基因工程药物研发的基本过程

基因工程药物研发的基本过程基因工程药物的研发分为上游和下游两个阶段：上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。 此阶段的工作主要在实验室内完成。下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。血管抑制素(angiostatin ,简称AGN) 是纤溶酶原的一个酶解片段,相当于其14 Kringle 区,具有抑制内皮细胞增殖、抑制血管生成及抑制多种类型肿瘤生长和转移的生物功能,是一种新型血管生成抑制因子1 , 2 ,对于控制肿瘤、糖尿病视网膜病变、消化道溃疡、关节炎等病理性血管生成具有重要的研究价值和应用前景.PCR产物的T载体克隆（一） 重组T质粒的构建一原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5磷酸基和3羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3OH末端与5端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。连接反应的温度在37时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。二材料与方法1 材料外源DNA片断2 仪器、用具移液枪、碎冰3 试剂pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP4 方法连接体系如下：16连接过夜。（二） 重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定1 材料E.coli JM109菌株2 仪器、用具超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml 离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器3 试剂(1) CaCl2、LB平板（见附录）；SOC培养基（见附录）；SOB培养基(2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；无水乙醇的Buffer W2a(3) 1电泳缓冲液（TAE）；溴化乙锭溶液（EB）有毒，小心；琼脂糖；6加样缓冲液(4) 酚；氯仿；异戊醇(5) ddH2O；10PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRa rTaq酶4 方法1. 大肠杆菌感受态细胞的制备(1) 取大肠杆菌JM109保存液50l，接种于4ml LB（或SOB）液体培养基中，37，300rpm振荡培养过夜，第二天取50l 转接到新的4ml LB（或SOB）液体培养基中扩大培养3h至OD600=0.350.4，在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min。(2) 4，5000rpm离心2min，去上清液。(3) 加入750l预冷的0.1M CaCl2重悬菌体，冰浴30min。(4) 4，5000rpm离心2min，弃上清液。(5) 加入100l 冰冷的0.1M CaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4保存备用。2. 重组DNA的转化(1) 将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37预热。(2) 于100l感受态细胞中加入10l连接产物，冰浴30min。(3) 将离心管转入42水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2min。(4) 在离心管中加入SOC培养基300l，枪头混匀，37、150rpm温和摇振60min。(5) 将200l 转化菌液均匀地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。注意事项： 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。 42热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。 菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。3 重组质粒的鉴定方案一 菌落PCR(1) 制备PCR混合液：(2) 用经灭菌的10l枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中(3) 盖上离心管得盖子，在沸水上温育10 min。(4) 将步骤 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25ul。(5) 按以下条件进行PCR反应：94预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94变性1min，57退火1min，72 延伸1min；循环结束后72再延伸5min。(6) 取5l PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。方案二 质粒PCR1. 碱裂解法少量制备质粒DNA(1) 用离心管收集4ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14000rpm离心30秒，弃尽上清。(2) 用250l已加入RNase A1的Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。(3) 加入250l Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5min。*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。(4) 加入400l Buffer S3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2min，14000rpm离心10min。*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。(5) 将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm离心1min。(6) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500l Buffer W1，5500rpm离心1min。(7) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入700l已加无水乙醇的Buffer W2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700l已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。(8) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm离心1min。(9) 连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 离心管中，在silica 膜中央加入25-30l Eluent或去离子水。(10) 室温静置2 min，14000rpm离心1min洗脱DNA。(11) 取5L样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。2. 抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。(1) 加TE稀释质粒DNA溶液至300L。(2) 加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡混匀，静置3min。(3) 14000rpm 离心5min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），混匀，静置3min。(4) 14000rpm离心5min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，静置3min。(5) 14000rpm离心5min，吸上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20放置15min，沉淀质粒DNA。(6) 14000rpm离心13min，弃上清液，沉淀加入200L 70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用20L去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀，-20保存待用。(7) 取5l样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。3. 质粒PCR(1) PCR反应体系如下：(2) PCR 扩增反应条件：94预变性3min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为：94变性1min，57退火1min，72 延伸1min；循环结束后72再延伸5min。(3) 取5l PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。PCR产物克隆大致分为两类，平滑末端连接和粘性末端连接，平滑末端比粘性末端的连接效率要低很多。平滑末端连接：载体为平末端，可用 EcoR V或Sma I酶切，同时为了防止载体自连，对载体做了去磷酸处理。PCR产物为磷酸化的平末端产物：一般高保真聚合酶扩增得到，高保真聚合酶有很强的35外切酶活性。或将非平末端的PCR产物使用DNA聚合酶进行平末端处理。对于平末端的PCR产物还需要进行磷酸化处理，使其5磷酸化。粘性末端连接：1、酶切克隆：在PCR引物的5端引入与载体匹配，不同识别位点的限制性内酶切位点，载体使用同样的限制性内切酶酶切，进行连接，通常可以得到定向克隆的结果。2、TA克隆：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。TA克隆没有方向性。聚合酶链式反应 科技名词定义中文名称：聚合酶链式反应 英文名称：polymerase chain reaction;PCR 定义1：用引物和DNA聚合酶进行体外扩增特定的DNA区域的一种技术。 所属学科： 生态学(一级学科) ；分子生态学(二级学科) 定义2：体外酶促合成特异脱氧核糖核酸片段的技术。 所属学科： 水产学(一级学科) ；水产生物育种学(二级学科) 定义3：通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法。 所属学科： 细胞生物学(一级学科) ；细胞生物学技术(二级学科) 定义4：由穆利斯(K. B. Mullis)于1988年首创的一种在体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术。 所属学科： 遗传学(一级学科) ；分子遗传学(二级学科) 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录隐藏概述 PCR原理 PCR反应体系与反应条件 1. 1.标准的PCR反应体系 2. 2、PCR引物设计 3. 3、模板的制备 4. 4、PCR反应条件的控制PCR步骤 1. 1.DNA变性 2. 2.退火 3. 3.延伸PCR检测 PCR反应特点 1. 特异性强 2. 灵敏度高 3. 简便、快速 4. 对标本的纯度要求低PCR的循环参数 1. 1、预变性（Initial denaturation） 2. 2、循环中的变性步骤 3. 3、引物退火（Primer annealing） 4. 4、引物延伸 5. 5、循环数 6. 6、最后延伸PCR仪器 PCR实验室的建立方法 1. 1、实验室布局 2. 2、设置标准 3. （一） 试剂储存和准备区 4. （二）标本制备区 5. （三）基因扩增区和产物分析区概述PCR原理PCR反应体系与反应条件 1. 1.标准的PCR反应体系 2. 2、PCR引物设计 3. 3、模板的制备 4. 4、PCR反应条件的控制PCR步骤 1. 1.DNA变性 2. 2.退火 3. 3.延伸PCR检测PCR反应特点 1. 特异性强 2. 灵敏度高 3. 简便、快速 4. 对标本的纯度要求低PCR的循环参数 1. 1、预变性（Initial denaturation） 2. 2、循环中的变性步骤 3. 3、引物退火（Primer annealing） 4. 4、引物延伸 5. 5、循环数 6. 6、最后延伸PCR仪器 PCR实验室的建立方法 1. 1、实验室布局 2. 2、设置标准 3. （一） 试剂储存和准备区 4. （二）标本制备区 5. （三）基因扩增区和产物分析区 编辑本段概述聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。 DNA聚合酶（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow PCR流程fragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 编辑本段PCR原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 发现耐热DNA聚合酶-Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 编辑本段PCR反应体系与反应条件1.标准的PCR反应体系 10扩增缓冲液10l4种dNTP混合物200l引物10100l模板DNA0.12gTaq DNA聚合酶2.5 lMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水100 lPCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即: 引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)。 引物有多种设计方法，与PCR在实验中的目的决定。但基本原则相同 PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu。分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但已发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择 模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制 缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构 2、PCR引物设计PCR反应中有两条引物，即5端引物和3引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5端引物与位于待扩增片段5端上游的一小段DNA序列相同；3端引物与位于待扩增片段3端的一小段DNA序列互补。 引物设计的基本原则 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物内部不应出现互补序列。 两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 端的互补重叠。 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。 引物的5 端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。 v 引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动搜索）* vOligo6 （引物评价） vVector NTI Suit vDNAsis vOmiga vDNAstar vPrimer3 （在线服务） 3、模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。 标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。 4、PCR反应条件的控制PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L 底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20200umol/L TaqDNA聚合酶 2.5U（100ul） 引物 浓度一般为0.1 0.5umol/L 反应温度和循环次数 变性温度和时间 95，30s 退火温度和时间 低于引物Tm值5 左右，一般在4555 延伸温度和时间 72，1min/kb（10kb内） Tm值=4(G+C) 2(A+T) 循环次数 :一般为25 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。 编辑本段PCR步骤标准的PCR过程分为三步： 1.DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如图所示： 现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60-65间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。 编辑本段PCR检测PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。 编辑本段PCR反应特点特异性强PCR反应的特异性决定因素为： 引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(g=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。 编辑本段PCR的循环参数1、预变性（Initial denaturation） 模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。 2、循环中的变性步骤循环中一般95，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间 变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 3、引物退火（Primer annealing）退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。 退火温度对PCR的特异性有较大影响。 4、引物延伸引物延伸一般在72进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略 延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。 5、循环数大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。 6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72维持5-15分钟使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。 （四）PCR中的污染和假阳性 PCR中污染主要来自 1、样品间交叉污染； 2、先前PCR产物遗留（carry-over） 编辑本段PCR仪器pcr仪器的发展 pcr温度循环至关重要，pcr扩增仪各参数必须准确。自perkin elmercetus公司第一台pcr扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。 为了便于了解和选购适宜的pcr实验设备，现将部分国内外pcr扩增仪列表如下；这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点。国产1109型dna扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b体积小，智能化与自动化程序高，可以兼做套式pcr，方便实用。以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数，可以达到节省劳动力的目的。在采用这些仪器作pcr试验之前，一般均应实测管内温度变化循环情况，以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度，用于修正设计的循环参数。温度滞后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形状（与铝块孔匹配程度）的影响，这对变温铝块式仪器影响更大些。对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器，在使用低于室温的温度来保冷pcr反应后小管时，应注意冷凝水的问题，勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。 国内外生产的几种dna扩增仪 1109型 北京新技术所与军科院联合 机械臂 变温水浴 电子调温 400.5ml 16400元/台 90a/b型 中科院遗传所 机械臂 变温水浴 电热 14000元/台 ptc-51a/b型 军事医学科学院 变温气流 电子调兼作套式 300.5ml 12000元/台 dna thermal cycler perkin elmercetus(美) 变温铝块 压缩机致冷 480.5ml us $ 20000.- thermocycler 60 00 180 b.braun biotech (德) 变温水浴98四档 电热,自来水冷却 601.5ml 1001.5ml 1801.5ml dm 30000.- automatic temperature cy-cler single block twin block ericomp inc.(美) 变温铝块25100 电热,自来水冷却 291.5ml 581.5ml us $4985.- us $7980.- grant autogen grant instrumant ltd(美) 变温水浴099 电热,自来水冷却或加冷循环器 501.5ml or 501.5ml us $250. plus us $ 15.-for rack(x2) techne phc-1 phc-2 techne ltd.(英) 变温铝块099三档 电热500w水冷100w 540.5ml 540.5ml 241.5ml 3383. 3997. - biooven biothrm corp(美) 变温气流 -150 115v 11a 200s of 496plate us $ 2990. - trio-thermo-block tb-1 biomertra(德) 半导体变温 220v 320管 分别控温 dm12900. - micro cycler e eppendorf(美) 变温铝块 220v/100v 329管 us $ 3500. - PCR常见问题 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及溴乙锭的使用， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 假阳性 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。 克隆PCR产物 1)克隆PCR产物的最优条件是什么？ 最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液,50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4过夜。 2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？ 如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。 3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？ A）涂布未转化的感受态细胞。 如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。 B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。 例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。 铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为： 1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞 如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。 C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。 D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。 4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？ A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4过夜。 B）插入片段带有污染，使3-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3-T缺失。 C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。 D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。 E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞 PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系： 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸