免疫排斥与器官移植.ppt

第五章 免疫排斥与器官移植,移植：应用自体或异体的正常细胞、组织、器官置换病变的或功能缺损的细胞、组织、器官，以维持和重建机体生理功能的治疗方法。 移植物：被移植的组织细胞或器官。 供者：提供移植物的个体。 受者：接受移植物的个体。,移植的类型,自体移植：指移植物取自受者自身。 同系移植：指遗传基因完全相同或基本相似个体之间的移植。 同种移植：同种内遗传基因不同的个体之间的移植。 异种移植：不同种属个体间的移植。,移植抗原,概念：引起移植排斥反应的抗原 类型： 1.主要组织相容性抗原 2.次要主要相容性抗原 3.血型抗原 4.组织特异性抗原,同种异型抗原的提呈与识别,直接识别：受者T细胞直接识别供者APC表面MHC分子或抗原肽-MHC分子复合物。 间接识别：受者T细胞识别经过受者APC加工处理的来源于供者MHC分子的肽。,直接识别 间接识别,直接识别和间接识别比较,移植排斥反应的效应机制,细胞免疫应答效应机制 体液免疫应答效应机制 NK细胞效应机制 细胞因子的效应机制,细胞免疫应答效应机制,受者CD4+ Th1细胞通过直接识别或间接识别途径识别移植抗原并被激活，活化的T细胞释放多种炎性细胞因子如IFN-、IL-2等，引起迟发型超敏反应性炎症，还可活化CD8+ CTL，产生细胞毒效应。,体液免疫应答效应机制,抗同种异型抗原的抗体与相应抗原形成复合物，激活补体，损伤移植物。抗体也可通过调理作用和ADCC作用对移植物造成损伤。,NK细胞效应机制,在同种异体移植后，受者NK细胞的KIR不能识别移植物细胞表面的同种异型MHC分子，抑制信号传入受阻，NK细胞被激活，参与移植排斥反应。 活化T细胞分泌的多种细胞因子也可活化NK细胞，增强其杀伤活性，参与对移植物的排斥。,细胞因子的效应机制,IL-2活化同种异型反应性T细胞； IFN-诱导MHC分子表达，增强APC活性，激活NK细胞和巨噬细胞，参与并增强排斥反应； TNF-是导致移植物损害的重要介质； 某些趋化性因子介导特定效应性T细胞聚集于移植物，并参与排斥反应发生。,同种异型移植排斥的类型,宿主抗移植物反应 移植物抗宿主反应: 1.超急性排斥反应 2.急性排斥反应 3.慢性排斥反应,超急性排斥反应,概念：移植器官与受者血管接通后数分钟至数小时内发生的排斥反应。 机制：体液免疫介导，由于受者体内预存有针对供者同种异型抗原的抗体所致。,急性排斥反应,概念：发生在移植后数天至2周左右的排斥反应。 机制： 1.CD4+ Th1细胞介导的迟发型超敏反应和CD8+ CTL直接杀伤表达同种异型抗原的移植物细胞，引起间质细胞损害。 2.机体产生的抗血管内皮细胞表面同种异型抗原的抗体与相应抗原形成免疫复合物，激活补体而损害移植物血管。 3.激活的巨噬细胞和NK细胞参与移植物组织损伤。,慢性排斥反应,概念：发生于移植后数周、数月、 甚至数年的排斥反应。 机制： 1.免疫学因素 2.非免疫学因素,免疫学机制,1.特异性抗体或效应细胞对微血管内皮细胞的细胞毒作用，导致血管损伤； 2.迟发型超敏反应诱使巨噬细胞分泌平滑肌细胞生长因子，导致动脉血管内平滑肌细胞，血管壁增厚，间质纤维化。,非免疫学机制,1.移植术后早期出现缺血-再灌注损伤； 2.移植器官去神经支配和血管损伤等； 3.免疫抑制剂的毒副作用； 4.受者并发高血压、高脂血症、糖尿病和慢性 巨细胞病毒感染等也可导致慢性排斥反应。,移植物抗宿主反应,概念：移植物中的淋巴细胞识别宿主组织同种异型抗原而发生的一种排斥反应。 前提条件: 1.受者与供者HLA型别不相配合； 2.移植物中含有足够数量的免疫细胞，尤其是成熟的T细胞； 3.受者处于免疫无能或免疫功能极度低下的状态,GVHR机制,T细胞是介导GVHR的主要效应细胞。骨髓移植物中成熟CD4+T细胞识别宿主的同种异型抗原，并增殖分化为效应T细胞。这些激活的效应细胞随血流游走至受者全身，对宿主组织或器官发动免疫攻击。,供受者的配合选择,一般情况 ABO血型相容 HLA相容性,HLA分型试验,血清学分型法 细胞学分型法 基因分型法,血清学分型法,原理：CDC 应用：SD抗原（HLA-A、B、C、DR、DQ）。,技术要点,（1）分离待检的淋巴细胞，经洗涤、计数后，配成一定浓度。检测HLA-类抗原时，需分离B淋巴细胞。 （2）取分型板，加入标准抗血清和待检淋巴细胞，充分混匀，温育。 （3）加入补体，温育。 （4）加台盼蓝染色死细胞。 （5）用倒置显微镜观察计数死细胞的百分数。,CDC试验结果判定标准,细胞学分型法,原理：淋巴细胞增殖试验 应用：LD抗原（HLA-D、DP） 类型： 1.双向混合淋巴细胞培养法 2.单向混合淋巴细胞培养法,双向MLC方法原理,双向MLC中的两种淋巴细胞既是刺激细胞又是反应细胞,彼此能发生相互作用。若彼此淋巴细胞均无形态学改变或细胞分裂增殖，说明两个个体间HLA型别相同。若彼此淋巴细胞均发生形态学改变或细胞分裂增殖，说明两个个体间HLA型别不同。,双向MLC方法技术要点,1.分离待检淋巴细胞，洗涤、计数，配成一定浓度。 2.反应管加双方淋巴细胞，对照管分别加单方淋巴细胞。 3.将细胞置CO2培养箱37培养56天。 4.取沉淀物涂片、染色，高倍镜下计算转化率，或在培养终止前1620h加3H-TdR，培养后将细胞收集于滤膜，液闪仪测定cpm，计算SI。,单向MLC方法原理,单向MLC方法中的两种淋巴细胞有刺激细胞和反应细胞之分。首先将其中一种淋巴细胞用丝裂霉素处理或X线照射，使其丧失免疫反应能力，但HLA抗原不发生改变，因此被处理的细胞只作为刺激细胞，刺激细胞只能单向作用于反应细胞，它刺激另一种未处理的淋巴细胞，使其发生淋巴细胞转化和增殖。,单向MLC方法类型,纯合子分型细胞试验：阴性分型法 预致敏淋巴细胞分型试验：阳性分型法,HTC试验原理,HTC是只表达一种LD抗原的细胞，即同源染色体上编码LD抗原的MHC单倍型基因相同。这种细胞经丝裂霉素C处理或X线照射后，作为刺激细胞。 试验时将已知型别的HTC与待检的淋巴细胞混合，进行单向MLC。若待检细胞不发生增殖反应（SI2），说明待检细胞与HTC的HLA型别相同。因根据阴性反应作为判定标准，故HTC试验又称为阴性分型法；,PLT试验原理,预致敏淋巴细胞是一种仅对一种单倍型具有识别增殖能力，而处于静止状态的淋巴细胞。这种细胞遇到相应抗原刺激后，可迅速发生淋巴细胞转化和增殖。PLT试验是将此种细胞作为已知的分型细胞。正式试验时，将待检淋巴细胞处理作为刺激细胞，分别与一系列的预致敏淋巴细胞（反应细胞）进行单向MLC。如果待检细胞与预致敏淋巴细胞预先识别的抗原相同，预致敏淋巴细胞会迅速增殖。因预致敏淋巴细胞分型试验是用阳性反应作为判定标准，故PLT试验又称为阳性分型法。,单向MLC方法的技术要点,单向MLC方法的技术要点与双向MLC方法类似，不同点有：需提前筛选纯合子分型细胞或制备预致敏淋巴细胞； HTC试验中待检细胞不需处理，作为反应细胞，而PLT试验中待检细胞需进行处理，作为刺激细胞； 形态学方法以转化细胞百分率判断淋巴细胞反应程度，一般认为转化率小于5%为阴性； 3H-TdR掺入试验以刺激指数（SI）判断淋巴细胞反应程度。,基因分型法,RFLP分析法 PCR-SSCP探针分型法 PCR-SSP分型法 PCR-SSCP PCR指纹图谱技术,限制性片段长度多态性分析法（RFLP）,RFLP是最早建立的研究HLA多态性的基因分析技术。根据不同个体间的HLA相应碱基序列在不同部位存在多个不同酶切位点，通过一组限制性内切酶消化、识别、切割这些位点，产生数量和长度不一的DNA酶解片段，经电泳分离，与相应的cDNA探针进行杂交，即可分析限制性片段长度多态性，借以确定HLA的型别，这种HLA分型法称为DNA-RFLP。若对DNA片段进行体外扩增，然后再进行RFLP分析，则可大大提高RFLP的敏感度和特异性，这种引入DNA体外扩增技术的限制性片段长度多态性分析则称为PCR-RFLP分型法。,PCR-SSOP,PCR-SSOP分型法是将待检细胞HLA基因片段经PCR扩增后转移至NC膜或尼龙膜上，然后与放射性核素（32P）、生物素或地高辛等标记的SSCP探针进行杂交，若待检DNA与已知核苷酸序列的探针互补，则两者结合，即可分析出待检DNA序列，据此确定HLA的基因型别。,PCR-SSP分型法,PCR-SSP是根据HLA碱基序列的多态性和已知的DNA序列设计出一套针对每一等位基因的特异性引物，SSP 只能和相应等位基因特异片段的碱基组列互补性结合。通过PCR技术将待检DNA扩增，产生相对应的特异性扩增产物，通过电泳分析确定HLA型别。,PCR-SSCP,单链DNA具有在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，可形成一定的空间结构和构像的特点。即使长度相同的单链DNA其碱基顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构像不同，电泳时泳动速度和迁移率也不同。PCR-SSCP是指目的DNA经PCR扩增、变性后进行SSCP分析，靶DNA中碱基序列的改变会出现泳动移位。因此，若供、受者的SSCP带型一致，则其HLA基因相匹配；若电泳带型不一致，则不匹配。,PCR指纹图谱技术,PCR反应过程中，在特异性DNA最后一个循环的退火期，单链DNA互相结合形成同一个体完全互补的同质双链，但某些单链DNA还可能与不同个体的单链DNA形成不完全互补的异质双链。由于不同个体的DNA具有不同分子构象，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈现特异的区带图谱，称为PCR指纹图谱。HLA基因分型时，将供、受体的DNA扩增产物混合，电泳后得出一指纹图，再与二者各自的PCR指纹图谱进行比较，根据指纹图的一致性作为选择供者的依据。,微量细胞毒试验,用供者的淋巴细胞做靶细胞，与受者的血清进行CDC，可检出受者血清中是否含有针对供者淋巴细胞的抗体，以防止超急性排斥反应的发生。,流式细胞仪检测,将供者淋巴细胞与受者血清共育后，用荧光标记的抗人Ig对结合有抗体的细胞染色，在流式细胞仪上进行荧光标记测定。该法比微量细胞毒试验的灵敏度高100倍。,混合淋巴细胞培养,将受者与供者的淋巴细胞做双向混合培养，或者与灭活供者的淋巴细胞做单向混合培养，细胞发生反应的程度与供、受者相容的程度呈负相关。,细胞介导的淋巴细胞毒试验,将受者淋巴细胞与灭活的供者淋巴细胞做常规单向混合淋巴细胞培养，获得致敏的受者淋巴细胞后，再与51Cr标记的、PHA刺激的供者淋巴细胞做CML试验，51Cr释放的程度与供、受者相容程度呈负相关。,交叉配合试验,微量细胞毒试验 流式细胞仪检测 混合淋巴细胞培养 细胞介导的淋巴细胞毒试验,移植排斥的免疫学防治,一、排斥反应的监测 二、排斥反应的防治,排斥反应的监测,细胞免疫学监测 细胞因子监测 抗HLA抗体检测 蛋白、酶类、补体检测,排斥反应的防治措施,移植抗原检测与配型 免疫抑制剂的使用 移植耐受的诱导,移植抗原的检测与配型,1、HLA的检测 ：血清学检测 细胞学检测 基因检测 2、预存抗体检测 3、交叉配型,免疫抑制,1.药物：CsA、Fk506 2. 单克隆抗体：抗CD3单抗 3. 血液净化 ：去除已存在的抗体,Immunosuppressive agents,Immunosuppressive agents,TCR,calcineurin,2+,NF-ATc,NF-ATn,NF-AT,Ca 2+,CsA,CyP,FK506,FKBP,FKBP,蛋白激酶,Rapamycin,IL-2,IL-2R,输血史对肾移植存活率的影响,移植前输血次数 一年存活率 0 次 44% 1-4次 58% 5-9次 60% 10次 68%,Blood transfusion and graft survival,干细胞移植,干细胞：是一类具有自我更新、高度增殖 和多向分化潜能的早期未分化细胞。,干细胞的分类,胚胎干细胞 成体干细胞,干细胞的临床应用,作为细胞治疗与组织器官替代治疗的种子细胞 研究胚胎发育的调控机制 作为疾病基因治疗的理想载体 用于药物筛选和新药开发,异种移植（xenograft）：指不同种属间的移植，是用手术的方法将某一种属个体的器官或组织移植到另一种属个体的某一部位。,异种移植的特殊免疫学问题,异种移植的特性,1、人体内存在针对动物细胞表面多糖分子的天然 IgM 抗体，导致超急排斥反应。 2. 迟发性异种移植排斥反应可能由NK细胞和巨噬 细胞介导，涉及大量参与炎症反应的细胞和因子， 及相关基因的激活和表达。 3急性及慢性异种移植排斥反应主要由T细胞介导。,异种移植的类型,协调性 非协调性,骨髓移植的特殊免疫学问题,移植物抗宿主病（GVHD）：是指供者的免疫活性细胞 与免疫功能低下的受者抗原起反应的一种疾病。,GVHD发生条件,宿主与移植物之间的组织相容性不同 移植物中含有足量免疫活性细胞 宿主处于免疫无能或免疫功能严重缺损,Graft versus host (GVH) disease,GVH反应的临床表现类型,组织器官 急性反应 慢性反应 皮肤 红皮病 硬皮病 毛囊炎 丘疹性皮炎 脱屑 脱发 肝脏 肝功能异常 胆汁性肝硬化 消化道 腹泻、肠梗阻 黏膜结构破坏 肠隐窝炎 淋巴结 迟发性细胞增生 T、B细胞耗竭,GVH disease in humans,本章小结,1、移植与移植免疫的概念 2、移植抗原的基本