课件：载脂蛋白.ppt

载脂蛋白表型及基因型的检测,罗建新,蛋白质多态性（protein polymorphism）指一种蛋白质存在多种不同的变型，这些变型的产生是由于同一基因位点内的突变，产生复等位基因，导致合成不同类型的蛋白质，人类蛋白质的多态性往往和人种及其地理分布有关。在目前已发现的近20种载脂蛋白中，ApoA、A、A、C、C、E及Apo（a）等存在明显的多态性，这些载脂蛋白可以以分子大小/电荷互不相同的多种形式存在。彼此互称异构体（isoform）,载脂蛋白表型（phenotype） 指载脂蛋白的基因型与发育的环境相互作用而产生的个体的可观察到的性状 纯合子（homozygous） 杂合子（heterozygous） 分别由一种或几种异构体构成,检测方法 等电聚焦（IEF） 十二烷基硫酸钠-聚内烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 双向电泳电泳技术 免疫印迹技术 分子生物学技术,1 载脂蛋白（a）表型,Apo（a）是一结构复杂的糖蛋白，Lp（a）特征性的蛋白成分，占Lp（a）的20%。Apo（a）含糖量30%35%，Apo（a）分子量在250KD800KD，是目前所发现的最具多态性的人类蛋白质。Apo（a）多态性产生的原因在于其肽链长度不等而且糖基化程度不同；由于Apo（a）基因中Kringle-4结构重复的数量差异所致，在不同个体中重复1040次不 等,Apo（a）与血纤维蛋白溶酶原基因结构(A)与cDNA结构(B)的比较,运用RFLP等方法证明Apo（a）是以孟德尔共显性方式进行遗传的。随着检测方法的改进，报道控制Apo（a）多态性的等位基因数目越来越多。已发现Apo（a）等位基因位点中至少有34个等位基因与其多态性有关。高Lp（a）是心脑血管疾病（CCVD）的独立危险因子，与Apo（a）作用密切相关 检测Apo（a）多态性表型在不同人群中的分布对CCVD的预测及防治具有重要意义,一、Apo（a）表型检测的方法学,Apo（a）表型检测方法主要有两大类 1.SDS-PAGE分离载脂蛋白，然后结合免疫印迹技术检测不同Apo（a）表型 2.SDS-agarose（琼脂糖）,Utermann等 应用-SDS垂直板PAGE结合免疫印技术，检出6种Apo（a）异构体，共14种临床表型。此法仅有50%受试者可检出Apo（a）异构体区带 Kraft等 将上法垂直板电泳槽改为水平板式，避免了带型之间污染问题且使方法更适合于大批量标本检测,Huang等 将生物素-亲和素放大技术引入Utermann法免疫印迹检测系统，使检测灵敏感大大提高，88%的受试者均可检出Apo（a）异构体区带 Gaubatz等 应用含0.75%agarose的SDS-PAGE结合免疫印迹技术，发现美国人中共有在11种Apo（a）异构体，共32种表型。仅有1%受试者未检出任何一种Apo（a）异构体,Kamboh等报道应用SDS-agarose电泳结合免疫印迹技术检测Apo（a）表型的方法，检出23种不同Apo（a）异构体，共115种表型 Geroldi等 将上述加以改良，以毛细管印迹聚偏二氟乙烯（PVDF）膜代替传统的（NC）膜，使检测方法更为简便、适合于大规模人群调查,Marcovina等 应用SDS-1.5%agarose凝胶电泳结合免疫印迹技术，首次报道人类至少有35种Apo（a）异构体，此法是在Kamboh等法基础上发展起来的一种高分辨的分析方法。,上述两类方法有许多共同点，即首先采用电泳技术将Apo（a）与其他载脂蛋白分离，然后Western blotting，灵敏而特异地显示Apo（a）多态区带的位置，最后根据其与ApoB100电泳速率比较或根据其分子量大小而确定Apo（a）表型。,二、SDS-PAGE结合免疫印迹法检测Apo（a）表型,检测Apo（a）表型的方法中，以Utermann法或其改良法最为常用。 先用SDS-PAGE分离Apo（a）异构体，然后用特异的多克隆或单克隆抗体作免疫印迹显示,1仪器与试剂 电泳仪，夹心式垂直板电泳槽及凝胶转移电泳槽，NC膜（孔径0.45m,转移电泳用）；高分子量系列蛋白标准（MW67000669000，Pharmacia产品）；ApoB100纯品,主要试剂有： 30%丙烯酰胺贮存液； 电泳缓冲液为pH8.3，内含0.1%SDS的0.025mol/l Tris-0.192mol/L甘氨酸溶液； 转移电泳缓冲液为pH8.3，内含20%甲醇的0.02mol/l Tris0.15mol/L甘氨酸溶液； 样品处理缓冲液：50g/l SDS水溶液4ml，-疏基乙醇800l，750ml/L甘油溶液800l ，10g/L溴酚蓝溶液200l混合液。,洗涤缓冲液为pH7.4内含9g/L的0.01mol/l Tris-HCl溶液； 封闭液为内含50g/L去脂奶粉（或含10g/L小牛血清白蛋白）的洗涤缓冲液；第一抗体为羊抗人Apo（a）血清 第二抗体作为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG； 底物溶液为脂溶性4-氯-1-萘酚底物液或水溶性二氨基联苯胺（DAB）底物,2实验方法 凝胶板制备 安装好垂直板电泳槽，参照Utermann等方法配制6.6%聚丙烯酰胺分离胶和3.6%浓缩胶制备胶板 电泳：血清样品18l与100l新鲜配制样品处理缓冲液混匀，置100水浴10min，冷却，取混合物20l电泳，ApoB100与高分子量蛋白标准处理，（通常120V电泳6h）,电转移 取此凝胶，切下分子量蛋白带放入SDS洗脱液中过夜，以固定凝胶大小并洗脱掉未与蛋白结合的SDS，0.01%考马斯亮蓝G-250染色室温1h，7%乙酸脱去背景颜色。 剩余凝胶铺在已浸过转移电泳缓冲液的NC膜上，搭建滤纸/凝胶/NC膜/滤纸一同放在电泳转移支架上，按层次相夹置于装满转移电泳缓冲液的电泳槽中。120V电泳6h（30以下）或430V转移过夜,免疫印迹分析 取出转移后的NC膜在洗涤液中洗3次后，置封闭液中室温封闭3h（或371h 在洗涤液中洗3次 加入1：100稀释的第一抗体并充分混匀，37温浴6h（或过夜） 用洗涤液洗5次（10min5）甩干 加入1：500稀释的第二抗体，混匀，37作用2h 洗涤同上 加入新配制的底物溶液于室温下摇动直至出现紫色（或紫褐色）并看到背景（15min）时用蒸馏水冲洗终止反应，空气干燥封于塑料袋中避光保存,Apo（a）表型判定 量出Apo（a）蛋白带中心距分离胶界面的距离，对照ApoB100和高分子量标准的泳动距离，确定Apo（a）带型及各表型的分子量范围。在SDS-PAGE中蛋白质的迁移速度主要取决于它的分子量大小而与其形态及所带电荷多少无关。用巯基乙醇打开Apo（a）与ApoB100之间的二硫键，Apo（a）的分子量即可通过与蛋白标准比较相对迁移率的办法而求得。并按其与ApoB100在凝胶中迁移速率的快慢而将其分为F（较ApoB100快），B（与ApoB100相似），S1、S2、S3、S4（依次较ApoB100慢）6种多态异构体并组合成各种Apo（a）表型，见图1所示。,图1 几种Apo（a）表型的免疫印迹分析示意图谱,3实验条件的优化 在此方法中，PAG起载体和分子筛的双重作用，不同浓度的凝胶适于不同分子量的蛋白质分离，国外用于Apo（a）表型测定的凝胶浓度差异较大（3.25%7.5%）, 一般认为分离胶选用6.6%较为适宜，其操作方便，分离效果也较好。分离和转移电泳都会因产热而影响实验效果。 国产电泳槽冷却装置效果较差,进口较好 选用诸如Bio-Rad产垂直板电泳槽及转印槽（Model 220 dual vertical-slab gel electrophoresis cell,TransblotTm cell；Bio-Rad Labs；Richmond,CA） 低电压、长时间、4环境中电泳的措施，可取得较好效果,免疫印迹反应中也可选用鼠抗人Apo（a）单克隆抗体作为一抗，用酶标兔抗鼠IgG作为二抗。 应用酶标抗体反应作为二抗时，底物以脂溶性4-氯-1-萘酚或联茴香胺较水溶性DAB溶液为好 金标、I125标抗体作为二抗，通过银染或放射自显影技术显示Apo（a）蛋白区带 将生物素标记的抗体作为二抗，通过生物素-亲和素系统放大信号，可大大提高检测敏感性,采用标准蛋白分子量定型法确定Apo（a）异构体。Apo（a）6种异构体分子量分别为F：400000，S1520000，S2580000，S3640000，S4700000，国外现已有Apo（a）表型测定标准物（含异构体F、S1S3-ImmunoAG、Austria），可用于Apo（a）异构体判定及质控。分子量标准除采用凝胶染色外，也可将分子量标准蛋白转移电泳至NC膜上，切下非特异性转移带（即标准部分）用低浓度CBBG-250或氨基黑10B染色法染色，并记下标准的位置。,三、Apo（a）表型检测的临床意义,临床上对Apo（a）多态性研究是从80年代开始的。 近年来，国内外学者通过分析不同Apo（a）多态在不同种族正常人、冠心病、高脂血症、脑血管病、糖尿病等人群中的分布，以及对高脂血症家系调查，得出下述一些结论：,1Apo（a）表型对于每个研究个体来说是终生固定的，不因身体状况而改变。Apo（a）表型受遗传基因控制，其遗传遵循孟德尔遗传规则，即个体中出现的Apo（a）多态总存在其双亲中。 2Apo（a）表型以一种异构体构成的单一表型为多（以S4较多见）；最多由两种Apo（a）异构体构成同一血清表型，此类双表型以S2/S3为多见，正常人群中较常见的Apo（a）表型为S4、S3、S2、B、S1少见；F罕见。亚洲人群S4较欧美人群频率明显增高，说明Apo（a）多态性可能存在一定种族差异性。,3Apo（a）异构体分子量与其血清Lp（a）浓度呈负相关。即高分子量Apo（a）表型伴低Lp（a）浓度，低分子量Apo（a）表型伴高Lp（a）浓度，见图2所示,图2 Apo（a）异构体分子量，人群中出现频率 和血清Lp（a）水平,4冠心病(CHD)患者与正常人Apo（a）表型频率分布具有显著性差异，双表型频率明显高于正常人,伴高Lp(a)水平的Apo（a）表型B、S1和S2频率也显著高于正常人。同种表型者，冠心病组血清Lp(a)水平多高于正常对照组。国内秦树存等研究认为，Apo（a）低分子量表型（B、S1、S2）与高水平的Lp（a）密切相关，为我国汉族人群中CHD的独立的遗传危险因素。庄一义等研究发现Apo（a）研究表型在心脑血管疾病（CCVD）患者与正常对照组之间的分布存在明显差异，伴高水平Lp（a）的表型B、S1在CCVD组中出现的频率（19%）高于对照组（5.7%）；相反，伴低水平Lp（a）表型S4和未检出（null）在CCVD组中出现频率（36.2%）,低于对照组(51.9%)。,5研究证明，型高脂血症（HLP）、周围血管性疾病（PVD）、晚期肾病（ESRD）、糖尿病等患者Apo（a）表型频率分布与正常人均无显著性差异，但血清Lp（a）浓度显著高于正常人。一般高分子量表型（S2、S3、S4）患者血清Lp（a）水平高于同表型正常人。这些资料显示，除Apo（a）基因多态性明显影响血清Lp（a）水平外，一些非遗传因素（如环境、性激素水平等）和/或其他遗传因素对Lp（a）水平也有影响,2 载脂蛋白E表型,ApoE是一种含有299个氨基酸的单链多肽糖蛋白（Mr34200），主要存在于CM、VLDL和HDL中。 ApoE多态性的产生是由于其一个遗传位点上的3个主要等位基因2、3、4所编码的3种主要ApoE异构体E2、E3、E4之间单个氨基酸替换及其与四种受体的亲和力不同。人群中有6种不同的ApoE表型：三种纯合子（E2/2、E3/3、E4/4）和三种杂合子（E3/2、E4/2、E4/3）。ApoE3/3是人群中最常出现的形式，常被称为“野生型”（Wild-type），其多肽链112位和158位均为Arg,ApoE多态性主要由其基因多态性所决定，另外也受到翻译后化学修饰的影响。许多研究资料表明，ApoE多态性不仅CHD、AS的发生发展及危险性密切相关，而且与Alzheimer病（AD）发生有关联，这些领域的研究已引起人们广泛关注与浓厚兴趣。许多临床及研究实验室对比进行了广泛的研究，依据被检查病人的类型，已建立了几种快速准确测定ApoE表型的方法。,一、ApoE表型检测的方法学,ApoE表型检测即可以以VLDL为样品，又可以直接以血清（或血浆）为样品，通过IEF电泳分析、双向PAGE或结合免疫印迹法进行测定。,1等电聚焦（IEF）：由于三种主要ApoE异构体E2、E3和E4的等电点（p）分别为5.89、6.02和6.68，E4比E3多一个正电荷，而E2比E3少一个正电荷。因此，可应用IEF检测这些异构体间电荷差异而确定不同ApoE表型。传统ApoE表型检测方法多采用超速离心法或化学沉淀法分离VLDL，脱脂后进行IEF，然后进行染色分析。这种方法需要血清量较多，昂贵、费时，又需要大型设备，不适合大规模研究。ApoE异构体之间染色程度之间差异及电泳过程中泳动距离的变异性也造成结果的不稳定性。,但此类方法亦存在一些缺点，如对于存在与普遍异构体具有相同电荷的罕见异构体标本，或在糖尿病等病理状态时，由于转录后修饰引起蛋白质变化的标本检测时，就会给出错误的结果,2免疫印迹法（immunoblotting）：血清脱脂后，经IEF电泳将ApoE与其他蛋白质分离，然后将凝胶中蛋白质转移到NC膜上，用抗ApoE抗体作为一抗进行免疫印迹反应或采用直接的免疫固定法，即可灵敏而特异地显示出ApoE区带的位置，从而确定ApoE表型。此方法利用抗原-抗体的特异反应，排除了血清其他蛋白质的干扰，不需超速离心分离VLDL，血清用量少，是国内外实验室检测ApoE表型常用的方法之一。,3双相电泳（two-dimensional electrophoresis） 第一相应用IEF电泳将等电点不同的蛋白质分离；第二相根据蛋白质分子量不同及浓度的差异，应用SDS-PAGE进行分离，由此确定ApoE表型。此技术能解决IEF遇到的一些转录后修饰的问题，临床标本用量也很少，并且可以同时进行定性和定量分析，但由于成本昂贵而且费时，有时也难以清晰地分辨表型，故临床上应用较少。,1仪器与试剂 （1）电泳仪，垂直板式电泳槽，超速离心机，光密度计等大培养皿 （2）主要试剂有 1.00g/ml NaBr与1.20g/ml NaBr溶液 脱脂液为乙醇/乙醚混合液（3：1,V/V） 样品溶解液为0.01mol/l Tris-HCl,pH8.2,内含1%SDS，5%-巯基乙醇及13%蔗糖 凝胶贮存液；（Acr）、（Bis） 电极缓冲液：0.01mol/l H3PO4（阳极），0.02mol/L NaCl（阴极） 凝胶应用液：PAG浓度为7.5% 0.2%CBBG250染色液 脱色液：甲醇/水/乙酸溶液（5：5：1，V/V）。,2，实验方法 人血清VLDL的分离 VLDL的脱脂 IEF电泳电泳 凝胶用0.2%CBBG250染色。脱色后至图像清晰后照像扫描 ApoE表型判定：根据电泳图谱，依据E2、E3、E4各区带光密度比例确认ApoE各表型，如图3和表1所示,图3 VLDL的IEF-PAGE图,2019/8/21,43,可编辑,表1 ApoE表型的鉴定,由于ApoE即有主要异构体，又有次要异构体，有时使表型确定较为困难。一般情况下，应用此法较易确定ApoE纯合子表型，但对于某些杂合子表型的判定要慎重，往往要在色带经过光密度扫描以后，根据两条色带颜色深浅之比才能最后定论。如仍难以确定时，可用唾液酸酶处理VLDL，使次要异构体减少或消失，而有利于表型的判定,三、免疫印迹法检测ApoE表型,目前检测ApoE表型最常用方法。此法直接用血清（或血浆）作为样品，脱脂后进行IEF电泳，然后用特异性多克隆或单克隆抗体进行免疫印迹反应，根据黑色后图谱即可确定ApoE表型。此法比经典IEF法更省时、简便、准确。,1仪器与试剂 电泳仪，垂直板式电泳槽，转移电泳槽，NC膜；主要试剂有：3：1（V/V）乙醚脱脂液；样品溶解液；两性电解质丙烯酰胺（Acr）、N-N甲叉双丙烯酰胺（Bis）TEMED电泳缓冲液转移电泳缓冲液：洗涤液封闭液：羊抗人ApoE多克隆抗血清；HRP标记的兔抗羊IgG：,2实验方法 （1）样品处理 （2）IEF电泳 （3）免疫印迹 转移电泳条件18V/cm，按转移电泳槽要求将凝胶上的蛋白电泳转移到NC膜上 (4）ApoE表型判定 根据所显示ApoE区带图谱即可确定ApoE表型，见4所示,图4 6种ApoE表型免疫印迹图,此方法样品用量少（1020l血清即可），故特别适合临床检验与大规模人群调查。由于ApoE糖类含量会影响IEF结果，所以在IEF前常用唾液酸酶预处理标本，以除去唾液酸残基。唾液酸酶的处理加强了主要区带，减弱了干扰的唾液酸型区带，克服了未用酶处理时，E3/2和E3/3有时难以分辨的困难，提高了表型判别的准确性。另外，如选用pH48范围的梯度作IEF电泳，则几乎能检测出至今为止所发现的所有异构体表型,四、ApoE基因型的检测 采用PCR、RFLP技术从基因水平检测ApoE基因多态性（基因型），操作简便、快速准确,1仪器与试剂 （1）仪器：电泳仪、基因扩增仪； (2）试剂：Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA参考物（pBR322DNA/Hacmarkers）、Hha,2实验方法 （1）引物的设计与合成 常用序列为 P1：5-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3；P2：5-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3。特异性扩增ApoE基因第4外显子区含编码112位与158位氨基酸的基因序列（如图-5）。产物片段292bp。,图5 PCR扩增产物经Hha酶切后RFLP模式,（2）模板DNA提取 经典法，取全血100l，蛋白酶K消化，按标准酚、氯仿、异戊醇法提取DNA； 碘化钠法，参照Loparev等法加以改良，取全血1加Na，加氯仿/异戊醇（24：1），离心后取上清加异丙醇提取DNA 微量血斑水煮法，取50l全血点至无菌滤纸上，自然干燥后用甲醇固定，室温贮存。临用时，剪成一直径5mm的圆形血斑纸块，将其混至100l无菌双蒸水中，100煮沸30min以裂解细胞。取混合物15l作膜板用。,（3）PCR扩增； 反应体系为50l 按下列程序循环35 94变性1min，65退火1min，72延伸1.5min,最后于72再延伸10min， 取产物10l经2%琼脂糖凝胶电泳（溴化乙啶），紫外灯下观察扩增为292bp。,（4）扩增产物的限制性酶切 PCR扩增产物17l直接用10UHha酶切，37消化4h。反应终止后产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色35min，以DNA片段长度标准物为参考，紫外灯下观察结果并照像,ApoE基因型判定参照Richard等方法 2/2出现3条带（91bp,83bp,61bp） 3/2出现5条带（91bp,83bp,61bp48bp,35bp） 3/3出现4条带（91bp,61bp48bp,35bp） 4/3出现5条带（91bp,83bp,61bp48bp,35bp）（91bp,72bp,61bp,48bp,35bp） 4/2出现6条带（91bp,83bp,72bp,61bp，48bp,35bp） 4/4出现4条带（72bp,61bp,48bp,35bp）,该法检测的ApoE基因型图谱如表2所示 *：P0.05；*P0.01(均与对照组比较) 表中所示动脉粥样硬化性脑梗死（ABI） 病人4/3基因型频率（30.0%）与4等位基因频率(18.0%)均显著高于健康对照组,表2 人ApoE基因型和等位基因频率分布（%）,五、ApoE表型检测的临床意义,1人群ApoE表型 人群中存在六种ApoE表型，其由位于一个基因位点的三个共显性等位基因所控制。正常人群中以E3/3表型频率最高（超过50%）；含E3的杂合子（E4/3、E3/2）居中（二者之和超过20%）；E2/2、E4/4和E4/2表型频率最低（三者之和不超过8%,2ApoE表型分布ApoE表型与等位基因频率分布具有一定种族差异性 无性别差异。中国人与日本人群十分相似，E3频率均高于80%，而欧美人群均低于80%。欧洲人E4等位基因频率从北到南呈下降梯度分布，亚洲人E4频率低（4.9%12.7%），相比之下，非洲黑人及巴布亚新几内亚人E4频率高（约分别为30%、36.8%）,3ApoE表型与高脂血症 ApoE多态性可能与不同的高脂血症（HLP）、CHD发生的种族差异及家族倾向有关 已发现型HLP患者几乎无例外的均为E2/2表型，易早发严重的AS。V型HLP患者ApoE4含量比正常人高。CHD患者E4/3表型和E4基因频率明显高于正常对照组。4与高TC、高LDL-C和高ApoB水平密切相关，可能是高胆固醇血症和CHD的遗传易患因子。,4ApoE表型与脑病 ApoE多态性与缺血性脑血管病（ICVD）关系密切。Pedro-Botet等研究发现ICVD组E4/3表型频率明显高于对照组，E3/3表型频率明显低于对照组，认为4基因可能是ICVD的一种遗传标记。而Couderc等采用病例一对照的方法研究认为ICVD组E3/3表型频率明显低于对照组，而E3/2明显高于对照组，认为2基因可能是ICVD的危险因素。这些结论之间的差异可能与研究方法、所选病例及研究人群之间差异有关,5ApoE表型与AD ApoE多态性是Alzheimer病（AD）危险性的重要决定因子。 Shimaro等首先描述AD与4的关系，他们运用IEF研究发现AD患者4频率比对照组高2倍。此后，Rose研究组等相继报道迟发性家族性AD（FAD）病人4频率增高，都描述、证实和讨论了4与AD的关系。Schachter等率先报道百岁老人普遍拎携带2等位基因。高龄老人携带2数量是年轻人的2倍。因此，2基因似乎不仅可保护人们免患AD，而且还与长寿有关。,3 载脂蛋白B基因多态性的检测,ApoB基因具有明显的多态性，其核苷酸变异有75处，其中导致氨基酸变异的有54处，例如多种酶限制性片段长度多态性（RFLPs），3端高变区的数目可变的串联重复顺序（VNTR），信号肽（SP）多态性。大量研究表明，ApoB的基因多态性与动脉粥样硬化有不同程度的关系。,一、分析ApoB基因多态性的方法,对ApoB基因多态性进行检测、分析的方法很多，如：限制性内切酶的酶谱分析法，PCR直接分析法，PCR产物RFLP分析法，等位基因特异性寡核苷酸（ASO）杂交法等等，其中最多用且简单的方法有PCR产物直接分析法和PCR产物RFLP分析法,PCR产物直接分析法 采用合适的引物，通过多次扩增，获得靶基因序列扩增片段，直接分析法片段的大小，可用于分析基因的缺失与插入。这种方法简便、快速、灵敏，可分析ApoB基因VNTR、SP多态性。,基因突变往往会造成限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，是研究ApoB基因PFLPs的较好方法，具有灵敏、简便、可同时对大量样品进行分析等优点。,二、ApoB基因多态性的检测,ApoB基因多态性研究较多的有 RFLP VNTR SP多态性,1RFLP的检测 ApoB有10种RFLP，一般采用PCR-RPLPs方法进行分析，研究较多的有第26外显子Xba、Msp位点，第29外显子EcoR位点，在Apob DNA上的位置如图6，图7所示,图6 ApoB基因部分RFLPS示意图,图7 ApoB基因多态性位置示意图,用于PCR的引物如下： Xba-5GGAGACTATTCAGAAGCTAA Xba-3GAAGAGCCTGAAGACTGACT EcoR-5CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG EcoR-3CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC Msp-5TCTCGGGAATATTCAGGAACTATTG Msp-3CTAAGGATCCTACAATGTCAAGGT,Xba酶切位点的RFLP是由于2488位密码子第三个碱基突变（ACCACT），产生一个Xba酶切位点，但并未改变所编码的氨基酸序列，存在Xba酶切位点（X+）的等位基因，其PCR产物酶切后出现433bp和277bp两个片段，不存在Xba酶切位点（X-）的等位基因，PCR产物经酶切后仍为其产物710bp片段,RFLP是由于4154位密码子改变（GAAAAA），使原有的EcoR酶切位点消失，氨基酸序列中赖氨酸取代谷氨酸，存在EcoR酶切位点（R+）的等位基因，其PCR产物经EcoR酶切后得到253bp及227bp两个片段，不存在EcoR酶切位点（R-）的等位基因，其PCR产物酶切后仍为480bp的片段。,Msp酶切位点的RFLP，是由于3611位密码子改变（CGGCAG），谷氨酰胺取代了精氨酸，含Msp酶切位点（M+