流式细胞仪分析技术及应用.ppt

流式细胞仪 分析技术及应用,FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。,什么是流式细胞术(FCM)？,特点: 单细胞的流动的 活细胞的 定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞,第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 第二节 数据的显示与分析 第三节 流式细胞仪分析的技术要求 第四节 流式细胞术在免疫学检查中应用,一 工作原理： FCM是一种在计算机技术支持下的高度 自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。,第一节 流式细胞仪的分析及分选原理,1、液流系统 样品流和鞘流 2、光学系统 激光、透镜组、 光电倍增管等。 3、数据处理系统,(一） 基本组成构,Injector Tip,荧光信号,激光束,Sheath fluid,样品流和鞘流,1、液流系统,PMT,PMT,PMT,PMT,Dichroic,Filters,Bandpass,Filters,Laser,1,2,3,4,Flow cell,激光、透镜组、光电倍增等。,2、光学系统,（二） 基本工作原理,单细胞流：流动室,单细胞照明：激光,488 nm laser,488 nm laser,单细胞检测：信号处理,（一）前向散射光 (foword scatter)：FSC 信号的强弱与细胞的大小相关 （二）侧向散射光（side scatter)：SSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关,二 散射光的测定,Forward Angle Light Scatter,细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.,90 Degree Light Scatter,细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.,前向散色光FSC,侧向散色光SSC,利用前向角和 测向角散射光可 以把外周血白细 胞分成三群，淋 巴细胞、单核 细胞和粒细胞。,散射光的测定,荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 （一）光信号测量 线性放大器 对数放大器,三 荧光测量,Ethidium,PE,cis-Parinaric acid,Texas Red,PE-TR Conj.,PI,FITC,Common Laser Lines,DNA,Excitation,Emisson,300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm,（二）荧光补偿,利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻 荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”,（一）分选的基本原理,488 nm laser,-,Charged Plates,Single cells sorted into test tubes,FALS Sensor,Fluorescence detector,四 细胞分选原理,阳性选择,MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分离,阴性选择,1 、分选速度：几千个细胞/秒 2 、分选纯度:99.5%左右 3 、分选收获率:90-95% 4 、分选得率,（二）分选的技术要求,分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞 所占的百分比。 分选收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原 细胞样品中该亚群细胞数的百分比。,第二节 数据的显示和分析,一、参数 前向散射光FS: 反映颗粒的大小 侧向散射光SS: 细胞内部结构复杂程度 荧光FL: 细胞被染上荧光部分数量的多少,二、数据的显示方式,（一） 单参数直方图,（二） 双参数显示,（三） 三参数显示,以分布直方图( distribution histogram ) 来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是 道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。 纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。,(一) 单参数直方图的显示,Single-Parameter Histogram Displays,X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.,(二)双参数数据的显示 Two-Parameter Data Displays,细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞 数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。,纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量 参数,在图中每一个点代表一个细胞,1 、点图,用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相 同，不同的等高线上细胞数不同。,2 、二维等高图,纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。,3 、假三维等高图,三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。,(三) 三参数直方图,一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate) 技术，来分析参数之间的相互关系。,（四）流式细胞仪的多参数分析,1 、Region设置,2 、 设置,Gate,样品制备：单细胞悬液 特定荧光染料的选择：光谱重叠 阴性对照的设置:检测标本的重复性 质量控制,第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求,细胞碎片 细胞团块 离心漂洗 固定剂,一、免疫检测样品制备,淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。 Ficoll,40kd，高密度，低渗透压，无毒性。 （比重为1.01770.001的分层液).,（一）外周血淋巴细胞样品的制备,利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血 中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图,单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备 成单细胞悬液。,（二) 培养细胞的样品制备,机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。 酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。 化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。 表面活性剂处理法： Triton-100、皂素等。,(三)新鲜实体组织单细胞悬液的制备,机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。 如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等， 也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片 的干扰。 酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能 少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光 染色处理不受影响。,防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法： 1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。 2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。 3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但 细胞表面荧光染色分析不受影响。,(四）单细胞悬液的保存,染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生 （一）免疫荧光标记最常用的荧光染料,荧光染料 激发波长（nm) 发射波长（nm) 颜色,FITC 488 525 深蓝色 PE(RDI) 488 575 橙色 ECD 488 620 橙红色 PeCy-5 488 670 红色 PeCy-7 488 755 深红色 PI 488 620 橙红色 APC 633 670 红色,FITC 488 525 深蓝色 PE(RDI) 488 575 橙色 ECD 488 620 橙红色 PeCy-5 488 670 红色 PeCy-7 488 755 深红色 PI 488 620 橙红色 APC 633 670 红色,二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色,用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在 488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光 染料产生的荧光信号。,PE,CY5,CY5,488nm,能量传递染料：,荧光染料与细胞成分的结合方式： 结构亲和方式 嵌入结合方式 共价结合方式 荧光抗体特异性结合方式 1、直接免疫荧光染色 2、间接免疫荧光染色,（二）免疫荧光标记,3、双或多参数荧光抗体的组合标记,FITC+PE 488 525 、575 绿色、橙色 FITC+T red 488 525 绿色 568 615 红色 FITC+PeCy5 488 525、 675 绿色、 红色 FITC+ ECD 488 525、 625 绿色、橙红色 F+P +PeCy5 488 525、575、675 绿、橙、红色 F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 绿、 橙红色、红色 F+P+APC 488 525 、 575 绿色、橙色 633 670 红色,荧光染料 激发波长（nm) 发射波长（nm) 颜色,FITC的激发 波长处于自发 荧光的光谱区 内，因此FITC 荧光易受自发 荧光的干扰。,(三) 细胞的自发荧光,（一）单细胞悬液制备的质量控制 （二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制 1、温度对荧光染色的影响 2、pH对荧光发射强度的影响 3、荧光染料浓度的控制 4、固定剂对荧光染色的影响 （三）仪器操作技术的质量控制,三、流式细胞免疫学技术的质量控制,1、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为 同型对照（阴性对照） 2、全程质控：在流式检测中，样品标记、溶血、 洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影 响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控， 使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。,（四）免疫检测的质量控制,一、淋巴细胞及其亚群的分析 淋巴细胞是机体免疫系 统中的一群重要细胞群， 是参与免疫调节和执行细 胞免疫功能的免疫活性细 胞，T细胞、B细胞和NK 细胞，各自发挥不同的作 用。,第四节 流式细胞在免疫学检查中的应用,三色标记 淋巴细胞,T、 B、,NK,1、Th 细胞： CD3+ CD4 + CD8- T细胞，能辅助B 细胞分化成熟生 成抗体产生细胞 （桨细胞），参 与促进细胞介导 的免疫应答。,（一）淋巴细胞及其亚群分析,2、Tc细胞： CD3+ CD4 - CD8 +T细胞， 能特异性直接杀伤 靶细胞，所有表达 MHC I类分子的靶 细胞。抗肿瘤免疫， 抗病毒感染，移植 排斥反应和自身免 疫疾病中均起了重 要作用。,B细胞约为5%-10%，标志 为BCR，膜表面免疫球蛋白 （Smlg）。表达CD19、 CD20、CD21、CD22分子。 B细胞也是免疫系统重要 的免疫细胞，主要功能是 介导体液免疫。抗原递呈 细胞，能摄取、加工和递 呈抗，同时还能分泌细胞 因子调节免疫应答。,(二）B淋巴细胞及其亚群,自然杀伤细胞（Natural killer cell,NK 细胞）为一 组大颗粒的淋巴细胞，5%-10% 左右，标志CD16、CD56、 CD2、CD11a/CD18。用三色荧光标记将CD3-CD16+CD56+淋巴 细胞定为NK细胞。主要功能是参与细胞免疫，在肿瘤免疫 抗病毒感染中均起重要作用。,（三）NK细胞分析,（一）细胞介导细胞毒性试验 （二）细胞内细胞因子测定 小分子可溶性蛋白质 T细胞和巨噬细胞 参与细胞免疫、体液免疫、炎症反应、造血调控、 细胞增殖和分化、损伤修复重要生理和病理过程。,二、淋巴细胞功能分析,流式细胞细胞因子分析图,流式细胞细胞因子分析图,三、淋巴造血系统分化抗原 及白血病免疫分型,用多参数 FCM测定白血病免疫表型可以把病人 血液中幼稚的白血病细胞和正常的白细胞区分开。 根据白血病细胞所表达相关细胞的种系抗原，将白血病细胞分为B细胞系(CD19,CD20),T细胞系(CD7,CD3)，髓细胞系(CD13,CD33)以及红细胞系(glycophorin A)和巨噬细胞系(CD61)。,幼稚白血病细 胞的表型分析,在肿瘤病人使用化疗药物中，会产生药物的耐受。当