2 8 -1 3 3 1 Ge i g e r T，C o x J ，Os t a s i e w i c z P，Wi s n i e ws k i J R，Ma n n MNa t Me t h o d s ，2 0 1 0，7：3 8 3 - 3 8 5 Hu n g V，Z o u P，Rh e e H W ，U d e s h i N D，C r a c a n V，S v i n k i n a T，Ca r r S A，Mo o t h a V K ，T i n g A YMo 1 Ce l l ，2 0 1 4， 5 5：33 23 41 Ra b i l l o u d T，Ki e ff e r S，P r o c a c c i o V，L o u w a g i e M，C o u r c h e s n e P L，P a t t e r s o n S D，Ma r t i n e z P，Ga r i n J ，L u n a r d i J E l e c t r o p h o r e s i s ， 1 9 9 8 ，1 9 ( 6 ) ： 1 0 0 6 1 0 1 4 wA N G Y u a n ， S U N H a i D a n ， R U Y a - We i ， Y I N L i a n g ，L I U S i Q i S c i e nce C h i n a ： S c i ， 2 0 1 0， 9 ： 8 2 0 - 8 3 3 王 嫒， 孙海丹， 茹雅维 ， 尹松月，阴 亮 ， 刘斯奇中国科学：生命科学， 2 0 1 0 ， 9 ： 8 2 0 8 3 3 v a n L a a r V S ， D u k e s A A， C a s c i o M， H a s t i n g s T GN e u r o b i o 1 D i s ， 2 0 0 8， 2 9 ( 3 ) ： 4 7 7 4 8 9 Ra mi r e z T o r r e s A，Ba r c e l o - B a t l l o r i S，F e r n a n d e z - Vi z a r r a E，Na v a r r o M A，Arna l C，Gu i l l e n N，Ac i n S 。Os a d a J P r o t e o mi c s ， 2 0 1 2 ， 7 5 ( 9 ) ： 2 5 6 3 2 5 7 5 C h o u J L，S h e n o y D V，T h o ma s N，C h o u d h a r y P K，L Me d a F M，Go o d ma n S R，Br e e n G A P r o t e o mi c s ，2 0 1 1 ， 7 4 ( 4 ) ： 4 6 6 4 7 9 Wu Q，Y u a n H， Z h a n g L ， Z h a n g Y A n a 1 C h i mA c t a ， 2 0 1 2 ， 7 3 1 ：1 1 0 T e c h fi t z S ，L u t z k e n d o r f S ， B a z a n t E，B e c k e r S ， K l o s e J ， S c h u e l k e MP r o t e o m i c s ， 2 0 1 3 ，1 3 ( 1 ) ： 1 7 9 1 9 5 C h a n g H W ，C h u a n g L Y，Ch e n g Y H ，Gu D L， Hu a n g H W ，Ya n g C H G e n e t w V a r i a t i o n S p r i n g e r Pr e s s 2 01 0： 2 5 9-2 7 4 T a y l o r S W ，F a h y E，Z h a n g B，Gl e n n G M ，W a r n o c k D E，W i l e y S，Mu r p h y A N，Ga u c h e r S P，C a p a ld i R A，Gi b s o n B W ，G h o s h S S Na t Bi o t e c h n o 1 ， 2 0 0 3，2 1： 2 8 1 2 8 6 L a mb R，Ha r r i s o n H，Hu l i t J ，S mi t h D L，L i s ant i M P，S o t g i a F O n c o t a r g e t ，2 0 1 4，5：1 1 0 2 9 1 1 0 3 7 Mo o t h a V K， B u n k e n b o r g J ， O l s e n J V， n j e r r i l d M， Wi s n i e w s k i J R， S t a h l E， B o l o u r i M S ， R a y H N， S i h a g S ， K a m al M， P a t t e r s o n N， L a n d e r E S ，Ma n n MC e l l ， 2 0 0 3 ，l 1 5 ( 5 ) ： 6 2 9 6 4 0 P a g l i a r i n i D J ， C a t v o S E， C h a n g B， S h e t h S A， V a f a i S B，O n g S E ，Wa l f o r d G A， S u g i ana C， B o n e h A， C h e n W K， Hi l l D E， V i d al M，E v a n s J G， Tho r b u m D R，C a r t S A， Mo o t h a V K C e l l ， 2 0 0 8 ，1 3 4 ( 1 ) ： 1 1 2 1 2 3 B u g g e r H，S c h wa r z e r M，C h e n D，S c h r e p p e r A，Amo r i m P A，S c h o e p e M，Ng u y e n T D，Mo h r F W ，Kh a l i mo n c h u k O。 We i me r B C， D o e n s t T C a r d i o v a s c R e s ， 20 1 0 ， 8 5 ( 2 ) ： 3 7 6 3 8 4 V i H e n e u v e L ， T i e d e L M，M o r s e y B ，F o x H S P r o t e o m e R e s ， 2 0 1 3 ，1 2 ( 1 0 ) ： 4 5 9 9 4 6 0 6 Ki m T Y，Wa n g D，K i m A K，L a u E，L i n A J ，L i e m D A，Z h a n g J ，Z o n g N C，L a m M P，P i n g P Mo 1 C e l l P r o t e o mi c s 2 0 1 2 ， 1 1 ( 1 2 ) ： 1 5 8 6 1 5 9 4 Ku ma r A，Ag a r wa l S，He y ma n J A，Ma t s o n S，He i d t ma n M，P i c c i fil l o S ，Uma n s k y L，D r a wi d A，J a n s e n RL i u Y C h e u n g K H，Mi l l e r P，G e r s t e i n M ，Ro e d e r GS，S n y d e r M G e n e De v ，2 0 0 2， 1 6 ( 6 ) ： 7 0 7 7 1 9 Hu h W K，F a l v o J V，G e r k e L C，Ca r r o l l A S ，Ho ws o n R W ，We i s s ma n J S ， O S h e a E KNa t u r e ， 2 0 0 3， 4 2 5：6 8 6 6 9 1 O z a w a T，S a k o Y ，S a t o M ，Ki t a mu r a T，Ume z a wa YNa t Bi o t e c h n o 1 ， 2 0 0 3，2 1： 2 8 7 2 9 3 Vi e i r a H L，Ha o u z i D，E1 Ha me l C，J a c o t o t E，Be l z a c q A S，B r e n n e r C，K r o e me r GC e l l De a t h D ，2 0 0 0， 7 ( 1 2 ) ： 11 46-l 1 5 4 T o n g W H，Ro u a u l t T 佃 0 J， 2 0 0 0，1 9： 5 6 9 2 5 7 0 o Z alt s man Y，S h a c h n a i L，Yi v g i O h an a N，S c h w a r z M ，Ma r y a n o v i c h M，Ho u t k o o p e r R H，Va z F M，De L e o n a r d i s F F i e r mo n t e G，P almi e r i F，G i l l i s s e n B，Dani e l P T， J i me n e z E，Wals h S ，K o e h l e r C M， R o y S S ， Wa l t e r L， H a j n o c z k y G， G r o s s AN a t C e I I B i o Z ， 2 0 1 0 ，l 2 ( 6 ) ： 5 5 3 5 6 2 C h e n T T，T i a n X，Uu C L，G e J ，C h u X，L i Y F AmC h e mS o c ， 2 0 1 5 ，1 3 7 ( 2 ) ： 9 8 2 9 8 9 Ra r d i n M J ，Ne w man J C，He l d J M，C u s a c k M P，S o r e n s e n D J， U B，S c h i l l i n g B ，Mo o n e y S D，Ka h n C R ，V e r d i n E， G i b s o n B W P r o c N a t 1 A c a d S c i U S A， 2 0 1 3， l l 0 ( 1 6 ) ： 6 6 0 1 6 6 0 6 加 l 2 6 4 分 析 化 学 第 4 3卷 5 0 G fims md P A，C a r s o n J J ，He b e r t A S，Hu b l e r S L，Ni e mi N M，B a i l e y D J ，J o c h e m A，S t a p l e t o n D S，Ke l l e r M P， We s t p h a l l M S ， Y a n d e l l B S， A t t i c A D， C o o n J j ， P a g l i a r i n i D J C e l l Me t a b ， 2 0 1 2， 1 6 ( 5 ) ： 6 7 2 6 8 3 5 1 D e n g W J ， N i e S ， D ai J ， wu J R， Z e n g R Mo 1 C e l l P r o t e o m i c s ， 2 0 1 0 ， 9 ( 1 ) ： 1 0 0 1 1 6 5 2 J o h n s o n D T，Ha r r i s R A，F r e n c h S，B l a i r P V，Yo u J ，B e mi s K G，Wa n g M ，Ba l a b a n R S A m， P h y s i o l c e 2 2 ， 2 伽盯， 2 9 2 ( 2 ) ： C 6 8 9 C 6 9 7 5 3 L o t z C，L i n A J ，B l a c k C M，Z h a n g J ，L a u E，De n g N，Wa n g Y， Z o n g NC，C h o i J H， Xu T，L i e m D A，Ko r g e P，We i s s J N， H e r m j a k o b H， Y a t e s J R， 3 r d ， A p w e i l e r R， P i n g P P r o t e o m e R e s ， 2 0 1 4 ，1 3 ( 2 ) ： 4 3 3 4 4 6 5 4 C a p a l d i R A， Ha l p h e n D G， Z h a n g Y Z， Y a n a m u r a W J B i o e n e r g B io m e mb r ， 1 9 8 8 ， 2 0 ( 3 ) ： 2 9 1 - 3 1 1 5 5 K i r b y D M， T h o r b u r n D R T w i n R e s H u m G e n e t ， 2 0 0 8 ，l 1 ( 4) ： 3 9 5 4 l 1 5 6 B u r t e F， d e G i r o l a m o L A， H arg r e a v e s A J ，B i l l e t t E E P r o t e o m e R e s ， 2 0 1 1 ， 1 0 ( 4 ) ： 1 9 7 4 1 9 8 6 5 7 Ki m H K，P a r k W S，K a n g S H，Wa r d a M，Ki m N，K0 J H，P r i n c e Ae l B，Ha n J Am P h y s i o l C f 2 ，2 0 0 7， 2 9 3 ( 2 ) ： C 7 6 1 一 C 7 7 1 5 8 C h e n Y W ，C h o u H C，L y u P C，Yi n H S，Hu a n g F L，C h a n g W S，Fa n C Y ，T u I F，La i T C，L i n S T，L u Y C， wu C L ，H u a n g S H， C h a n H L F u n c t I n t e g r G e n o m i c ， 2 0 1 1 ， l 1 ( 2 ) ： 2 2 5 2 3 9 5 9 V i g a n o A， a s s o M， C ar e t t i A， B r a v a t a V， T e r r a n e o L ， F a n i a C， C a p i t a n i o D， S a m a j a M， G 出 C P r o t e o m i c s ， 2 0 1 1 ，l 1 ： 42 0 2-421 7 6 0 L i u T， C h e n L ， K i m E， T r a n D， P h i n n e y B S ， K n o w l t o n A A L if e S c i ， 2 0 1 4 ，1 0 1 ： 2 7 3 6 6 1 Ec c l e s t o n H B，An d r i n g a K K ，B e t a n c o u r t A M ，Ki n g A L，Ma n t e n a S K，S wain T M ，T i n s l e y H N，No l t e R N ，N a g y T R， A b r a ms G A， B a i l e y S MA n t i o