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1,第一章 免疫学基础知识,南充中心医院免疫室 李欣,2010. 4. 3,2,一、免疫（Immune）的定义,免疫的最初概念：免除瘟疫 免疫的传统概念：抗感染免疫 现代免疫的概念：是机体识别“自身”与“非己”抗原，对“非己”抗原产生排斥作用，对自身抗原形成天然耐受的一种生理功能。,第一节 免疫的基本概念,3,正常情况下，这种生理功能对机体有益，可产生抗感染、抗肿瘤和维持机体生理平衡及稳定的保护作用。 当免疫功能失调时，在一定条件下，也会对机体产生不利的影响，如：超敏反应、自身免疫病和肿瘤等。,4,二、免 疫 的 功 能,免疫功能是免疫系统在识别和清除“非己”抗原的过程中所产生的各种生物学作用的总称。主要包括： 1.免疫防御（Immunologic defence)： 是机体针对外来病原体的抗感染功能。正常时可防御病原体的感染；防御功能过强可产生超敏反应，过弱则表现为免疫缺陷。,5,2.免疫自稳(immunologic homeostasis)： 免疫系统维持机体内环境相对稳定的生理机能。 正常：可及时清除体内损伤、衰老、变性的细胞和抗原抗体复合物，而对自身成份保持免疫耐受； 异常：可发生生理功能紊乱、自身免疫病等。,6,3.免疫监视(immunologic surveillance)： 是机体免疫系统识别、清除体内突变、畸变细胞以及被病毒感染细胞的生理性保护作用。 丧失：机体突变细胞失控，可能导致肿瘤发生或出现病毒的持续感染。,7,8,三、免疫的类型及其特征,一、固有免疫： 概念：出生时即有的天然免疫，经遗传获得，非特 异性，也称非特异性/先天性免疫。 组成：屏障结构、吞噬细胞、某些体液因子。 二、适应性免疫： 概念：出生后接触特定抗原获得的针对该物质 的免疫，也称获得性/特异性免疫。 包括 体液免疫、细胞免疫。,9,第二节 抗原基础知识 一、抗原概念（antigen，Ag） 是能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答、并能与相应的应答产物（抗体和/或效应淋巴细胞）在体内或体外发生特异性结合的物质。,10,二、抗原的特性 1 免疫原性： 抗原能刺激特异性免疫细胞，使之活化、增生、分化，最终产生抗体和效应淋巴细胞的特性。 2 免疫反应性: 抗原可在体内、外与 相应的抗体/效应淋巴细胞发生特异性结合，产生免疫反应的特性。,11,三、完全抗原、半抗原、载体 1、完全抗原 （complete antigen): 既有免疫原性又有抗原性的物质，如多数蛋白质分子。 2、半抗原（Hapten):又称不完全抗原，单独存在时只具有免疫反应性而无免疫原性的物质，如二硝基酚、青霉素。,12,3、载体 与半抗原结合后使其具有免疫原性的物质，即半抗原+载体=完全抗原。 四、 耐受原与变应原 1 耐受原 (tolerogen):引起机体产生免疫耐受的抗原。 2 变应原 (allergen): 引起机体产生变态反应的抗原。,13,五、 抗原的特异性与交叉反应,免疫原性的特异性：某种抗原只能刺激机体产生某种特定的应答产物。 如：伤寒杆菌免疫动物产生抗伤寒杆菌抗体 抗原性的特异性：抗原只能与其相应的抗体或致敏淋巴细胞结合。 如：伤寒杆菌只能与抗伤寒杆菌抗体结合,14,1 、 表位与抗原决定簇 抗原决定簇（antigenic determinant,AD）: 又称表位（epitope），指抗原分子中决定 抗原特异性的特殊的化学基团，是抗原分子与抗体及TCR/BCR受体特异结合的部位，也是被免疫细胞识别的标志及免疫反应具有特异性的物质基础。 表位的性质、数目和空间构象决定了抗原 的特异性。,15,2、抗原抗体反应的特异性 抗原的特异性是相对的，因为天然的抗原分子表面可存在着多种表位，不同的抗原分子表面存在相同或相似的表位，可引起交叉反应。 3、抗原结合价： 能和相应抗体结合的功能性表位的数目 半抗原 单价 天然抗原 多价 多价抗原可同时与多种/多个抗体结合,16,4、 共同抗原和交叉反应 （1）共同抗原：两种或两种以上抗原具有的相同或相似的表位。,表位1,表位2,表位3,表位1,A抗原,B抗原,17,（2）交叉反应：抗体与具有相同或相似的表位的 抗原之间出现的反应。 血 清(Ab1、Ab2) + AgA 特异性反应 Ab1+AgB 交叉反应 意义 与疾病发生有关：如急性肾小球肾炎 用于疾病诊断：如外斐反应,表位1,表位3,表位1,A抗原,B抗原,表位2,18,1、病原微生物及其代谢产物 （1）病原微生物 如细菌、病毒、螺旋体，对机体有较强的免疫原性。 （2）细菌的代谢产物 外毒素： 类毒素:外毒素经0.3%-0.4%的甲醛处理后,使其失去毒性而保留免疫原性的物质。,六、 医学上重要的抗原,19,2、动物免疫血清 用类毒素免疫动物后，动物的血清中可含有大量的抗毒素，即动物的免疫血清。这种抗血清对人体而言既提供特异性抗体，又是异种蛋白。 3、异嗜性抗原 又称Forssman抗原，指一类与种属无关，存在于人、动物、植物和微生物之间的共同抗原。如：溶血性链球菌/人肾小球基底膜之间的共同抗原。,20,4、同种异型抗原 同一种属不同个体之间的不同抗原。如人类的ABO、Rh血型抗原、HLA等。 5、自身抗原 隐蔽的自身抗原与自身免疫系统隔绝的组织受到外伤等因素而暴露，如：脑组织、精子外伤暴露。被修饰的自身抗原自身组织在理化、生物等作用下结构发生改变，如：变性的IgG。,21,6、肿瘤抗原 肿瘤特异性抗原（Tumor Specific Antigen，TSA）肿瘤相关抗原（Tumor Associated Antigen，TAA） 7、超抗原(super antigen,SAg) 只需极低浓度即可激活5%-20%T细胞克隆，产生极强的免疫应答的抗原。,22,8、其他 有丝分裂原： 植物血凝素、刀豆蛋白A T细胞 细菌脂多糖、葡萄球菌A蛋白 B细胞,23,七 佐剂 概念： 一类与抗原一起或预先注入机体，能增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强剂。如：羊毛脂，石蜡油，内毒素。常见为福氏佐剂。,24,第三节 免疫球蛋白,25,一概 述,Ab：是由抗原刺激B 淋巴细胞转化为浆细胞后所产生，并能与相应抗原特异性结合、具有免疫功能的球蛋白，也称为抗体（antibody,Ab）。,Ig：把具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。,26,Ig与Ab的关系,Ig与Ab的区别：Ig是化学结构的概念，Ab 是生物学功能的概念。所有的Ab都是Ig，但Ig并非都有抗体活性。,Ig,Ab,27,二、Ig的基本结构 1、基本结构：由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键连接而成的四肽链结构。,28,抗体的立体模型,29,Ig的基本结构,30,2、免疫球蛋白的功能区,VH和VL：与抗原特异性结合的部位； CL和CH1：某些同种异型Ig遗传标记； IgG的CH2、IgM的CH3： 补体C1q结合点 激活补体经典途径； CH3/CH4 结合不同细胞表面FcR 不同生物学效应。,31,1、IgG 血清含量最多；半衰期最长； 出生后3个月开始合成，3-5岁接近成人水平； 是唯一能通过胎盘的Ig，发挥自然被动免疫功能； 具有活化补体经典途径的能力（IgG3IgG1IgG2）； 具有调理作用、ADCC作用。 是主要的抗感染抗体，具有抗菌、中和病毒和中和毒素的作用；,三五类Ig的特性和功能,32,2、IgM,为五聚体，分子量最大，称为巨球蛋白； 个体发育中最先出现的Ig，胚胎晚期即能产生，脐带血IgM增高提示胎内感染（如风疹病毒、巨细胞病毒感染等）； 抗原刺激机体时，是体内最先产生的Ig；血清IgM升高说明有近期感染； 有强大激活补体能力，在机体免疫防御的早期中具有重要作用。,33,3、IgA,有单体的血清型和分泌型IgA； 分泌型IgA是机体粘膜局部抗感染免疫的重要因素（呼吸道和消化道）； 初乳中的sIgA可对婴幼儿发挥自然被动免疫作用。 4、IgE 属亲细胞抗体，可与肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面FcR结合，介导I型超敏反应； 是血清中含量最低的Ig； 主要由呼吸道、胃肠道粘膜固有层的浆细胞产生。,34,5、IgD,血清中含量低，其生物学作用尚不清楚； SmIgD可作为B细胞分化成熟标记，成熟B细胞同时表达SmIgM和SmIgD。,35,4免疫球蛋白的生物学活性,(1)特异性结合抗原 (2)激活补体 (3)通过与细胞FcR结合发挥生物效应： (4)选择性传递 IgG通过胎盘；sIgA穿过粘膜的功能 (5)具有免疫原性,36,免疫球蛋白的功能,37,第二章 抗原或抗体的检测,南充中心医院免疫室 李欣,38,第一节 概述,抗原-抗体反应包括沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应和中和反应等。 抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。 免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。,39,一抗原-抗体反应的特点,抗原-抗体的结合是特异性结合,抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合,抗原抗体反应可分为两个阶段 特异性结合阶段 可见的反应阶段,抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现 象，于两者的分子比例密切相关,40,抗原抗体比例对反应现象的影响,41,42,二抗原-抗体反应受多种因素影响,1 电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液 ，以供给适应浓度的电解质。 2 温度：一般常使用反应在37度水浴 或孵育箱中进行。 3.酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度 为PH6-8。 4.抗原抗体比例,抗原-抗体反应受多种因素影响,43,第二节 抗原抗体的检测方法,凝集反应 沉淀反应 补体溶血反应和补体结合反应 中和反应 用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应,44,一.凝集反应 (Agglutination),细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集 现象，称为凝聚反应。 (1)、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。 (2)、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。,45,血 球 凝 集,46,47,二.沉淀反应 （Precipitation),血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。 1.单向琼脂扩散试验 2.火箭电泳 3.双向琼脂扩散试验 4.对流免疫电泳,48,49,50,51,52,三.免疫标记技术,用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有四种基本类型：免疫荧光技术、免疫胶体金标记技术、免疫酶技术和同位素标记技术。,53,1.免疫荧光显微技术,用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素），与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。 包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。,54,间接免疫荧光法示意图,55,56,用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。,2.免疫荧光测定技术,57,（1）时间分辨荧光免疫技术,原理：TRFIA 是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物，如铕（Eu3+) 来标记抗体、抗原，待反应体系发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。,58,优点：技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽和应用范围广泛等优点，,59,注意：所用试剂和器材务必防尘； Eu3+标记物的溶解和稀释必须尽 量准确，务必在加样1小时内配制。,60,（2）电化学发光免疫分析技术,原理：电化学发光免疫分析技术是继放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法后的最先进的免疫分析方法。电化学发光（ECL）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程。直接以Ru(bpy)32+标记抗体，反应时标记物直接发光。且Ru(bpy)32+在电极表面的反应过程可以周而复始进行，产生许多光子，使光信号得以增强。,61,优点：非放射性标记物避免了放射性核素的污染；磁性微粒（2.8m）为固相载体表面积大，吸附率高，近似均相免疫反应； 链霉亲和素与生物素是最特异及牢固的结合；应用范围广；检测敏感度高；检测所需样本量少。,62,2.酶免疫测定 (Enzyme Immunoassay, EIA),是用酶（常用的有辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶AP) 标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织或细胞表面的抗原。,63,(1).酶联免疫吸附试验(ELISA),将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法BAS-ELISA等。 (2) ELISA方法有: a.双抗体 / 抗原夹心法测抗原 / 抗体: 包被在固相载体上的抗体 / 抗原与加入的待测抗原 / 抗体及酶标抗体 / 抗原三者在一定条件下进行温育反应，若待测样本中含有特异性抗原 / 抗体，则在孔内形成抗体 / 抗原-抗原 / 抗体-酶复合物, 经过严格洗涤后,复合物与底物作用后将显色。,64,b.间接法测抗体： 将抗原包被在固相载体上，样本中含有特异性抗体则结合成抗原抗体复合物，再与加入的酶标记抗抗体结合, 形成抗原抗体酶标抗抗体复合物。酶催化底物显色。 C.竟争法测抗体： 包被抗原于固相载体上，检测时加入样本和酶标记抗体，如样本中含有特异性抗体将与酶标记抗体竟争与包被的固相抗原结合形成抗原抗体复合物，固相上无酶催化底物，而不显色。,65,包被抗体于固相载体上，检测时加入样本、中和抗原和酶标记抗体，如待测样本中含有特异性抗体将与固相抗体竟争中和抗原结合形成抗体抗原抗体复合物，固相上无酶催化底物，而不显色。 d. 固相捕获法测IgM抗体： 将抗抗体（抗人链）包被于固相载体上，如样本中含有特异性抗体则结合成抗抗体抗体复合物，加入抗原及酶标记抗体则进一步形成抗抗体抗体抗原酶标记抗体复合物。酶催化底物并显色。,66,67,68,ELISA原理及分类,69,3.胶体金法,胶体金法，又称金标法，是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法和快速免疫金渗滤法，具有简单、快速、准确和无污染等优点。各类快速检测试纸均采用免疫层析法，大量以塑料为载体的快速检测块均采用快速免疫金渗滤法,70,层析法免疫胶体金检测试剂结构示意图,71,C1金标记鼠抗人HCG; T金标记鼠抗人HCG+HCG+抗HCG; (测定区) C2-多余金标记鼠抗人HCG+羊抗小鼠HCG.(质控区) 此图为双抗体夹心法，显色为阳性；竞争法相反。,72,第三章 肝炎标志物检测,南充中心医院免疫室 李欣,73,第一节 五型肝炎病毒,一.乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒（HBV）是具有复杂结构的DNA病毒，核心内含有一双股DNA和DNA聚合酶，外面有一层含有表面抗原（HBsAg）的外衣 HBV的抗原复杂，其外壳中有表面抗原，核心成分中有核心抗原和e抗原，感染后可引起机体的免疫反应，产生相应的抗体。HBV感染的种属范围很窄，只局限于人和黑猩猩。 1. 乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和表面抗体(抗-HBs)HBsAg存在于病毒颗粒的外壳以及小球形颗粒和管状颗粒。于感染后2-12周，丙氨酸转氨酶(ALT)升高前，即可由血内测到， HBsAg有“a”、“b”、“y”、“r”、“w”等多种抗原决定簇，其中“a”是共同的抗原决定簇，在我国的主要是adr亚型。,74,乙肝病毒解剖模型（1）,75,乙肝病毒解剖模型（2）,76,抗-HBs对同型感染具有保护作用。近期感染者所产HBs属IgM，而长期存在血中的为抗-HBsIgG。 前S1及前S2蛋白具有与HBsAg不同的抗原。完整的HBV颗粒含有S蛋白及前S2蛋白，而缺陷病毒颗粒则无前S1蛋白。血清中出现前S1、前S抗原是HBV活动性复制的标志。 HBsAg阳性患者原发性肝癌的发病概率为正常人的200倍以上； 2. HBcAg主要存在于受染的肝细胞核内，复制后被释至胞浆中，由胞浆中形成的HBsAg包裹，装配成完整的病毒颗粒后释放入血。血液中一般不能查到游离的HBcAg。血中的Dane颗粒经去垢剂处理后可以查到其核心部分的HBcAg和DNA聚合酶。,77,早期出现者主要是抗-HBcIgM，是近期感染的重要标志；抗-HBcIgG出现较迟，但可长期存在。抗-HBc对HBV感染无保护作用。血清中抗-HBcIgM阳性表明体内有HBV复制，且有肝细胞损害；若抗-HbcIgG阳性且滴度高，伴以抗-HBs阳性，则为乙型肝炎恢复期；若抗-HBcIgG呈低滴度，抗-HBcIgM阴性，而抗-HBs阳性，则是既往感染的标志。 3. HBeAg仅存在于HBsAg阳性者的血液中，通常伴有肝内HBVDNA的复制，血中存在较多Dane颗粒和HBVDNA聚合酶活性增高，因此，HBeAg阳性是病毒活动性复制的重要指标，传染性高。急性肝炎患者若HBeAg持续阳性10周以上，则易于转为持续感。,78,HBV是通过接触、血液及血制品、母婴垂直传播等方式传播。在我国约有60的乙肝病毒携带者是通过母婴垂直传播的。 二.甲型肝炎病毒（HAV） HAV属微小核糖核酸病毒 (RNA)主要引起急性感染，经粪口途径传播，有季节性，可引起暴发流行。 三.丙型肝炎抗体(HCV) 测定丙型肝炎抗体是判定急、慢性丙型肝炎的重要指标。丙型肝炎病毒（HCV）是一种具有脂质外壳的RNA病毒 HCV感染者血中的HCV浓度极低，抗体反应弱而晚，血清抗-HCV在感染后平均18周阳转，至肝功能恢复正常时消退，而慢性患者抗-HCV可持续多年并具有传染性。,79,在2个月左右的潜伏期后，只有大约四分之一的病人会出现食欲差、疲倦、黄疸等症状；而大部分的患者却没有任何感觉。而且，感染后大约要经过二十年左右才会出现肝硬化。因此，有很多人根本不知道自己经感染。而丙肝可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌（HCC），对患者的健康和生命危害极大 HCV主要通过输血和血制品来进行传播。,四.丁型肝炎病毒(HDV) 是一种缺陷的嗜肝单链RNA病毒，需要HBV的辅助才能进行复制，因此HDV和HBV同时或重叠感染。,80,五.戊型肝炎病毒（HEV） HEV对氯仿敏感，在4或20下易被破坏，在硷性环境中较稳定。HEV存在于替伏末期及发病初期的患者粪便中。有明显的季节性，多散发于雨季后，粪口传播是主要的传播途径。 甲型和戊型肝炎病毒主要引起急性感染，经粪口途径传播，有季节性，可引起暴发流行。 乙、丙、丁型肝炎常表现为慢性经过，主要经血液传播，无季节性，多为散发，并可发展为肝硬化和肝细胞癌。,81,第二节 五型肝炎病毒 （抗体）检测,82,类风湿性因子（RF）：是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体，主要存在于类风湿性关节炎患者的血清和关节液中，它是一种抗变性IgG的抗体，可与IgGFc段结合。检测方法一般有胶乳凝集试验、双抗原夹心ELISA法、速率散射比浊法。 胶乳凝集试验 ：将变性IgG包被于聚苯乙烯胶乳颗粒上，这种致敏胶乳在与待测血清中的RF相遇时，即发生肉眼可见的凝集。 正常人1：20稀释血清为阴性，操作要求5630分钟灭活，（灭活C1q以阻止假阳性凝集）。,第三节 类风湿诊断,83,临床意义：未经治疗的类风湿性关节炎患者其阳性率为80%，且滴定度常在1：160以上。 RF不是仅在RA患者中出现，在SLE、进行性全身性硬化症等自身免疫性疾病患者和部分老年人中RF的阳性率可达28.9%-50%，因而RF对RA患者并不具有严格特异性，,抗链球菌溶血素“O”，简称抗“O”或ASO 溶血性链球菌产生的一种代谢产物能溶解红细胞，所以这种产物被取名为“O”溶血素，人体感染了A组溶血性链球菌后，“O”溶血素在体内作为一种抗原物质存在。为了测定这种能中和链球菌溶血素“O”的抗体含量，就称为抗链球菌溶血素“O”试验。,84,临床意义:溶血性链球菌感染、猩红热、丹毒、链球性咽炎、扁桃体炎。对风湿热、急性肾小球肾炎有间接诊断价值、若多次检测结果递增，并伴红细胞沉降率加快可有助于诊断。,85,第四章 免疫学检验室内质量控制 （ELISA）,南充中心医院免疫室 李欣,86,质量管理的基本要求,免疫检验要保证检验结果的准确、可靠、及时、有效，并尽可能使各实验室间检验结果 可比性，这是免疫检验质量保证的基本目的。ELISA实验室内质控的重点是对低值弱阳性标本检测的精密性进行检测。临床免疫学检验主要采