植物组织培养的基本技术与设施.ppt

,第一节 植物组织培养的操作方法概述,一、外植体的选择 二、外植体的灭菌 三、外植体的接种和培养 四、外植体的成苗途径 五、污染的原因及其预防措施 六、外植体的褐变及其防止措施 七、培养物的玻璃化现象及其防止措施 八、试管苗的驯化与移栽,外植体（Explants）：指植物离体培养的各种接种材料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体。,一、 外植体的选择,外植体的选择依据 优良的种质 健壮的植株 大小适宜的外植体 适宜的发育时期 适宜的部位 适宜生理状态和发育年龄的器官 细胞培养材料的选择,（二） 外植体灭菌的一般步骤,二、外植体的灭菌,（一）常用灭菌剂的使用及其效果,（三）各种外植体的灭菌方法,（一）常用消毒剂,自:曹孜义,（二） 外植体灭菌的一般步骤,3. 将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活化剂Tween20或Tween 80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须把玻璃瓶摇动23次。 4消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，重复34次。,1预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌。 2将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。,1、茎尖、茎段及叶片等的消毒 消毒前要经自来水较长时间的冲洗。 消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗23次，然后用2%10%的次氯酸钠溶液浸泡1025min，若材料有茸毛最好在消毒液中加入几滴吐温-80，或者用0.10.2升汞浸泡消毒510分钟消毒后，用无菌水冲洗3次后方可接种。 2、果实及种子的消毒 用自来水冲洗1020分钟或更长，用纯酒精迅速漂洗一下。 果实用2%次氯酸钠溶液浸 10min后，用无菌水冲洗23次。 种子要先用10%次氯酸钠浸泡 2030min甚至几小时。对难以消毒的还可用0.l%升汞或1%2%溴水消毒5min。 胚或胚乳培养时，对种皮太硬的种子，可先去掉种皮，再用4%10%的次氯酸钠溶液浸泡810min，经无菌水冲洗后，即可取出接种。,（三）几种外植体的灭菌方法,70酒精擦洗花蕾，或浸泡数秒钟 饱和漂白粉上清液：浸泡10分钟；或次氯酸钠液25：810分钟 无菌水冲洗几次后，吸去水分，剥取花药或胚珠接种。,3、花药的消毒,预先用自来水洗涤，再用软毛刷刷洗，且用刀切去损伤及污染严重部位，吸水纸吸干后，再用酒精漂洗。 可采用0.1%0.2%升汞浸510min或2%次氯酸钠溶液浸1015min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干后可接种。,4、根及地下部器官的消毒,三、外植体的接种和培养,（一）无菌操作 （二）外植体的培养,植物组织培养的接种：把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培养基上的全部操作过程，是一种无菌技术。 在操作过程中引起的污染来源：主要是由材料本身带菌和工作人员本身引起的。,（一）无菌操作,污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子 每次接种前半小时 地面：用70酒精喷雾使空气的灰尘沉降。 紫外线灯照射20分钟。 工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗。,1、接种室的消毒,入无菌室前，要洗手。l%新洁尔灭溶液内5分钟 入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。 操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。 必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。,2、工作人员要求,切取和接种较大的材料肉眼观察即可操作分离，较小的材料需在双筒解剖镜下操作。 分离工具一定要放好，切割动作要快，防止挤压使材料损伤而失败。 接种时要防止交叉污染的发生,3、材料的切取,酒精擦拭手,外植体消毒,浸泡5min,器械消毒,酒精灯灼烧,4、 接种的具体操作,旋转灼烧,取外植体,接种,盖好瓶塞,1、培养条件： 温度：常保持在232，夜温低12 光照时数：大多数情况下为16h（暗培养不需要光照，例如起始培养的前几天不需要光照） 光照强度：10003000lx，白色荧光灯，光的作用是满足形态建成的需要（诱导） 相对湿度：培养室的相对湿度一般不控制。根据需要适当调整培养间湿度,（二）外植体培养,接种后37天内，主要是检查其污染情况。 增殖、继代培养，建立了无菌培养系。 细胞学观察：一般每隔35天观察一次。及时记录。 观察方法根据培养方式灵活掌握： 可用显微镜进行定点观察如平板培养 可用倒置显微镜观察如液体培养,2、定期检查和细胞学观察,1外植体先形成愈伤组织，再分化成完整 的植株。,四、外植体的成苗途径,2胚状体发生,3外植体经诱导后直接形成根与芽，发育成完整的植株,4原球茎型-图片,石斛兰的原球茎,外植体,愈伤组织,根、芽,芽,根,根,芽,胚状体,根、芽,试 管 苗,外植体的成苗途径,不定芽形成-多细胞参与,胚状体形成过程-单细胞参与,体细胞胚的发育过程,低CTK/IAA,外植体,愈伤组织,芽,根,脱分化,再分化,低CTK/IAA,根,完 整 植 株,生长调节物质控制器官分化的模式,芽,高CTK/IAA,低CTK/IAA,五、污染的原因及其预防措施,污染 概念：是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 原因： 细菌 菌斑呈黏液状物。 除材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染外，操作人员的不慎也是造成细菌污染的重要原因。因此接种人员的手应经常用 70酒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。 真菌 污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后310d才能发现， 造成真菌污染的原因多为周围环境的不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养瓶的口径过大、操作不慎等 途径： 外植体带菌； 培养基及器皿灭菌不彻底； 操作人员未遵守操作规程等。,防止材料带菌的措施 用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。 避免阴雨天在田间采取外植体。 对于材料内部污染的材料采取特殊方法。 外植体的灭菌 多次灭菌法 多种药液交替浸泡法 金属器械的灭菌 一般用火焰灭菌法，即把金属器械放在 95的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。 金属器械也可以用干热灭菌法灭菌，即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。 布质制品的灭菌: 工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的布质品，放入高压灭菌器中，在压力为108kPa，温度为121的情况下，灭菌2030min 无菌操作室的灭菌: 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2的新洁尔灭或 70的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使用前用70的酒精喷雾，使空间灰尘落下。 一年中要定期一二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。 操作人员,污染的预防措施,六、外植体的褐变及其防止措施,（一）褐变的原因 1.基因型 2.外植体的生理状态 3.培养基的成分 无机盐浓度；植物生长调节物质；外植体脱分化条件；转移时间过长。 （二）褐变的防止措施 1.选择适宜的外植体 2.最佳培养基 3.连续转移 4.加抗氧化剂 5.活性炭,七、培养物的玻璃化现象及其预防措施,（一）玻璃化现象 叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎； 叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织； 体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。,激素浓度 激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比例高)。 琼脂浓度 琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重。 温度：适宜的温度可以使试管苗生长良好。 光照时间 多数植物在1012h光照下都生长良好，大于15h时，玻璃化苗明显增加。 通风条件 愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。 愈伤组织和试管苗长时间培养，不能及时转移，容易出现玻璃化苗。 组织培养所用瓶盖棉塞、滤纸、封口纸、牛皮纸通气较好，玻璃化苗的比例较低。 离子水平 培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。,（二）产生玻璃化苗的因素,适当控制培养基中无机营养成分； 适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度； 适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度； 增加自然光照，控制光照时间； 控制好温度； 改善培养器皿的气体交换状况 在培养基中添加其他物质， 加入间苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化。 如添加马铃薯汁液法可降低油菜玻璃苗的产生频率； 0.5mgL多效唑或10mgL的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生； 1.52.5g/L的聚乙烯醇防治苹果砧木玻璃化 。 加入 0.3的活性炭还可降低玻璃苗的产生频率。,（三）预防措施,试管苗的特点 试管苗的驯化 试管苗的移栽 提高试管苗移栽成活率的途径,八、 试管苗的驯化与移栽,（一）、试管苗的特点,试管苗的生态环境 高温且恒温；高湿；弱光；无菌。 试管苗的特点 试管苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达； 试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光合作用较差； 试管苗的叶片气孔数目少，活性差； 试管苗根的吸收功能弱。,试管苗和普通苗的根解剖比较,蓝莓,（二）、试管苗的驯化,驯化的目的: 在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，促使试管苗健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。 驯化的原则： 应从温度、湿度、光照及有无菌态等环境要素进行，驯化开始数天内，应和培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的栽培条件相似，从而达到逐步适应的目的。 驯化的方法:炼苗 由培养室转移到半遮荫的自然光下锻炼，在自然光下恢复植物体内叶绿体的光合作用能力和健壮度 打开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向有菌，这样幼苗周围的环境就会逐步与自然环境相似。,试管苗的驯化,（三）、试管苗的移栽,常规移栽法 直接移栽法 嫁接移栽法 指选取生长良好的同一植物的实生苗或幼苗作砧木，用试管苗作接穗进行嫁接的方法。,（四）、提高试管苗移栽成活率的途径,试管苗的生理状况 植物生长调节物质 无机盐浓度 活性炭 环境因子 移栽过程中试管苗从无菌向有菌逐渐过渡,1进行植物组织培养需要哪些设备？各有何作用? 2植物组织培养主要包括哪些环节?各环节的主要工 作内容是什么? 3培养基包括哪些基本成分?其作用是什么?如何配制? 4如何对外植体、 培养基、培养器皿、接种器械进 行灭菌？ 5离体培养的植物材料对光、温、湿度有何要求？ 如何调控？ 6. 何谓玻璃化？何谓褐化？如何克服？,复 习 思 考 题,第二节 实验室的设计与设备,一、实验室设计,准备间、缓冲室、接种室、培养间 驯化室、温室,准备室,高 压 灭 菌 器,电子天平 （0.0001g， 0.01g）,酸度计,1.紫外线灭菌灯 2.日光灯