设计性试验半数致死量的测定.ppt

鱼 病 学 实 验,实验八,半数致死量的测定,目的,学习科研试验的设计和实施 学会半数致死量的测定,原理,半数致死量 (LD50) 是指一个毒物在实验生物的群体中可引起半数死亡的剂量。在毒理学中常用以测试某一化学物的急性毒性。最为原始的急性毒性指标是最小致死量(MLD)和绝对致死量(LD100)。前者指在一个群体中仅仅足够引起个别生物死亡的剂量，后者指生物群体中全部出现死亡的剂量。但如果所用的动物数增多，则在一定范围内，还可能发现更为敏感的或耐受的动物，则最小致死量将随之不断下降，而绝对致死量也可能不断增高。因此，这种方法所取得的参数是不够正确的，目前已少采用。如用动物实验制得剂量-反应曲线，再用统计学方法予以处理，所得半数致死量，则较有代表性，因此，它已成为常用的指标。毒物的毒性是LD50的倒数，即LD50的数值越小，毒性越高。反之亦然。在毒物的毒性分级中，常根据LD50的大小将毒性分成剧毒、高毒、中毒、低毒，或实际无毒等数级。,步骤,LD50的理论依据是： 将一群动物(如50只)等分为五组，每组给予不同剂量，各组有不同的死亡率，以毒物剂量作横轴，死亡百分率为纵轴制成曲线，则得到一个长尾的S形曲线(如左图)。 图中可以看出，在低剂量或高剂量处，剂量改变对动物的死亡率影响较小，而在曲线中段，即在50%死亡率附近，坡度较陡，剂量稍有增减，即能引起死亡率的急剧改变。所以，使用半数致死量作为毒物急性作用的指标是最敏感、最有代表性的。 。,如动物吸入毒物，以毒物在空气中的浓度表示剂量，则称为半数致死浓度(LC50)。动物种类和染毒途径不同，LD50也各异。因此在表示LD50或LC50时，必须注明动物种类及染毒途径等实验条件。 使用LC50时，还需规定吸入的时间或注明具体时间。 但在动物实验中，不可能用一次实验的结果代表该种属总体的50%死亡率的剂量，故必须将实验结果用统计学方法处理。由于动物群体的剂量-死亡数是一个偏态曲线(如右图)，直接用统计学方法处理将产生困难，必须将实验结果予以转换。,其方法是将横轴中的剂量改成对数，使它转换成正态分布的曲线(如右上图)，则剂量对数与死亡百分率便成一个对称的S形曲线 (如右中图) 。 为使计算更为方便，还须再将对称S形曲线的死亡率转换为概率单位，使之转换成直线(如右下图)。,这样可按直线方程式y=bx+a计算，获得各种指标。该方程式表示直线内x和y值的关系，x代表剂量对数，y代表死亡百分率，用直线上的死亡率50%处的剂量对数，查其反对数，即得实际的剂量。a是常数，亦称截距，即x=0时的y值，亦即代表在不给毒物时，动物自然死亡的估计。从这曲线上可查得最小致死量和绝对致死量，分别用LD1、LD99或LD5、LD95表示，也可用直线方程式计算出来。从公式也可算得LD0，即最大耐受量，它是使动物中毒而尚未致死的最大剂量或浓度。它与LD100一样，受到个别动物的敏感度的影响太大，往往不够准确。而且在统计理论上，正态曲线向左右伸展，绵延无穷，找不出与LD0或LD100相应的概率单位。由于实验资料具有抽样性质，所算出的LD50存在一定的抽样误差，故必须计算其95%可信限。它由LD50值加减1.96倍标准误后所形成的高限和低限两个值组成。,直线方程式中b是直线的斜率，表示该直线的斜度。斜率愈大，表示该毒物的剂量有微小改变时，即能引起死亡率的较大改变，所以可通过斜率比较两种以上LD50相近的毒物的毒性性质，或比较一种毒物在几种不同染毒途径时，表示一种实验动物对该毒物敏感性的分布，斜率越大的直线，表示该毒物 (或染毒方式)的毒性越大。如果直线的斜率相等，则表示毒物的毒性也基本相似。 经过统计学处理的LD50的斜率，比LD50本身有更多的意义。如下图所示，A和B是两种不同毒物，它们的斜率不同，但有相同的LD50。此外，斜率平缓，说明毒物的吸收差，解毒和排泄快，或毒作用的特异性差(如煤油)。斜率陡峭常说明毒物吸收快，出现毒作用快，并具有重要的特异性毒作用(如氰化物)。,结果判定,在实验设计时应有一定的要求。应把动物分成若干组，每组动物数量最好相等，分别给予不同剂量的试验毒物。两组间的组距应按几何级数依次增加，通常在1.31.5范围。例如第一组(最低组)剂量为0.2mg/kg，则第二组应为0.21.3=0.26mg/kg，第三组应为0.261.3=0.34mg/kg，余依次类推。,预实验方法,为了节省动物，应进行预试以了解该毒物的大致LD50范围。预试的方法很多。一般可先用9只动物，以三种不同剂量的毒物处理。剂量间距离可大些(例如10倍)。如低剂量组为1mg/kg，则第二组为10mg/kg，第三组为100mg/kg。如三组动物均无死亡，剂量可再向上增大，再用9只动物试验。如三组动物均死去，则应向下减少剂量再作试验。如第一组动物未死，第二、三组动物死去，即可假定大致剂量在110mg/kg之间。此后可用下面介绍的方法进一步试验，以获得精确的LD50。,半数致死量的实验方法,(1) 目测概率法： 简称目测法或概率单位法。本法是基于前述基本理论而建立起来的。它要求实验设计尽可能不出现死亡率0%及100%，因而其原始数据比较可靠。计算时首先列出在所试验剂量(浓度)下动物的死亡情况，分别计算其死亡率。再以浓度对数作横轴，死亡率的概率单位作纵轴，将各对数值点在方格纸上。然后顺着各点分布趋势，作一直线。最后从概率单位5.0处找出相应的剂量(浓度)，即为所求的LD50(LC50)。 此法比较方便适用，目测的直线可通过卡方测验以检验其是否合适。如果结果中理论频数与实际频数间有显著差异，说明所绘直线不当，应另作更适宜的直线，直至检验合适为止。这样求得的LD50是比较精确的。,(2) 加权直线回归法(Bliss法，又名机率单位法或加权回归法)：本法是在上述目测法的基础上用正态曲线原理进行加权后，计算直线回归方程以求得LD50。这是计算LD50的最精确的方法。但由于计算过程比较复杂，实际应用中常以此来鉴定和比较其他计算方法的正确性。,(3) 图解法： 此法是在概率图纸上，直接用实验数据作图，求出LD50，不需繁琐的计算过程。所用各种图表的数学原理比较严密，故所得结果也比较精确。本法与加权直线回归法同属于求LD50的两个经典方法。,(4) 简化寇氏法： 本法比较简便，为一般实验室中的常规方法。实验设计时除要符合前述总的要求外，药物反应0%和100%组也可用。但由于0%和100%的变动范围大，会引进误差，这是寇氏法的不正确的所在。本法首先计算出各组死亡率，再用公式logLD50=xm-i(p-0.5) 计算出LD50的对数值，经查反对数值后即得。为了避免不必要的误差，要求最大剂量组在100%80%间，最小组在20%0%之间，此时改用logLD50=xm-1/2i(pi+pi+1)公式。式中xm为最大剂量的对数，i为相邻剂量的比值的对数，p为各组死亡率总和，(pi+pi+1)为相邻两组死亡率之和。 另有改进寇氏法。,(5) 序贯法： 亦称上下法。是选择一系列按等比级数排列的数值，将动物一只一只序贯地进行实验。此法适用于快速反应试验，方法简便，节约动物。操作时先选择一个接近50%反应率的剂量，当动物出现阴性反应(不死)时，就用高一级剂量给予下一只动物; 反之，当出现阳性反应(死亡)时，就改用低一级剂量给予下一只动物。试验所需动物应在试验开始前就确定好。由于把剂量集中使用在50%反应率上下，故可节省实验动物。但此法不易求得误差，因此对两种不同处理方法所求的LD50值，无法进行显著性测验，无从比较。,计算LD50的方法很多。上面所介绍的五种方法中， 以加权直线回归法最为精确，但其计算过程复杂，且必须先进行目测法，故不作常规使用。 图解法中所用各种图表的数学原理较