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基因操作 Gene manipulation,An overview of DNA cloning,Some conception need to know Some useful technology for gene manipulation Enzymes for DNA cloning Vectors,一、Conception,DNA克隆：将目的基因连接到载体上，形成通常可以在另一宿主细胞内进行复制的重组DNA。 带有重组DNA的宿主细胞的增殖构成了一群具有遗传一致性的个体，或称为克隆。这一系列操作过程就称为DNA克隆。,科学家从一具4.3万年前的猛犸尸体血液中提取出高品质DNA。,猛犸象曾经是世界上最大的象。它身高体壮，有粗壮的腿，脚生四趾，头特别大，在其嘴部长出一对弯曲的大门牙。一头成熟的猛犸，身长达5米，体高约3米，与亚洲象相近，门齿长1.5米左右，虽然身高不高，但身体肥硕，因而体重可达68吨。它身上披着黑色的细密长毛，皮很厚，具有极厚的脂肪层，厚度可达9厘米。,亚克隆：将已克隆的DNA片段从一个载体转移到另一个载体的过程称为亚克隆。 亚克隆可用来对较大的克隆片段上较短区断进行仔细研究； 将基因转移到能在特定物种中表达的另一载体上；,2、Subcloning(亚克隆),含有目标克隆序列的质粒DNA的提取。 用限制性内切核酸酶将质粒酶切成不连续的片段 经琼脂糖凝胶电泳分离片段 纯化目标片段 将目标片段连接在新质粒载体上，形成新重 组分子 将连接好的质粒转化某一大肠杆菌菌株 转化细菌的筛选 重组质粒的分析,最常见的亚克隆程序:,3、DNA文库,DNA文库：一套DNA克隆，每个克隆都是插入了不同片段的载体在宿主中扩增后的产物。 克隆：一个遗传上独立的个体或一群相同的个体。,RNA反转录合成cDNA后，插入克隆载体构建成； 用cDNA文库克隆目的基因是有效的，但克隆的仅是编码区，而不包含编码区以外的基因组序列。,Genomic libraries（基因组文库）：整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。,用基因组DNA的随机片段制备成的； 用基因组文库克隆某一基因，效率极低。因为大量DNA是非编码序列。,cDNA libraries（cDNA文库）：细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的总和。,Host organism/cell: where the plasmids get multiplied and propagated faithfully, which is crucial for DNA cloning. Hosts for DNA cloning vector Prokaryotic host : E. coli ( most cases) Eukaryotic host : Yeast (Saccharomyces cerevisiae), large fragments of human genome,4、Host cell 宿主细胞,5、 Vector（载体）,在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。,细菌表达载体 酵母表达载体 哺乳动物表达载体,Types of vector(载体的类型),(1) Cloning vector 克隆载体：可以插入、保存外源DNA，并在DNA水平上进行操作,大肠杆菌克隆载体：质粒、噬菌体( M13)、 黏粒即质粒噬菌体的杂合体 细菌人工染色体（BAC） 酵母克隆载体：酵母人工染色体（YAC）,(2) Expression vector 表达载体：可使外源基因插入和表达。具有RNA转录所需的启动子和终止子。,表达载体的结构,E.Coli 表达载体元件 启动基因P 核糖体结合位点 ORF 终止子,(3) Integration vectors整合载体：允许外源DNA插入，并在转化后整合到宿主细胞基因组中。,整合是通过质粒与受体细胞中同源序列间发生的同源重组介导的。 细菌整合载体（根癌农杆菌T质粒可被用来将DNA整合到植物基因组中） 酵母整合载体 哺乳动物整合载体：病毒为基础（以病毒的天然感染为基础，可用于基因治疗、转基因动物等。）,是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。,生物学特征： （1）分子量小：2200kb，多个拷贝。 （2）复制起点：自主复制； （3）编码基因少：其中有（抗生素抗性基因）,Plasmid(质粒),（4）质粒的空间构型：, 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA,呈超螺旋（SC）（super coil）, 开环DNA（ open circular， ocDNA）,一条链上有一至数个缺口。, 线形DNA （ linear ，lDNA）,（5）质粒空间构型与电泳速率,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：,scDNA最快、 L DNA次之、ocDNA最慢。,SC,OC,L,L,SC,质粒载体的一般特征：,独立于宿主基因组的自主复制DNA； 易于从宿主细胞中分离出来； 至少包含一个选择标记，即一个能使含有该载体的宿主可以从不含该载体的细胞中筛选出来绝 含有多克隆位点MCS ； 分子量小，拷贝数多。,质粒的选择标记及其工作原理,ampr基因编码内酰胺酶，降解青霉素类抗生素如氨苄青霉素。 tetA基因编码一种跨膜泵蛋白，能从细胞内将四环素类抗生素排出。 Kanr 编码氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。,二、Technology,聚合酶链式反应（PCR技术） Plasmid preparation（质粒的提取） Restriction digests（限制性酶切） Agarose gel electrophoresis （琼脂糖凝胶电泳） DNA ligation（连接） Transformation（转化） Selection（筛选）,1.PCR技术就是在体外的小试管中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因DNA的技术。 该技术高效、快捷、特异性好。,小试管中反应需加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列即微量的总DNA； （2）与欲分离的目的基因两条链的各自5端序列相互补的DNA引物（约20个左右碱基的短DNA单链）； （3）Taq DNA聚合酶； （4）4种核苷酸 4dNTP（即dATP, dTTP, dGTP和dCTP）,1985年，Mullis K.发明了一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术;。 1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化； 1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖； 1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。,The Nobel Prize in Chemistry 1993,PCR技术的诞生与发展,按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3端，Taq DNA聚合酶使杂交双链不断延伸，直至形成新的DNA双链,原理：在试管中，利用DNA聚合酶、一对引物和四种dNTP，对模板DNA反复多次地进行复制，从而得到大量扩增产物的反应过程。,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为反应的模板,引物与模板互补结合，形成杂交链,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,N次循环后，得到2n条DNA,PCR的基本反应步骤,1、制备模板DNA 2、PCR循环反应 3、PCR产物的检测 （1）电泳分离PCR产物 （2）染色及检测,样本来源：各种组织细胞、培养细胞、寄生虫、微生物、临床标本、犯罪现场标本、考古标本。,体内复制与PCR技术的区别,PCR技术的发明,PCR的发明是DNA操作技术的革命 美国Kary Mullis教授 开汽车时的联想,逶迤崎岖的山路DNA双螺旋 行驶的汽车一小段DNA引物 1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖,2. Plasmid minipreparation from E. coli,小量制备质粒DNA： 含质粒大肠杆菌细胞的培养； 离心菌液收集菌体沉淀； 碱裂解：悬浮细胞沉淀，碱裂解，中和； 酚抽提去除蛋白杂质； 乙醇沉淀核酸。,如何提取自己的DNA?,在悬浮缓冲液中重悬细胞； 溶菌酶降解细菌细胞壁； 裂解缓冲液中裂解细胞，裂解缓冲液含有SDS和NaOH, SDS的作用是破碎细胞膜及引起蛋白质变性。 NaOH的作用是使DNA变性。 中和：中和缓冲液含KOAc (pH 5)，其作用是沉淀已变性的蛋白质和染色体DNA及大部分去污剂。超螺旋质粒DNA易复性；染色体DNA不能复性。,碱裂解,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。,（1）原理：, 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH8）下有活性。 葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。 EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。 NaOH-SDS NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。,（2） 所用的试剂作用, NaAc-HAc缓冲液 冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到5。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。 酚-氯仿 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。 乙醇：用于沉淀DNA。 DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。,centrifugation,pellet,cell,CsCL gradient purification,3、 Restriction digests,Identified in the 1960s and early 1970s Bacterial enzymes which cut DNA into defined and reproducible fragments Key discovery which allowed the DNA cloning to become a reality,20世纪60年代和70年代初鉴定 来自细菌，可将DNA酶切成特定的、可再生的片段。 其发现及鉴定是实现DNA克隆的关键。,Restriction endonuclease,限制性内切核酸酶：存在于细菌细胞中的一种识别一小段对称的DNA序列，在识别位点处切割（水解）双链DNA骨架的酶。,识别序列：48 bp的回文序列； 特异性高： 酶切产物：3或5突出末端或平头末端;新形成的5-P, 3 OH。,4、Gel Electrophoresis,带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。 如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同：,电泳的基本原理,电泳迁移率主要取决于分子本身的大小和形状。 形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖 一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。 琼脂糖凝胶 琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。 琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。 浓度高 空隙小 琼脂糖凝胶的分辨力,Agrose: a polysaccharide derived from seaweed, which forms a solid gel when dissolved in aqueous solution (0.5%-3%),核酸在凝胶中向正极移动？,核酸具有很强的负电性。,检测DNA 分离、纯化目的DNA片段 分析重组质粒,应用,凝胶染色,染料 溴化乙锭 Ethidium bromide （EB） 原理 扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置 . 荧光强度与DNA含量及大小成正比。,在有5末端磷酸基团时，DNA连接酶可共价连接互补配对的黏性末端或平头末端。,Ligase：由ATP水解提供能量，将dsDNA切口处5磷酸与3羟基相结合,5、DNA ligation,6、Transformation,感受态细胞(component cell)：用Ca2+ 溶液处理后易于吸收外源DNA的大肠杆菌细胞。 用于制备感受态的大肠杆菌细胞是不能表达限制修饰系统的特定菌株。 转化：感受态细胞吸收外源DNA（质粒）的过程。,Transformantion efficiency: number of anti-biotic-resistant colonies formed （on a select plate）per microgram (mg) of input plasmid DNA. Ranges from 103/g to more than 108/g. 105/g is adequate for a simple cloning. Heat-shock: After the DNA is uptaken, the cells shall be put at 42oC for 1 min in order to induce the suppressed enzymes for cell defending ，which allow the cells to recover from the unusual condition of the transformation progress, and increase the efficiency.,转化效率：每毫升用于转化的质粒DNA在选择平板上所形成的具抗生素抗性的菌落数。 转化率的变动幅度从粗放转化程序103/g 精细转化程序108/g。 热激：42oC热激12分钟。诱导与DNA修复有关的酶及其它细胞成分的生成。有利于细胞从转化过程中的不正常状态下恢复过来，提高转化效率。,7、selection,Distinguish between the recreated vector and religated vector is very important.,鉴别环化载体分子与重组质粒是分子克隆中非常重要的步骤。,双抗生素抗性筛选 蓝白斑筛选,Twin antibiotic resistance,Blue-white screening,-半乳糖苷酶Xgal显色反应 -半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。,lacZ编码半乳糖苷酶，受lac启动子的调控。当E.coli 菌株表达Lac阻抑物时，则载体上的lacZ 基因由IPTG诱导表达，表达形成的酶可利用底物X-gal一种形成蓝色化合物。 重组质粒中lacZ 的插入失活将导致不能形成蓝色菌落。,IPTG：异丙基-D-硫代半乳糖苷. 是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录， X-gal ：5溴4氯3吲哚D半乳糖苷,Fusion protein,Lac融合蛋白：插入片段与lacZ基因具相同的可读框，且是连续的。其产生的融合蛋白是由来自lacZ的N端的几个氨基酸及其紧连着的由插入片段所编码的蛋白序列组成。 组氨酸标签融合蛋白：在表达蛋白ORF的N端加上一段组氨酸编码序列，以使重组蛋白可通过与Ni色谱柱的特异结合被纯化出来。,三、Enzyme for DNA cloning,1、Alkaline phophatse 碱性磷酸酶 removes the phosphate groups from the 5-ends of the vector DNA linearized by a single restriction enzyme to prevent the self-ligation of the vector DNA upon the followed ligation Single restriction enzyme directed cloning,去除线性载体分子5末端的磷酸基团，使载体在没有目的片段插入的情况下不能自连成环状，从而降低反应物中载体自身环化的比例。 单一酶切指导的DNA克隆,The use of alkaline phosphate to prevent religation of vector molecules 使用碱性磷酸酶防止载体分子自身环化,该切口将在转化后由细胞修复机制修补,2 限制性内切核酸酶： 3 DNA连接酶 4 TaqDNA聚合酶： 5 多核苷酸激酶：一个依赖ATP的反应，向双链或单链DNA 或RNA的5-OH添加磷酸。 6 末端转移酶：向线性单链或双链DNA或RNA的3-OH添加核苷酸。 7 外切核酸酶III：从线性dsDNA的3端依次切除核苷酸。 8 绿豆核酸酶：降解单链核酸，留下完整的双螺旋区段。 9 核酸酶S1：降解对应于互补链缺口对面的单链。 10 RNase A：只降解RNA，而不降解DNA 的核酸酶。 11 RNase H：降解RNA-DNA异源双链中的RNA链的核酸酶。,四、Screening library Searching the genes of interest in a DNA library,通过杂交筛选目标基因 放射性或荧光标记的DNA探针是与目的基因序列的某一区段互补或部分互补的一段DNA。 从目标基因的蛋白产物序列推测出的一段寡核苷酸 来自另一物种中的某一相关基因的一段DNA或寡核苷酸 通过目标基因的蛋白质产物来筛选目标基因 对其蛋白产物进行活性鉴定 用特异抗体对其进行western 杂交鉴定,DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针.,hybridization,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品,Southern blot,DNA的制备,限制性酶切,琼脂糖凝胶电泳,Southern blot 筛选结果,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,Northern blot,五、 Analysis and uses of cloned DNA,克隆DNA的鉴定过程包括测定重组DNA分子的各种特性，如大小、限制图谱、核苷酸序列、基因的位置及方向。 纯DNA样品的制备是克隆DNA鉴定的第一步。,Characterization（鉴定 ）of cloned DNA,应用限制酶切、琼脂糖凝胶电泳及分子量标准可确定克隆DNA片段的大小。,2、Restriction Mapping,The restriction map of the recombinant DNA can be built By digestion with restriction enzymes, alone and inconbinations, By partial digestion of end-labeled DNA using polynucleotide kinase or terminal transferase，and sizing of fragments produced the restriction map can indicating the clevage position and fragment size.,限制图谱的构建： 用一种或两种以上的限制酶对重组DNA分子进行酶解； 用限制酶对末端标记的DNA片段进行部分酶解,并测定所生成片段的大小； 限制图谱可标明重组DNA分子的酶切位点和片段大小。,Combinational enzyme digestion,Partial digestion,Labeling nucleic acid,5 end labeling :require polynucleotide kinase (多聚核苷酸激酶)to add a phosphate to nucleic acid with a free 5-OH,which can be created by dephosphoprylation using alkaline phosphatase (碱性磷酸酶). The external phosphate of ATP is the source of the label. 3end labeling :require the terminal transferase (末端转移酶)to add one or more nucleotides to the 3end of nucleic acid. Uniform labeling: require polymerases（聚合酶） to synthesize a complete labeled strand.,5-末端标记:可用多核苷酸激酶将具放射活性的磷酸加到具有游离5 OH的核酸上。游离的5 OH可由碱性磷酸酶去磷酸化产生。ATP的-磷酸是用来标记的标记源。 3-末端标记:可用末端转移酶向核酸的3端加上一个或多个核苷酸进行。 均匀标记：需用聚合酶完成一条完整的被标记链。,3、Nucleic acid sequencing,DNA sequencing Maxam and Gilbert chemical method Sangers enzymic method,Sangers enzymic method Dideoxynucleotides as chain terminators produces a ladder of molecules generated by polymerase extension of primer；then PAGE separates the molecular。 The sequencing primer is annealed to a ssDNA template molecule ； a DNA polymerase extends the primer using dNTP. The extension reaction is split into four and each quarter is terminated separatly with one of the four specific ddNTP； the four samples are analyzed by PAGE.,Sanger的酶法： 原理：双脱氧核苷酸作为链终止试剂，通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子。 测序引物