lhx5--kaede转基因斑马鱼的建立.doc

精品论文lhx5:kaede 转基因斑马鱼的建立高景霞，张长稳，张翠珍，彭刚（复旦大学脑科学研究院，上海 200032）5摘要：为了观察表达 lhx5 基因的斑马鱼背侧前脑这组神经元的轴突投射，我们将包含斑马 鱼 lhx5 基因编码区域的细菌人工染色体(bac) 通过同源重组的方法进行改造，获得 lhx5:kaede 细菌人工染色体，并通过显微注射入斑马鱼受精卵并筛选获得了 lhx5:kaede 转基 因斑马鱼。该转基因斑马鱼株可用于研究斑马鱼前脑背侧神经元的轴突投射路径及其分子机 制。10关键词：lhx5；同源重组；转基因斑马鱼中图分类号：q3-3construction of lhx5:kaede zebrafish transgenic linegao jingxia, zhang changwen, zhang cuizhen, peng gang15(institute of brain sciences, fudan university, shanghai 200032)abstract: to observe the axon projection of the anterior dorsal neuron in zebrafish forebrain, we modified the bacteria artificial chromosome (bac) containing the coding sequences of lhx5 gene, and got modified bac containg lhx5:kaede. we microinjected the modified bac to fertilizedeggs and screened to get lhx5:kaede zebrafish transgenic line. this transgenic line would be a20great help to study the underlying mechanisms of axon projection of anterior dorsal neuron.keywords: lhx5; homologous recombination; trangenic zebrafish0引言在斑马鱼前脑，胚胎早期发育生成的神经元的轴突形成高度固定及保守的神经束并向不25同的脑区投射。这些神经束是脑中复杂的神经回路形成的基础1。早期生成的神经元表达 lhx5 基因，lhx5 基因编码一个 lim 同源结构域的转录因子，可以调节 wnt 信号通路的拮抗 因子，从而促进斑马鱼前脑的发育2。为了观察表达 lhx5 基因的斑马鱼前脑背侧这组神经元 的轴突投射，我们用同源重组的方法改造了 bac，并通过显微注射并筛选制备了 lhx5:kaede 转基因斑马鱼。301材料与方法1.1 材料实验中所用到的野生型斑马鱼为 ab 品系。按照斑马鱼饲养的标准步骤3在循环水系统 中饲养。循环水用人工海水盐调整盐度至 500uf，用 nahco3 调整 ph 值至 7.2。将成年斑 马鱼交配获得胚胎，在胚胎培养液中，28.5培养到所需发育时期。斑马鱼胚胎的发育时期35用受精后的小时数4来界定。1.2 方法1.2.1bac 的生长、纯化和电转化将带有 230h6 bac（包含 lhx5 基因的 bac）的 dy380 菌种在含有四环素和氯霉素的lb 平板上划线，培养过夜。挑取单克隆，在含有四环素和氯霉素的 lb 液体培养基中培养。基金项目：国家自然科学基金（30900861）， 教育部博士点基金（20090071120098）作者简介：高景霞，（1974-）， 女，助理研究员， 神经系统发育。e-mail: - 6 -401.2.2targeting cassette 的制备将 kaede-flp-kan 质粒载体酶切线化并去除复制起始区域，以线化的 dna 为模板，扩 增需要的 targeting cassette。采用的引物序列如下：kaede-f(59-cccaatccgaggcgcggtgcccgtttgggaaggtcggctctcggtcccc tccagggcggacaccatgagtctgattaaaccag) 和 kaede-r(59-gaggattagtccag45aagtttgacgaggtgatgcagccagaatgcaagcagcttcgcgtcttctattccagaagt agtgaggag)。在这对引物序列中，斜体部分表示与 230h6 bac 相同的部分用于同源重 组的识别序列。下划线部分是与 kaede-flp-kan 质粒载体相互匹配的序列，用于 pcr 扩增。 pcr 扩增出 targeting casette 以后纯化该片段并用 dpni 酶切以去除模板 dna。1.2.3targeting cassette 的电转化和重组50挑取将带有 230h6 bac 的 dy380 单克隆在含有四环素氯霉素的 lb 液体培养基中培养 至 od 0.40.5。将得到的菌液 42热休克 15 分钟用以诱导重组酶的产生，然后新鲜制备 电感受态细菌。将 200ng 左右的 targeting cassette 电转化入带有 230h6 bac 的 dy380 电感 受态细胞中，将电转化后的细菌涂布于含有氯霉素和卡那霉素的 lb 平板上。1.2.4同源重组的确认55挑取同源重组后长出的克隆，32培养过夜。用菌液做模板进行 pcr 扩增以检验同源 重组是否发生。检验正确后，保存克隆并抽提重组后的 bac 备用。1.2.5去除同源重组后 bac 上的卡那霉素抗性基因将抽提得到的同源重组后的 bac 电转化至 el250 电感受态细菌。在 6 毫升含有氯霉素 的 lb 液体培养基中培养得到的重组 bac-el250 至 od 0.5。加入 60 ul 10% l阿拉伯糖（终60浓度 0.1%），继续培养 1 小时。将培养物进行 105 到 106 稀释后涂布于含有氯霉素的 lb 平 板，该稀释是为了得到单克隆。将得到的单克隆再接种到含有卡那霉素的 lb 平板，此步骤 是为了筛选到氯霉素抗性阳性而卡那霉素抗性阴性的 bac 克隆。1.2.6bac 显微注射将成功重组并成功去除卡那霉素抗性基因的 bac 克隆培养并提取 bac，浓度大约在65200-600ng/ul。用 0.5xte 溶液中透析 4 小时，回收 bac，并调整浓度至 200 ng/l。用无核 酸酶的水稀释 310 倍后注射到早期胚胎，这通常会导致 50%的胚胎死亡。1.2.7转基因斑马鱼的筛选f0 代斑马鱼可直接在荧光显微镜下筛选带荧光的胚胎， 再通过 f0 代自交筛选出能稳 定表达荧光的胚胎。701.2.8lhx5:kaede 转基因斑马鱼 kaede 光转换将 3648 小时的转基因 tg(lhx5:kaede)斑马鱼胚胎用 0.02 tricaine 麻醉后，用 1.2 低熔点琼脂糖腹卧位固定于透明载玻片的凹槽内，以便于实验观察。在激光共聚焦显微镜下 用 405nm 激光转化感兴趣的区域。1.2.9全胚胎原位杂交75在发育所需时期收集斑马鱼胚胎，用新鲜配制的 4%多聚甲醛固定胚胎，室温固定 2 小 时，4固定过夜。用蛋白酶 k 消化胚胎后，在未加探针的杂交液中预杂交 2 小时，再加入反义 rna 探针，65杂交过夜。第二天，用 65 ssc 溶液洗涤胚胎，然后用封闭液封闭，碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体孵育过夜，pbst 洗涤后，用 nbt/bcip 显色。杂交结束的 胚胎保存于 50%甘油/pbst 中待拍照。802结果和分析8590951002.1 lhx5 基因在斑马鱼胚胎发育不同时期的表达lhx5 基因在斑马鱼胚胎发育的 20 小时，在斑马鱼前脑背侧即有丰富的表达。除此之外， 在腹侧丘脑部位也有丰富的表达，在下丘脑也有表达（图 1a 和 b）。在胚胎发育的 24 小 时和 36 小时，lhx5 基因在前脑背侧的表达持续增加（图 1c-e），在发育到 48 小时，lhx5 基因的表达在前脑背侧有所减弱2(图 1f)。图 1. lhx5 基因在斑马鱼发育不同时期的表达。a. lhx5 基因在斑马鱼胚胎 20hpf 中的表达（侧面图）。b. lhx5 基因在斑马鱼胚胎 20hpf 中的表达（正面图）。c. lhx5 基因在斑马鱼胚胎 24hpf 中的表达（侧面图）。d. lhx5 基因在斑马鱼胚胎 36hpf 中的表达（侧面图）。e. lhx5 基因在斑马鱼胚胎 36hpf 中的表达（正面图）。f. lhx5 基因在斑马鱼胚胎 48hpf 中的表达（侧面图）。标尺：侧面图，100m；正面图，60m。fig.1 the expression pattern of lhx5 gene in the embryonic zebrafish. a. the expression pattern of lhx5 gene in20hpf (lateral). b. the expression pattern of lhx5 gene in 20hpf (frontal). c. the expression pattern of lhx5 gene in24hpf (lateral). d. the expression pattern of lhx5 gene in 36hpf (lateral). e. the expression pattern of lhx5 gene in36hpf (frontal). f. the expression pattern of lhx5 gene in 48hpf (lateral). scale bar: lateral, 100m; frontal, 60m.2.2 lhx5:kaede 转基因斑马鱼的制备流程为了制备 lhx5:kaede 转基因斑马鱼，我们获得了包含斑马鱼 lhx5 基因编码区域（克隆 编号：ch211-230h6）的细菌人工染色体（bacteria artificial chromosome, bac），并经过 在基因组数据库（/danio_rerio/info/index）中检索得以确认。该 bac 包含大约 200kb 的插入序列，其中大约 110kb 是 lhx5 基因的上游序列。lhx5 基因的编码序 列共有 5 个外显子，如图 2 所示，我们期望通过同源重组5将 kaede-polya-frt-kan-frt 序 列替代 lhx5 基因的第一个外显子序列，其中引入了 polya 序列，使其后的 4 个外显子也不105110115表达。kan 基因是为了筛选而引入的抗性基因，在 bac 重组后将其去除。从而使该 bac成为 lhx5 基因上游调控序列调控下的荧光蛋白 kaede6的表达。我们将重组后的 bac 注射7入斑马鱼受精卵，通过 pcr 筛选得到 lhx5:kaede 转基因斑马鱼。图 2 lhx5:kaede 转基因斑马鱼的制备流程fig. 2 the construction steps of lhx5:kaede transgenic line2.3 lhx5:kaede 转基因斑马鱼前脑背侧神经元的轴突投射lhx5 是特异表达于前脑背侧神经元的转录因子。lhx5:kaede 转基因斑马鱼特异性的标记 了斑马鱼前脑背侧神经元（图 3a）。当这组神经元胞体内的 kaede 经 405nm 紫外激光照射 后，转化后的 kaede 可以扩散到神经元的轴突当中，进而将轴突及轴突末端分布区做红色荧 光标记。紫外激光照射 30 分钟后，随着轴浆运输，被转换的 kaede 的红色荧光出现在轴突， 可以清晰的看到斑马鱼前脑背侧这组神经元的轴突投射路径（图 3c）。图 3b 显示斑马鱼 前脑背侧神经元的轴突向腹侧投射到前联合(anterior commisure，ac)和视上束(supraoptic tract，sot)8。120125图 3. lhx5:kaede 转基因斑马鱼株系 kaede 光转换观察斑马鱼前脑背侧神经元的轴突投射。a. lhx5:kaede 转 基因斑马鱼光转换前显示绿色荧光。b. lhx5:kaede 转基因斑马鱼光转换后的绿色和红色荧光。c. lhx5:kaede 转基因斑马鱼光转换后的 kaede 红色荧光。标尺：60m。fig.3 the photo conversion of kaede in the lhx5:kaede transgenic line to show the axon projection of anterior dorsal neuron in zebrafish. a. the green fluorescence of lhx5:kaede transgenic line at pre-conversion stage. b. the green and red fluorescence of lhx5:kaede transgenic line at post-conversion stage. c. the converted kaede of lhx5:kaede transgenic line at post-conversion stage. scale bar: 60m.1301351401453讨论光诱导变色荧光蛋白 kaede 包含 hyg 发色基团，在紫外光的照射后引起 62 位组氨酸 残基与碳原子间连接断裂，形成一个相连的双咪唑环系统，完成由绿色荧光到红色荧光 的转换。光转换后，使得红/绿比会显著增加约 2000 倍。因这一颜色转换特性的存在，kaede 蛋白可用于细胞的光学标记。利用 kaede 蛋白在光转换前后的颜色变化，可以持续追踪红色 荧光的动态变化，并用以将特异细胞与周围细胞进行区分6。该研究通过同源重组的方法将荧光蛋白 kaede 置于 lhx5 的基因表达调控序列之下。利 用一段与 lhx5 同源的序列并用热休克的方法诱导细菌中的重组酶表达实现重组，将 kaede 序列和卡那霉素抗性基因序列替代 lhx5 基因编码序列中的第一个外显子。通过卡那霉素抗 性基因实现筛选，得到特异的重组 bac 克隆。再通过 l-阿拉伯糖诱导识别卡那霉素抗性基 因旁侧序列的酶将卡那霉素抗性基因切除。使 kaede 荧光的表达模拟 lhx5 基因的表达模式， 可以用于研究表达 lhx5 基因的这组神经元特定的轴突投射。也可以研究这组神经元轴突投 射路径选择的分子机制。4结论本文通过同源重组的方法改造了含有 lhx5 基因的细菌人工染色体，并通过显微注射斑 马鱼受精卵并筛选获得了 lhx5:kaede 转基因斑马鱼。该斑马鱼株系可用于研究斑马鱼前脑 背侧神经元的轴突投射路径及其分子机制。参考文献 (references)1501551 wilson sw，ross ls，parrett t，easter ss. the development of a simple scaffold of axon tracts in the brainof the embryonic zebrafish, brachydanio rerioj. development, 1990, 108:121-1452 peng g, westerfield m. lhx5 promotes forebrain development and activates transcription of secreted wnt antagonistj. development, 2006, 133:3191-32003 westerfield m. the zebrafish book: a guide for laboratory use of zebrafish (danio rerio)m. 5th ed. eugene: university of oregon press, 20074 kimmel cb, ballard ww, kimmel sr, ullmann b, schilling tf. stages of embryonic development of the zebrafishj. dev dyn, 1995, 203:253-3105 lee ec, yu d, martinez de velasco, tessarollo l, swing da,