《RNA复制》PPT课件.ppt

RNA 复制,1. RNA 是怎样从DNA模板（DNA templates） 转录而来的(transcription)? 2.新合成的RNA是怎样变成具有生物功能的RNA链的? 3. RNA和 DNA是怎样利用 RNA作为模板转录而来的 (反转录reverse transcription); 4.RNA结构与功能的复杂性暗示着什么?,1. RNA 分子在结构与功能上具有很大的多样性,RNA分子具有与蛋白质分子一样的复杂性与独特性. 作为DNA 与多肽之间的信使 (mRNA), 作为适配器使特殊的氨基酸与其在mRNA上的特殊的基因编码相对应 (tRNA), 作为蛋白质合成场所的核糖体中的结构与催化成分 (rRNA). 在RNA病毒中起着保存其遗传基因的作用 。 催化最初的RNA 产物的合成. 在进化史上可能比DNA更早出现。,2. DNA 与 RNA在某些方面很相似，但是在其他方面则不同,在一些合成的基本机制上很相象: 合成都需要模板的引导; 在链的伸展上有同样的极性 (5 to 3); 合成都需要三磷酸核苷 (dNTP or NTP). 不同的地方: RNA的合成不需要引物的存在（primers）; 只涉及到一个大的 DNA 分子中的一小部分; 只使用两个DNA链中的一条作为模板;不存在校正的问题; 起始变化很大（合成起始的时间、地点、效率变化非常大）,3. 在E.coli 中的RNA聚合酶有多种功能,全酶包含五个亚基 (a2bb s)被用来合成 E. coli中的所有RNA. 功能包括: 寻找 DNA链上的合成起始位点并解开一小段 DNA的双螺旋起始 (initiation); 选择正确的 NTP 并催化磷酸酯键的形成延长 (elongation); 侦测RNA合成的终止信号终止 (termination).,4. RNA 的合成发生在DNA模板上的一个“移动”的 转录“泡”中,在转录过程中，只存在着一小段的DNARNA杂合体 (在细菌中为8 bp in bacteria). 在E. coli 中，每次有大约17 bp DNA双螺旋在转录泡中被解开. E. coli RNA 聚合酶催化的RNA 链以50-90 nucleotides/second 的速度延长.,5. RNA 聚合酶通过识别DNA链上的启动序列（启动子）来启动转录,启动子序列同基因靠的很近. 通过“蛋白质结合法” 可以确定启动子的序列 足迹法(e.g., footprinting techniques). 启动子虽然都可以和聚合酶结合，但是它们的序列却是千差万别的，不过，在 10 和 35位置却都有相同的序列. 通过定位突变技术可以发现，启动子同保留序列越相近，则效率越高.,Alignment of different promoter sequences from E.coli genes: the 10 (the Pribnow box) and 35 consensus region were revealed.,Sequences of the coding DNA strand is conventionally shown,Add TTTACC N12 TATAAT N7 A,Present only in certain highly expressed genes,6. s 亚基 使 E.coli RNA 聚合酶 能够辨认出特殊的启动子序列,没有 s 亚基的 RNA 聚合酶 (i.e., the a2bb) 不能在启动子的位置启动RNA的合成. s 亚基可以降低RNA聚合酶与DNA链上的普通的基因链的结合.,Standard Heat-shock Nitrogen starvation,s70 for standard promoters; s32 for heat-shock promoters; s54 for nitrogen-starvation promoters,E.coli contains multiple s factors for recognizing different types of promoters:,7. RNA 聚合酶将模板DNA解螺旋，然后开始合成RNA,聚合酶首先移动到“启动子”区域，并形成一个紧密结合的复合体. 然后在这个区域中大约 12-15 bp 长的链解螺旋，这个部分包括了从 AT-rich 10 site to +3 的位点.,8.在DNA 上的特殊的被称为终止子的序列上E.coli RNA 聚合酶停止合成 RNA,在细菌中已经鉴定出两种终止子: 一种依赖于 r （rho）蛋白, 另一种则不依赖. 在r 不依赖终止区, 转录出来的 RNA 可以形成发夹结构，而且在终点结束前还有一系列U核苷酸 （ A in DNA）. r-依赖终止子需要 r 蛋白具有 ATP-依赖的 RNA-DNA 解螺旋酶活性, 可以终止RNA的合成 The r-依赖终止子在序列上并不表现出具有特殊的相似性，尽管它们也有回文序列 是新合成的RNA上的信号，而不是DNA的信号使得RNA合成终止,r-independent terminator: a model,Palindrome DNA sequences,Oligo Us,Stem-loop (hairpin) structure,Model for an r-dependent terminator,9. 转录过程是一个受到高度调节的过程,蛋白合成是一个复杂的并且消耗很大能量的过程，转录是这个过程中的第一步，也是用来调节基因表达的理想位点之一 首先，RNA聚合酶同每一个启动子结合的效率都不同. 其次，有许多蛋白结合在DNA链上，它们可以距离启动子很近或者较远，但是可以起到促进(activator)或者抑制 (repressor) 特定RNA分子合成的作用,10. 在真核细胞的细胞核中，存在着三种RNA聚合酶（Pol）(I, II, and III),分别针对着三种基因的产物: rRNA, mRNA or tRNA 基因. 这些酶可用它们对蝇蕈素的敏感性来鉴定(从一种有毒的蘑菇中提取的).,Eukaryotic RNA polymerases,14. RNA 分子在由DNA模板合成后还需要进一步的加工,由RNA聚合酶合成的原初转录物（ primary transcripts 真核细胞中的mRNA ） 需要经过 5 末端的切除和特殊结构的形成, 拼接 (introns 内含子切除 exons 外显子的连接), 及 3 末端多聚腺苷酸的形成. 原核生物与真核生物中的tRNAs的原初转录物的加工包括：由核酸内切酶在tRNA两端剪断，由核酸外切酶从3端逐个切去附加的顺序，进行“修建”，在tRNA 3端加上胞苷酸胞苷酸腺苷酸（CCAOH），核苷的修饰,15. 真核生物的mRNA 前体在转录开始后不久就获得 5 cap的帽子结构,由一个 GTP而来的GMP 通过5,5-triphosphate is连接到 mRNA的5 end.,16. 绝大多数的真核 mRNAs在3末端具有 poly(A) 的尾巴结构,这个尾巴包括 80 到 250 个的腺苷酸残基. mRNA 前体的合成要越过 poly(A) 的尾巴结合的位点. 高等真核生物（酵母除外）的细胞和病毒mRNA在靠近3端都有一段非常保守的 AAUAAA 序列，这一序列距离多聚腺苷酸加入的位点有大约 11 到30 个核苷酸范围，这一序列为链的切断和多聚腺苷酸化提供了信号. 核酸内切酶和多聚腺苷酸聚合酶以及其他一些蛋白结合成多聚蛋白复合体，共同催化这一事件的发生,A poly(A) tail is usually added at the 3 end of an mRNA molecule via a processing step.,17. 对于 mRNA-DNA 杂化物的研究显示了真核生物的基因的不连续性,对细菌基因组的研究显示每一个基因都是一连续的DNA片断. 在脊椎动物中，几乎所有的基因都含有内含子（组蛋白基因除外）. 某些酵母的许多基因中则不含有内含子. 后来又发现在某些细菌中也有含内含子的基因.,18. 由不同的粘接机制又可将内含子分为四类,Group I introns 存在于一些编码 rRNAs, mRNAs, and tRNAs 的核、线粒体以及叶绿体基因中. Group II introns 经常出现在真菌，藻类以及植物的编码mRNAs 的线粒体及叶绿体DNA中. Group III introns (the largest group) 存在于真核生物编码 mRNAs的基因中. Group IV introns存在于真核生物编码tRNAs 的基因中,19. Group I introns 自我移除，中间使用了一个鸟嘌呤作为因子,在四膜虫的 rRNA 前体中的内含子可以自我移除而不需要任何蛋白的帮忙. 内含子的移除及两个外显子的精确连接是通过两个亲核的转酰基反应完成的 (涉及到两个 3-OH 作为亲核试剂的作用).,Group I introns are removed by self-splicing via two nucleophilic transesterification reactions.,20. Group II introns 也是自我移除的，中间涉及到了一个类似套索的结构,内含子中一个腺苷酸残基的2-OH集团扮演了group I intron自我移除过程中的鸟嘌呤的3-OH的角色.,Group II introns are removed via self- splicing with an adenylate residue of the removing intron acts as the nucleophile,forming an lariate-like Intermediate.,21. 第三类内含子存在于核中的 mRNA 原初转录物中，并且是四类内含子中数量最大的,通过对基因组DNA与cDNA序列的比较，发现了在mRNA前体中存在的内含子在两个末端具有特殊的碱基序列：由 GU 起始，以 AG 结束. 第三类内含子的移除方式同第二类非常相似，但是它需要一些高度保留的核蛋白（ small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) ）, 在这些蛋白中都包含有富含U的短链核RNA（ small nuclear RNAs (snRNAs) ）.,Type III introns, found on nuclear mRNA primary transcripts, are removed via the spliceosomes,22. group IV introns 存在于 tRNA 前体中并且通过核酸内切酶及RNA连接酶的作用使之移除,核酸内切酶首先切断内含子两端的磷酸二酯键. RNA连接酶将两个外显子连接起来，这个过程需要ATP. 连接过程同DNA连接酶的一样. 第四类内含子的移除过程同前三类的都不同.,Group IV introns are spliced via the action of specific endonuclease and RNA ligase.,RNA ligase,23. 通过不同的RNA再加工，可能产生不同的蛋白质,在不同的细胞中或者在发育的不同阶段，转录物可能会被采取不同的加工方式并产生不同的基因产物（蛋白质）.,Multiple mRNAs (thus polypeptide chains) can be produced via differential RNA processing.,24. 在真核生物以及原核生物中的不同的rRNA分子都是由相应的一个 pre-rRNAs加工而来的,在细菌中存在着三种rRNA， 16S, 23S 和5S rRNAs，它们都是由同一个pre-rRNA产生的 30S (about 6.5 kb, transcribed by RNA polymerase I). 在真核生物中存在着18S, 28S 以及 5.8S rRNAs，它们是由同一个加工40S pre-rRNA (14 kb)而来的 . 在真核生物中还存在着5S rRNA，它是单独产生的(transcribed by RNA polymerase III).,All the rRNAs are derived from a single precursor in prokaryotic cells.,The 18S, 5.8S, and 28S rRNAs in eukaryotic cells are derived from one pre-rRNA molecule (the processing needs small nucleolar RNA-containing proteins).,25. 原初 tRNA 转录物还要经过一系列的转录后加工,The processing of the primary tRNA transcripts include removal of the 5 and 3 ends, addition of the CCA sequence at the 3 end, modification of many bases, and splicing of introns (in eukaryotic cells).,Reverse transcriptases catalyzes the sythesis of DNA from