基因工程菌稳定性分析.ppt

基因工程菌稳定性分析,基因工程菌稳定性分析,Slide 1,第一节 基因工程菌的概述,第二节 质粒载体不稳定现象及类型,第三节 提高质粒稳定性的方法,第四节 影响质粒载体稳定性的主要因素,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,第一节 基因工程菌的概述,一、 基因工程菌的定义 基因工程菌( Gene Engineering Bacteria) 是利用基因工程技术，将外源目的基因导入宿主细胞使其表达所需蛋白的重组菌。 二、基因工程菌构建的基本路线 目的基因获取-目的基因扩增-基因重组-重组载体导入受体菌-筛选导入成功的受体菌,第一节 基因工程菌的概述,三、质粒的稳定性问题 基因工程技术是生物技术的核心和关键，通过载体向受体细胞或细菌转入目的基因，从而使其表达一系列与人类健康有关的重要物质，如抗生素、氨基酸、疫苗等，在医药、环境治理等行业有广阔应用前景。但是，质粒的稳定性问题是基因工程技术工业化的瓶颈。,第二节 质粒载体不稳定现象及类型,一、质粒载体不稳定的现象： 克隆有外源基因的质粒载体转移到大肠杆菌受体细胞之后，会产生一系列的生理效应，影响到自身的稳定性； 可能引起形态学上的变化：丝状现象和脆性增加； 产生无质粒的突变体或拷贝数低的突变体； 结构重排导致无法正常表达的突变体。,第二节 质粒载体不稳定现象及类型,二、质粒载体不稳定性的类型 结构不稳定 指结构(序列)不稳定性, 即重组质粒上某一区域的DNA 序列发生插入、缺失、重排和修饰等现象, 导致其表观生物学功能的丧失; 分离不稳定 指细胞分裂的过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增殖为无质粒的优势群体。,第二节 质粒载体不稳定现象及类型,1. 结构不稳定 原因：DNA的丢失，插入和重排。人工构建的多个串联启动子的质粒载体容易发生丢失作用。寄主染色体及质粒载体的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的不稳定性。 共同特征：同向重复序列之间的同源重组（short direct repeat). 例如：用含有酪氨酸操纵子的多拷贝质粒载体转换大肠杆菌tryR菌株时，由于IS1因子的插入效应，结果产生出具有插入或者缺失的修饰型的质粒载体。,第二节 质粒载体不稳定现象及类型,2. 分离不稳定 原因：细胞分裂过程中的质粒的不平均分配。 由于缺陷性分配（defective partitioning）所造成的质粒的丢失现象叫做质粒分离的不稳定性。 质粒稳定遗传的两个必要条件：一、平均每个时代每个质粒至少发生一次复制；二、细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须分配到两个子细胞中去。,第二节 质粒载体不稳定现象及类型,三、质粒拷贝分配到子细胞的途径 质粒拷贝分配到子细胞的途径可分为主动分配和随机分配两种不同的方式。 1 主动分配的方式有两种: 平均分配-每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配-只有一对质粒呈主动分配，其他的随机 分配,第二节 质粒载体不稳定现象及类型,由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳定。,第二节 质粒载体不稳定现象及类型,2 随机分配 在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞中随机分配。,第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素,影响质粒载体稳定性的主要因素 新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应 拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应,第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素,1. 新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应 质粒载体增加给宿主细胞DNA复制效应曲线。即宿主细胞生长速度与质粒载体的分子量的大小成正比，克隆的外源DNA段越大，寄主细胞生长缓慢的时间就越长。,第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素,2. 拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响 差异：同样的大肠杆菌培养物中，每个细胞所拥有的质粒载体拷贝数是不尽相同的，这种不同的细胞个体之间的质粒载体拷贝数差异程度，简称差度。 无质粒载体细胞的速度是由分裂细胞中的质粒载体拷贝平均值数决定的。 差度是影响质粒载体丢失的速率，也是造成质粒载体不稳定的原因之一。,第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素,具有低差度分布特性的质粒载体相当的稳定性，具有高差度分布特性的质粒载体稳定性较差。位于后者的这种分布的低拷贝数的一段产生无质粒载体细胞的频率相当高。,第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素,3. 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应 质粒寡聚体，其稳定性比单体差，同样是造成质粒不稳定性的重要原因之一。 寡聚化作用普遍存在于含有大分子量插入片段的克隆载体。实验证明，pBR322派生载体中，寡聚化程度与插入片段大小存在相关性。 决定大肠杆菌培养物中含质粒寡聚体细胞的比例有两种主要的因素：一、质粒DNA分子间的重组频率；二、含质粒寡聚体细胞生长速率。,第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素,影响质粒重组的突变同样也会影响质粒的稳定性。实验观察表明，在重组缺陷(rec-)的大肠杆菌寄主细胞中，基因工程常用载体pBR322和pUC当以单体形式存在时最稳定。随着质粒寡聚体比例的逐渐上升，其稳定性就相应的下降。,第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素,菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。,生长数率/h,0.2,0.4,质粒拷贝数,1,0.5,950,40,0,-半乳糖苷酶工程菌的连续养,第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素,一般情况下,质粒的结构不稳定性可以通过宿主菌株的谨慎和恰当的选用来消除。因此在质粒 不稳定性的研究过程中, 人们关注最多的,通常是质粒的分离不稳定性。,第四节 提高质粒稳定性的方法,高密度培养 基因工程菌 选择培养基 周期操作 固定化基因工程菌,第四节 提高质粒稳定性的方法,1. 高密度培养对基因工程菌稳定性的影响 为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法：先使菌体生长至一定密度，再诱导外源基因的表达。,第四节 提高质粒稳定性的方法,由于第一阶段先使菌体生长至一定密度，外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。 在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。 调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。,第四节 提高质粒稳定性的方法,有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。,第四节 提高质粒稳定性的方法,2. 基因工程菌的构建对质粒稳定性的影响 一般, 质粒的结构不稳定性可以通过宿主菌株的谨慎和恰当的选用来消除。宿主菌株通常有苏云金芽胞杆菌、根瘤菌、酒精酵母和大肠杆菌等。 例如，大肠杆菌获得外源基因的高效表达：可以选用T7、PRPL、Ptac 等强启动子, 通过对翻译增强序列和转录终止序列的改进和优化; 可以按照大肠杆菌系统偏爱的密码子和mRNA二级结构进行目的基因的设计和合成 。,第四节 提高质粒稳定性的方法,3. 选择培养基对质粒稳定性的影响 常用选择性培养基对基因工程菌进行培养,这样可提高带质粒菌的竞争力。一般是在质粒上引入抗生素基因, 再向培养基中加入抗生素, 这对提高质粒分离稳定性非常有效。,第四节 提高质粒稳定性的方法,4. 周期操作对基因工程菌质粒稳定性的影响 一是在这种瞬变的环境中, 重组细胞快速地适应了该环境, 从而降低了无质粒细胞的相对生长优势; 二则可能是在这种瞬变的环境下, 细胞被诱导以保持较高的质粒拷贝数, 而质粒拷贝数的增加降低了由于随机分配而导致质粒损失的概率。,第四节 提高质粒稳定性的方法,5. 固定化基因工程菌对质粒稳定性的影响 质粒的不稳定性对基因工程菌的培养和产物的生产有着极大的影响, 将基因工程菌固定化后培养可提高基因工程菌的稳定性、生物量和克隆基因产物的产量。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,对成功构建的腈水合酶 (Nitrile Hydratase, NHase) 高表达的重组大肠杆菌E.coli BL21( DE3 )/pETNHM(Kanr)的重组质粒 pETNHM在重组菌株中的质粒稳定性进行了研究分析。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,1. 质粒pETNHM的结构稳定性 质粒pETNHM 是将 -亚基起始密码子突变的诺卡氏菌腈水合酶基因插入商品化的pET28a(+) (Novagen公司)质粒载体而得到的，插入位点为NcoI和BamH I 。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,在LB培养基中对重组E.coli BL21(DE3) /pETNHM 每隔6h进行反复的传代培养,约60代后收获细胞提取质粒,并对初始构建的质粒和传代培养后的质粒分别以EcoT 22I单酶切及Nco I和BamH I双酶切，然后琼脂糖凝胶电泳。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,由图可见,连续传代60代后收获的质粒样品采用 EcoT22 I单酶切及Nco I和BamH I 双酶切后,分别获得了与初始质粒完全相同的预期长度基因片段(EcoT22 I单酶切:4.1kb、2.2kb和0.3kb,其中0.3kb的片断因为太小而在琼脂糖凝胶电泳中检测不到; Nco I和BamH I双酶切:5.3kb 和1.3kb) 。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,进一步将连续复制 60代后的质粒转入宿主 E. coli BL21(DE3),并对重组菌进行腈水合酶的诱导表达,结果表明腈水合酶能够正常表达。证明质粒pETNHM确实具有良好的结构稳定性,即使经过长时间连续复制,也没有产生DNA序列的明显自发突变。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,质粒的分离不稳定性是质粒不稳定性的主要因素, 历来受到学者们的高度重视。大量研究表明, 宿主的新陈代谢负荷、质粒的寡聚化效应及在缺陷性分配过程中造成的拷贝数差度等, 均是产生无质粒细胞的重要因素, 而不利的环境条件及无质粒细胞的生长竞争等则是进一步扩大质粒分离不稳定性的重要原因。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,2.质粒 pETNHM的分离不稳定性及抗生素选择压力的影响 抗生素的选择压力是保证质粒分离稳定性的重要因素。分别在LB和LBK培养基中对重组菌BL21 ( DE3 ) /p ETNHM进行反复的传代培养, 以考察重组菌株的分离不稳定性及宿主细胞连续分裂时Kan的添加对质粒稳定性的影响。为了保证所有的细胞均具有分裂能力, 确定传代时间为6h,即当细胞处于对数生长后期时进行传代。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,在没有抗生素选择压力的L培养基中, 当重组菌细胞连续分裂约48次左右时, 质粒就开始丢失,含质粒细胞(P+)的百分率逐渐下降; 当世代数增大到约66代时,质粒丢失率接近90%,说明质粒pETNHM具有分离不稳定性, 宿主细胞的连续高速分裂将导致质粒的丢失。 而在LBK培养基中,由于抗生素Kan选择压力的存在,含质粒细胞P+菌的百分率在传代过程中一直保持恒定。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,3.质粒特性对pETNHM分离不稳定的影响 在重组菌细胞中, 质粒载体的拷贝数是影响质粒分离不稳定性的重要因素。对于松弛型质粒载体, 一般情况下, 伴随着细胞的分裂, 质粒以随机方式分配到子细胞中,质粒拷贝数越高, 出现无质粒载体细胞的概率就越低, 质粒也就越稳定。而质粒载体的寡聚化效应会导致质粒载体的拷贝数大大降低, 从而通常会加重质粒的分离不稳定性。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,分别收获在LB培养基中连续传代培养30代、60代及 经 过 诱 导 大 量 表 达 腈 水 合 酶的BL21(DE3 ) /pETNHM细胞，利用试剂盒提取质粒，进行0.7%的琼脂糖凝胶电泳，并以原质粒为对照，电泳。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,重组质粒 pETNHM除了在4.8kb处(理论长度 6.6kb,由于环状质粒形成超螺旋,所以出现在4.8kb位置)出现条带以外,还在10kb左右出现了强条带。回收纯化10kb左右的质粒 DNA, 分别采用Nco I和BamH I对其进行单酶切, 酶切后电泳。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,酶切后仅得到一条长度均为6.6kb的线性质粒条带, 是重组质粒pETNHM长度的理论值, 说明酶切前的样品为pETNHM的二聚体。就是说,重组质粒pETNHM在宿主L21(DE3)中, 主要以单体和二聚体2种形式同时存在, 且由Total Lab软件的定量分析可知,这2种形式的质粒比为12。由于质粒的寡聚化效应会降低重组质粒的拷贝数,故而大量形 成的重组质粒pETNHM的二聚体不利于质粒的分离稳定性。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,4.连续传代及诱导产酶对质粒pETNHM的拷贝数的影响 质粒 pETNHM属于松弛型,应该具有较高的拷贝数。分别取2.4ml在LB培养基中传10代、30代以及经过诱导产酶的BL21(DE3)/pETNHM菌液(细胞计数结果分别为2.16109个/ml 、1.92109个 / ml及1.87109个/ml),小心提取质粒,分别获得1 00l质粒样品。各加样3l进行0.7%琼脂糖凝胶电泳, 同时加入3l(150ng)DNA Marker作参照 。采用Total Lab软件计算可知, 3 条泳道中质粒的质量分别为77.6,46.2和21.8ng。则3种菌液收获的质粒的理论产量分别为 0.92g /ml、0.55g/ml和0.26g/ml,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,因pETNHM单体的分子大小为6600bp,每单位碱基对的平均质量为1.05910-15g,因此pETNHM单体的分子质量为:6.98910-12g(即4.21103kDa )。计算表明, 3种菌液中重组质粒pETNHM的拷贝数(以单体计)分别为61、41和20。,第五节 对NHase重组质粒稳定性分析,结果分析： 在不同的传代培养和诱导表达条件下, 重组质粒pETNHM在宿主细胞中的拷贝数差异很大。首先, 长时间的传代培养会使质粒的复制能力有所降低,从而使拷贝数减少。其次, 菌体经诱导产酶后, 由于蛋白表达过程需要占用较多的能量、营养和前体物质, 所以也会导致质粒拷贝数的下降, 从而影响质粒的分离稳定性。此外, 由于以二聚体形式存在的重组质粒在宿主细胞中约占总量的2/3 , 而