生物：3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1).ppt

3.1 酶的制备及活力测定,实验目的和要求 1.掌握盐析法制备活性蛋白质的原理及方法。 2.掌握过氧化物酶的活力测定方法。,辣根过氧化物酶的制备及活力测定,实验原理,过氧化物酶催化以下反应 2H 2 O 2 O 2 +2H 2 O 这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类 (hemeproteins)。过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。,实验原理,辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase，简称HRP，EC.)是植物中研究得最深入的一种过氧化物酶，早在20世纪30年代就有人着手从辣根中分离此酶，以后又制备出结晶。本实验是以辣根为原料，经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冰冻干燥，便可得到高纯度的辣根过氧化物酶。,实验原理,辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质 ,Mr在40 000左右，等电点7.2。溶于水，溶解度为5%(W/V)，溶液呈棕红色，透明。HRP可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下，HRP几周内稳定，加热到63，在15min内稳定。氧化还原电势很低，pH6.08时，E 0 =-0.2070V，pH为7.71时，E 0 =-0.2787V。 ,辣根过氧化物酶的活力测定方法,1.RZ值：提纯工作的后几步，以及纯酶溶液可用RZ值表明酶的纯度。RZ= A403nm/A275nm，403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收，275nm的吸收是蛋白质的吸收，结晶的HRP的RZ值为3.04。测定时的酶浓度为1mg蛋白/mL。 2.愈创木酚法：测k4。以愈创木酚(邻甲氧基酚，guaiacol)为氢给体，其反应产物四邻甲氧基连酚.有色产物四邻甲氧基连酚生成的速度(dx/dt)与底物过氧化氢及氢给体愈创木酚的浓度有关。 本实验是采用测定 k4的方法来判断酶的纯度。,实验步骤,一、 HRP的制备 1.水提取：称取5kg用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP)，用菜刀切成小碎块，在绞肉机中绞碎12次。碎渣浆用1倍体积的水低温下搅拌提取过夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干机(或离心机)甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取1次，合并2次滤液，测得总体积。,实验步骤,2.硫酸铵分级分离：在不断搅拌下，每1 000mL滤液中慢慢加入226g硫酸铵粉末(相当于0. 40饱和度，0)，大约在12h内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面混浊液以3 000r/min离心15min，弃沉淀，合并上清液。再按每1 000mL上清液加258g硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13 000r/min离心20min，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100150mL蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止)，分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析12天，直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换23次，用0.1mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液合并，在冰冻离心机中以4 000r/min离心15min，弃去沉淀，量上清液的体积。,实验步骤,3.丙酮分级分离：将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至15的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4 000r/min离心15min，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)15丙酮，(操作同上)，静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮。可得RZ值近于1的酶溶液。,实验步骤,4.精制：将上步酶液适当稀释，滴加1mol/L硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10 -3 mol/L，5 000r/min离心10min，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，用水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冰冻干燥(约得20mg)，产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的RZ值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。,实验步骤,二、 HRP的活力测定 1.活力测定：测定k4值的方法操作如下：取2个比色池(带盖，光程1cm)，按表加入反应物。,酶液：将1mg蛋白/mL的酶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍后使用。,实验步骤,加好反应物，摇匀，在 470nm读出A470nm值，为t=0时的读数。立即加0.01mL40mmol/L过氧化氢溶液于2个比色池中，即刻摇匀并记时，每隔30s读数1次，约5min，并记下实验时的室温。 将所测样品的 A470nm值减去相应时间对照的A470nm值，然后以A470nm值为纵坐标，时间为横坐标作图，得一直线，计算出平均每分钟光吸收的增加，即求出x/t，按公式(8)求出k4值。或不求k4值，而把在上述条件下，每分钟A470nm增加0.001所需酶量定为1个HRP活力单位。 2.蛋白质含量的测定：将酶液适当稀释后，用Bradford法比色测定蛋白质含量，,实验结果,1.计算产品的RZ值及k4值。 2.计算产品的比活力。,思考题,1.盐析法制备辣根过氧化物酶的原理是什么? 2.愈创木酚法测定辣根过氧化物酶的原理是什么? 3.测定辣根过氧化物酶的活力时，要求什么样的pH和 温度?是否需要先测定酶液的蛋白质含量? ,凤凰平台 / 凤凰平台 twd36twu 一定不会少给的！”耿正说：“倘若如此，我们一定认真履约！”老板听了很高兴，又说：“还有，在我们酒店献艺期间，你们每日上午来酒店的时间不可以晚于午时初，午饭和晚饭酒店里免费提供，晚上离开酒店的时间通常不会晚于戌时中；如果晚于这个时间，酒店将现送数量不等的小费。”耿正说：“谢谢，我们一定会在每日的午时初之前来酒店上班！”老板再次依次看过眼前这举止不俗的兄妹三人，非常有礼貌地问：“请问各位贵姓，怎么称呼啊！”耿正说：“免贵姓耿，我叫耿正，妹妹叫耿英，弟弟叫耿直。”老板连声说：“好名字，好名字啊！”耿英说：“请老板放心，我们一定会在贵酒店用心献艺的！”老板更高兴了，挥手招呼周围的伙计们：“你们都过来和这兄妹仨认识一下吧，以后可要多照应他们啊！”事实上，老板对原先经常来该酒店献艺的几个艺人都不是十分满意，因此并不曾与哪一个艺人签署过任何形式的聘用契约。他们只是随意来随意走，哪一个先到了就在这里做一次。后到的没有位置了，就转到其他的酒店另行招揽生意去了。至于酬金，虽然给得很够意思，但也都只是以小费的形式当日交给就是了。此外，酒店里也从来不为他们提供任何饭菜，只不过吩咐伙计们给以茶水照顾和礼貌接待而已。今日提出来要与耿正兄妹三人签署聘用契约，不过是该老板的突发奇想而已。这个独具慧眼的精明人看出来，这兄妹三人肯定能给自己的酒店带来丰厚的回报，因此不但想要留住他们，而且还要约束他们没有机会再去其他的酒店展现才华。十天的试用期圆满结束了，耿正兄妹三人组成的拉奏演艺说唱班取得了空前的好效果，“盛元酒店”的上座率日日增加！来这里吃饭的客人，一帮接着一帮在酒店门口排长队等候。老板对耿正兄妹三人刮目相看，提出来愿意以每月三十两纹银的高薪，与他们签署长期聘用契约，并慎重地征求耿正的意见，看他们兄妹三人到底愿意与酒店签署一份多长时间的契约。耿正和耿英商议后认为，在酒店献艺期间除了每日需要自掏腰包吃简单的早餐之外，再没有其他消费了。因此，只要做满了三个月以后，积攒的银子就足够做一个小本的买卖了。虽然在这个大酒店献艺确实是无本大利，但他们不想长期做这个。于是，耿正郑重地对老板说：“多谢老板器重，我们想先签署一份三个