苯代谢物对溶血性贫血小鼠模型贫血恢复

单位代码 10006 学 号 10101003 1分类号 毕业设计(论文)苯代谢物对溶血性贫血小鼠模型贫血恢复的影响 学院名称生物与医学工程学院 专业名称生物工程 学生姓名杨 蕊 指导教师易宗春 2014年 5月 北京航空航天大学毕业设计（论文） 第 36 页 苯代谢物对溶血性贫血小鼠模型贫血恢复的影响 杨 蕊 北京航空航天大学北京航空航天大学本科生毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目：苯代谢物对溶血性贫血小鼠模型贫血恢复的影响 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求：苯是室内环境常见污染物，具有明显血液毒性，目前认为其在体内产生的代谢物是造成血液毒性的主要原因，目前对苯血液毒性机制研究多侧重于白细胞方面，而对红系方面的研究十分有限，课题组前期研究发现苯代谢物可以引起体外培养K562细胞红系分化的明显改变，因此从整体动物水平研究这些苯代谢物对红系细胞影响十分必要。本课题将建立的溶血性贫血小鼠模型，并利用此模型在其贫血恢复期给予苯代谢物，观察这些代谢物对贫血恢复的影响。 、毕业设计（论文）工作内容：（1）建立苯肼诱导的小鼠溶血性贫血模型，并观察恢复规律。 （2）观察贫血模型恢复期内给予苯代谢物后贫血恢复情况。 、主要参考资料：1 Lan Q, et al. Hematotoxicity in workers exposed to low levels of benzene. Science. 2004; 306(5702): 1774-6.2 Wu XR, et al. Phenolic metabolites of benzene inhibited the erythroid differentiation of K562 cells. Toxicol Lett. 2011; 203: 190-9.3 Badham HJ, Winn LM. In utero and in vitro effects of benzene and its metabolites on erythroid differentiation and the role of reactive oxygen species. Toxicol Appl Pharmacol. 2010; 244: 273-9.4 Li XF, et al. The role of DNA methylation in catechol-enhanced erythroid differentiation of K562 cells. Toxicol Appl Pharmacol. 2012; 265(1): 43-50。 生物与医学工程 学院 生物工程 专业类 101011 班学生 杨蕊 毕业设计（论文）时间： 年 月 日至 年 月 日答辩时间： 年 月 日 成 绩： 指导教师： 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）： 系（教研室） 主任（签字）： 注：任务书应该附在已完成的毕业设计（论文）的首页。本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。 作者：杨 蕊 签字： 时间：2014年 5 月苯代谢物对溶血性贫血小鼠模型贫血恢复的影响学 生：杨 蕊指导老师：易宗春摘 要目的 建立苯肼致小鼠溶血性贫血模型并观察氢醌能否延缓苯肼诱发的急性溶血性贫血的恢复。方法 雄性C57BL/6小鼠经腹腔注射40 mg/kg体重苯肼，于第012天内每2天鼠尾采血1次，检测外周血指标变化。在观察氢醌对溶血性贫血恢复的影响时，雄性C57BL/6小鼠第0天经腹腔注射苯肼40 mg/kg体重，第4天经腹腔注射50 mg/kg体重的氢醌，于第4天和第6天鼠尾采血进行检测。结果 苯肼注射后12天内，小鼠外周血RBC、HGB和Plt在第4天下降到最低水平，HCT在第2天下降到最低水平，MCV、MCH和RDW在第4天升高至最高水平，MCHC在第2天升高至最高水平，随后所有指标逐渐恢复至正常水平。单独注射氢醌不引起小鼠外周血相关指标明显变化；单纯苯肼注射组动物第6天的RBC、HGB和HCT相对于第4天出现明显的恢复性上升，而苯肼+氢醌组第6天的RBC、HGB和HCT明显低于苯肼组；苯肼组动物的MCHC和RDW在第4天显著高于对照组，第6天恢复性下降到对照水平，而苯肼+氢醌组第6天的MCHC和RDW明显高于苯肼组。结论 苯肼单次注射可诱发小鼠轻度的溶血性贫血，注射氢醌可抑制贫血的恢复，表明苯肼诱发急性溶血性贫血动物模型可用于评价外源化合物的红系造血毒性。关键词：溶血性贫血，动物模型，C57BL/6鼠，氢醌，苯肼Study of the Co-Culture of Endothelial Cells and Smooth Muscle CellsAuthor : Rui YANGTutor : YI Zong-chunAbstractObjective It was investigated how to build up an animal anemia model by injecting Phenylhydrazine for once and if hydroquinone can delay the recovery of phenylhydrazine-induced hemolytic anemia in mice. Methods Male C57BL/6 mice were given a single intraperitoneal dose of phenylhydrazine at 40 mg/kg body weight, and blood samples were collected from the tail vein every 2 days for determination. When the effect of hydroquinone on the recovery of phenylhydrazine-induced hemolytic anemia in mice was studied, male C57BL/6 mice were given a single intraperitoneal dose of phenylhydrazine at 40 mg/kg body weight at day 0, hydroquinone was intraperitoneally injected at 50 mg/kg body weight at day 4, and blood samples were collected from the tail vein at day 4 and day 6 for determination. Results After phenylhydrazine injection, red blood cell (RBC), hematoglobin(HGB) and platelet (Plt) decreased to the lowest levels at day 4, hematocrit (HCT) decreased to the lowest levels at day 2, mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin （MCH） and red cell distribution width (RDW) increased to the highest level at day 4, mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC) increased to the highest level at day 2, and then all these indexes recovered to normal levels at day 12. A single injection of hydroquinone did not result in any changes in all these blood indexes. In phenylhydrazine-treated mice, RBC, HGB, HCT, MCHC and RDW showed a significant recovery at day 6 compared with day 4. But in the mice co-treated with phenylhydrazine and hydroquinone, RBC, HGB and HCT were significantly lower than that in phenylhydrazine-treated mice at day 6, and MCHC and RDW were significantly higher than that in phenylhydrazine-treated mice at day 6. Conclusion A single intraperitoneal dose of phenylhydrazine induced moderate hemolytic anemia in mice, and hydroquinone delayed the recovery of phenylhydrazine-induced hemolytic anemia, suggesting that phenylhydrazine-induced hemolytic anemia could be used to evaluate the erythropoietic toxicity of xenobiotics.Key Words: Anemia, Hemolytic anemia, C57BL/6 mice, Hydroquinone, Phenylhydrazine目 录1 绪论11.1课题背景11.2国内外研究状况41.3课题研究目标92 苯肼诱导小鼠贫血模型的建立102.1基本原理102.2模型建立方法112.3模型评价132.4结论143 探索氢醌对小鼠贫血模型恢复影响163.1基本原理163.2模型建立方法163.3实验结果174 讨论19结论22致谢23参考文献24附录A C57BL/6小鼠简介28A.1来源28A.2主要特性29A.3血液生理生化参数29附录B 预实验方案探索32B.1小鼠品种的确定32B.2小鼠染色方案探讨与试验33B.3关于取血方案的探讨与实验33B.4关于药物保存方案的探讨与试验34 1 绪论1.1 课题背景随着人们对环境保护意识的逐渐增强，居室内的环境质量很大程度上得到了人们的普遍关注。室内环境污染物中，苯系物毒性巨大，来源最为广泛，已成为室内环境最标致污染物之一。一般认为苯的毒性产生是通过其代谢产物所致，苯进入体内后，在肝脏细胞色素转化酶P450作用下转化为氢醌、儿茶酚等代谢产物，这些代谢物被输送到骨髓，进行进一步的氧化代谢。骨髓是红细胞、白细胞和血小板的形成部位，苯进入体内可在造血组织处形成具有血液毒性的代谢产物。长期接触苯可引起骨髓与遗传损害，血象检查可发现白细胞、血小板减少，全血细胞减少与再生障碍性贫血，甚至发生白血病4,42。苯的挥发性大，暴露于空气中很容易扩散。在现如今的室内环境中，苯的浓度非常容易超标。其中，油漆、墙纸、地毯、室外汽车尾气进入室内、图文传真机、甚至合成纤维等都会导致室内苯的含量增加34。美国EPA（Environment Protection Agency）最新修订的关于苯的危害摘要中表明，空气中苯浓度仅达到为0.03mg/m3时，即可能对人体血液方面产生不良的影响。对于孕妇而言，苯暴露潜在的危险性可能更大。有动物实验发现，怀孕的Swiss Webster小鼠从妊娠第6天到底15天分别暴露在浓度为0，5ppm，10ppm或20ppm的苯肼中。在妊娠期的第16天，出生之后第2天和出生之后第6周，检测血红蛋白的产生量和外周血以及造血器官中的造血细胞数。发现从妊娠期的第16天开始，非苯暴露的小鼠相应指标显著变化。与此相反，暴露在所有不同浓度的苯环境中的两天的新生儿的循环红系前体细胞的数量都发生了降低17。而且，在上述所有浓度的苯肼暴露中，已分化的红系集落生成细胞CFU-E，粒细胞性集落生成细胞GM-CFU-C的数量都发生了显著改变18。另外，对于儿童而言，由于呼吸频率较高与代谢较旺盛，加上不成熟的造血系统等影响因素，往往相对于成年人而言对于苯的毒性更为敏感。比如说有调查研究发现，儿童患白血病的风险与儿童居住地的以苯肼为主要指标的交通污染情况相关。家庭在交通污染情况较严重地区的儿童，患白血病的风险相对家庭居住在交通污染情况较小的儿童而言较大7。而在现如今的室内环境与装修环境中，儿童不可避免的会皮肤接触或者呼吸接触到过量的苯。因此在这种情况下，对于苯体内代谢物的毒理学方面的研究显得非常必要。我国的室内苯浓度标准限值在考虑到致病风险和实际情况下规定为0.11mg/m3。王桂华等人对北京城区住宅室内苯的浓度做了一定的调查监测，结果表明只有较小比例的住宅区室内苯浓度低于国家标准限值，大部分住宅区室内苯浓度均超标。尤其是对于室内装修后1-2个月内的民用住宅，苯浓度超标异常严重36。苯主要通过呼吸道吸入、胃肠及皮肤吸收的方式进入人体。一部分苯可通过尿液排出，未排出的苯则首先在肝中细胞色素P450单加氧酶作用下被氧分子氧化为环氧苯（7-氧杂双环4.1.0庚-2,4-二烯）。环氧苯与它的重排产物氧杂环庚三烯存在平衡，是苯代谢过程中产生的有毒中间体。接下来有三种代谢途径：与谷胱甘肽结合生成苯巯基尿酸；继续代谢为苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、偏苯三酚、邻苯醌、对苯醌等，以葡萄糖苷酸或硫酸盐结合物形式排出；以及被氧化为已二烯二酸。一般来说苯代谢物的毒性主要表现为血液毒性，尤其是苯的酚类代谢物，如氢醌或者儿茶酚等，被认为具备一定的血液毒性。苯肼 氢醌 儿茶酚图1.1 苯以及氢醌儿茶酚的化学结构式但是在现阶段苯的毒性研究中，特别是存在于现在环境中的低浓度苯的持续作用，经过人体代谢产生苯代谢物，具备显著地慢性血液毒性作用。这种慢性血液毒性一般是由于长期暴露于含有较低含量的苯的环境中导致的。同时有研究表明，若要对于人呼吸或者血液中摄入的低浓度的苯进行检测，基本无法获得准确的检测数据。除非在苯暴露之后短时间被迅速进行检测，才有可能获得准确的检测39。但是这种检测显然是毫无意义的，因为我们绝大多数是不能意识到自己是否处于一个苯暴露的环境中的。因此综合上述内容可以发现，即使在很低浓度的情况下，苯仍具备显著的慢性血液毒性。而现在的居室环境，包括一些室外环境中，苯的含量是超标或者显著超标的。但是人体摄入这种相对较低浓度的苯之后，是无法通过检测手段获知自己是否处于一种不合格的苯暴露环境中的。因此对于苯的血液毒性机制，或者说苯进入人体之后被代谢为包括氢醌在内的相应苯代谢物的血液毒性的机制的探索显得异常重要。但现阶段这方面的研究在仍然是比较困难的课题，尤其是在动物实验方面。主要原因为试验周期往往长达数月甚至数年，加上实验动物的寿命限制以及长时间实验过程中可能会发生的各种不确定因素，包括实验动物自发性肿瘤等等因素的影响，导致苯代谢物体内的慢性血液毒性机制方面的研究还尚不彻底。现阶段此方面研究一般多以调查为主，如调查苯接触特定职业人员与相应无明显接触人员相应血液指标对比等20。因为现在环境中存在的苯一般处于较低浓度（仍高于标准值），短期接触只有较低的概率表现出明显症状。只有长期的暴露于苯的环境中才有可能发生血液指标的显著变化。因此调查类的研究，例如调查长期处于工作环境为低浓度苯暴露的特定职业工人的血液状况与长期处于非苯暴露工作环境下工人的血液情况进行对比的研究。但这些研究仅仅只是调查类研究，可用于发现长期低浓度的苯暴露是否会对人体产生不良影响。但对于理论层面上的检验，尤其是对于苯暴露的慢性血液毒性的机理或者实验性的探究仍有些不足。因此我们希望可以通过实验动物贫血模型的建立，通过药物苯肼的诱导，使实验动物发生溶血性贫血。在动物已经发生贫血的情况下，推测其对于具有血液毒性的苯及苯代谢物的敏感性升高。使动物对于低浓度的苯代谢物的作用表现出一个相对快速的反应，缩短苯代谢物慢性血液毒性研究所需的时间，使在较短时间内对于苯代谢物的动物体内慢性血液毒性的研究成为可能。1.2 国内外研究状况1.2.1 贫血模型方面Lan Q等在04年研究发现，苯在低于1ppm的浓度下仍能引起血液系统改变，因此苯暴露引起的健康损害不容忽视，研究其毒性机制仍是预防医学领域的重要课题20。最近几年，申请者所在课题组从DNA甲基化和组蛋白修饰角度对苯代谢物红系毒性的机制展开了初步研究。课题组当前的研究发现，在体外实验中，苯代谢物氢醌，对K562细胞红系分化有明显的抑制作用，可浓度和时间依赖性地抑制氯化高铁血红素（Hemin）诱导K562细胞的血红蛋白（Hb）合成41，见图1.2。在图1.2中，K562细胞经40M氢醌和40M儿茶酚处理72h后再经hemin诱导48h，然后染色计数Hb阳性细胞比例。可以发现，相对于对照组，在体外细胞实验中，氢醌可以抑制hemin对于K562细胞红系分化方面的促进作用。这是体外细胞层面上的探究，氢醌在体内对于红系方面的影响还有待研究，这也是本实验希望完成的一部分。图1.2 氢醌和儿茶酚对Hemin诱导K562血红蛋白合成的影响K562细胞是第一个被建立出的人类永生骨髓白血病细胞系，原始细胞是从一个患有慢性骨髓性白血病的53岁女性病人身上获得的24。K562细胞正常状态下呈现非粘着的球形状态，属于悬浮细胞。在氯化高铁红素（Hemin）或者一些其他诱导剂的作用下，K562细胞可以合成血红蛋白。一般将这个过程成为K562细胞的红系分化。而在课题组前期的研究中，发现氢醌对于氯化高铁红素（Hemin）对于K562细胞红系分化的诱导作用具有一定的抑制性。与我们的研究发现一致，加拿大学者研究也发现，鸡HD3细胞暴露于氢醌后，Hemin诱导的Hb合成受到明显抑制1。对于氢醌对于K562细胞的作用方面的研究和文献查阅可以发现，氢醌对于K562细胞的红系分化具有一定的负相关的作用。那么在体内氢醌对于血细胞的作用的结果是否与体外实验相一致？这也是选择氢醌作为苯代谢物的代表进行其体内血液毒性研究的原因之一。另外一个原因正如前文中所述，是苯代谢物产生的慢性血液毒性显现出来所需的时间过长所致。现在已经有很多研究人员做过一些针对苯的慢性毒性方面的研究。但是在许多研究中，对于苯代谢物慢性血液毒性的研究周期都长达数月至数年，研究周期过长，造成研究困难。而且多数研究以调查为主，通过动物实验检测慢性毒性的探究较少并且漫长而艰难。在许多研究中，都有过构建实验动物贫血模型的尝试。如Criswell等人利用苯肼诱导wistar大鼠产生溶血性贫血。将40天的雄性Wistar大鼠进行连续三天腹腔注射50mg/kg的苯肼。然后对大鼠的血液指标进行检测，以红细胞数、血红蛋白浓度和红细胞压积为红系检测指标，发现大鼠的贫血在第三天达到最严重。随后进入一个快速恢复的过程，在第14天左右基本恢复至正常。然后进入一个较为缓慢的恢复期，在第28天检测发现各项红系指标均有小幅升高，基本恢复至初始水平6。在Lee SH等人的研究中，利用苯肼诱导雌性SD大鼠发生溶血性贫血。雌性鼠比雄性鼠更容易发生贫血，在一般情况下，雌性鼠发生贫血的几率是雄性鼠的二倍27对照组有8只SD鼠，苯肼注射组为8只SD鼠，每日腹腔注射剂量为40mg/kg（苯肼质量与动物体重之比）的苯肼，连续注射两日。然后检测大鼠注射苯肼之后每日体重增加量和每日进食量的变化程度，获得如表1.1中所示数据22。表1.1 SD大鼠注射苯肼之后体重增长和食物摄取变化(g/d，改编自22)对照组苯肼注射组体重增长5.420.253.611.24食物摄取17.010.9214.430.89注：数据表示每组8只大鼠的均值SD值，p0.05。观察表1.1中数据可以发现，苯肼注射之后，苯肼注射组的SD大鼠日均体重增长值和食物摄取量均发生较显著下降。从一定角度阐述了大鼠发生贫血之后的相应外在可观察量的改变。图1.3 苯肼诱导的SD大鼠相应血液指标的变化（引自22）而苯肼诱导的SD大鼠相应红系血液指标的变化情况，包括红细胞浓度、血红蛋白浓度和红细胞压积的变化情况，Lee SH等人都进行了统计作图，在图1.3中进行表示。在图1.3的A、B、C三组图中，数据均为每组8只SD大鼠相应指标的均值SD值，字母a，b表示在p0.05的情况下Turkey多重检测的显著性差异情况。Control表示未注射苯肼组，PHZ-control表示仅注射苯肼组。其余组数是Lee SH等人研究一种提取物的发酵对于苯肼致SD大鼠溶血的的恢复程度的影响，与本实验无直接关系，可以不做探究22。观察图1.322可以发现，在第2天时，相对于对照组，苯肼注射组SD大鼠的三个红系指标：红细胞浓度、血红蛋白浓度和红细胞压积均发生了显著降低。在第15天时，相对于对照组，红细胞浓度和红细胞压积已经恢复至一定水平，仅稍低于对照组，血红蛋白浓度基本已经恢复正常。表1.2 SD大鼠注射苯肼之后相应血液指标变化情况（改编自22）血液指标天数对照组苯肼注射组WBC（103/L）24.920.8912.722.04155.801.964.200.72MCV（fL）283.175.4581.624.771582.182.0997.075.32MCH（pg）222.061.0528.191.821521.850.5927.700.52MCHC（g/dL）226.521.0634.541.421526.580.4628.511.11Reticulocyte count（%）24.820.9224.512.02154.650.136.870.95注：数据表示每组8只大鼠的均值SD值，p0.05。检测苯肼注射之后SD大鼠相应血液指标的变化如表1.2中所示22。可以发现苯肼诱导的SD大鼠溶血性贫血可以致使其MCV、MCH、MCHC和网织红细胞水平发生一定的增加。可以发现，相对于苯肼的其他形式诱导物（盐酸苯肼、乙酰苯肼等）对于实验动物贫血的诱导情况的研究，仅苯肼诱导的实验动物贫血模型的都没有形成一套完整的诱导方法。因此，本实验希望能够准确化、详细化苯肼诱导的溶血性贫血模型的建立过程，实现单次苯肼注射诱导小鼠发生溶血性贫血，建立溶血性贫血模型。简化模型建立难度，明确模型建立方案，为后续的研究提供更多的基础。另一方面，现在虽然有诸多不同的实验动物贫血模型的建立方法，但现有的研究中对于实验动物贫血模型的恢复过程的方面的探索较少，基本没有这方面的实验数据。因此，本实验拟通过建立诱导实验动物贫血模型37，在其恢复期内进行特定浓度的苯代谢物作用，通过其对于贫血恢复过程的影响，进行相应的毒理学分析。在前人的研究和本课题组体外试验的基础上41，本实验主要希望通过以C57BL/6鼠为实验动物，建立实验动物贫血模型。再利用此模型，检测苯代谢物例如氢醌的慢性血液毒性。考虑到在贫血恢复期内小鼠对于苯代谢物较正常情况下更加敏感，希望由此可以得到一个敏感模型，用反向思维的方式验证苯代物的体内血液毒性。同时希望通过实验动物贫血模型的建立，缩短一般研究中对于苯代物慢性毒性的研究时所需的较长时间，为后续的研究提供一种新的方法和手段。1.3 课题研究目标（1）完善通过药物苯肼诱导形成C57BL/6小鼠溶血性贫血模型的方法，详细化和准确化诱导方案，为后续的研究做好基础准备。（2）希望可以利用苯肼诱导的C57BL/6小鼠溶血性贫血模型，提高实验动物对苯代谢物作用的敏感性和缩短反应时间，为后续的研究提供一种新的技术和手段。（3）初步观察单次注射氢醌是否能有效延缓苯肼诱发的急性溶血性贫血的恢复，初步探讨苯肼诱发的急性溶血性贫血动物模型可否用于外源化合物的（红系）造血功能损害的评价（4）应用苯肼诱导的C57BL/6小鼠溶血性贫血模型，明确苯代谢物在体内的作用效果。为后续利用此模型进行更多的实验做好基础。2 苯肼诱导小鼠贫血模型的建立2.1 基本原理有研究表明，一定浓度的苯肼处理可以急剧的降低红细胞膜的流动性，同时降低红细胞中血影蛋白（Spectrin）的含量。血影蛋白是一种细胞结构蛋白，大多位于红血球细胞膜内侧，是红血球骨架的主要成分。血影蛋白在整个细胞膜内侧形成可变形的架构，以维持红血球的双凹圆盘构造。它是一种长且具有伸缩性的纤维状蛋白。有研究发现，用浓度为0.2-0.4mg/ml的苯肼处理后，发现细胞膜中血影蛋白的含量下降了35-40%，同时伴随有高分子量蛋白浓度的增加26。图2.1 苯肼结构式苯肼作为氧化损伤性溶血剂，可以与循环血中的成熟红细胞中的血红蛋白发生反应，产生活性氧，导致高铁血红蛋白的产生，并形成Heinz小体附着在红细胞膜上，影响红细胞可塑性，促进红细胞的破坏，进而引起急性溶血性贫血19,21。有研究发现，苯肼与高铁血红蛋白反应，可以产生大量的O2-。在红细胞中，关于还原方面有三种酶起到调节作用。分别是过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）。在正常情况下，虽然血液中存在一定的O2-，过氧化脂质或者过氧化氢等氧化性物质，这三种还原酶可以催化发生还原反应，达到保护红细胞的目的。但当苯肼与高铁血红高蛋白反应产生大量的O2-时，过多的氧化性O2-的产生已经远远超过了这三种还原性酶的调节范围，进而氧化破坏红细胞3。包括血红蛋白、多种酶和膜蛋白上的巯基都会被氧化，血红蛋白被氧化之后会形成高铁血红蛋白或者Heinz小体，如前文所诉。被氧化的血红蛋白会通过自身巯基与细胞膜上的巯基发生脱氢成键，或者与红细胞膜之间形成氨基亚胺丙烯交联作用，或者仅通过疏水作用而非形成共价键与细胞膜相互结合。通过这种结合降低细胞膜的流动性，增加其渗透脆性，进而导致氧化性溶血的产生。另一方面，苯肼可以抑制红细胞膜上的Ca2+依赖性ATP酶的活性。这样会导致红细胞中Ca2+浓度的急速增加，致使红细胞中Ca2+环境发生紊乱3。这也是苯肼导致溶血性贫血发生的原因之一。因为苯肼主要是破坏循环血中的成熟红细胞，并不会破坏骨髓中的造血干细胞，所以苯肼在成的溶血性贫血是可以恢复的。这也是选择苯肼这种药物作为构建溶血性贫血模型的原因之一。苯肼引起的急性溶血性贫血会刺激造血器官的红系造血功能，以使外周血红细胞恢复到正常的水平12,6,21。如果因各种原因如接触造血抑制剂造成造血功能抑制，苯肼诱发的急性溶血性贫血的恢复会延缓。因此，以具有基础性急性溶血性贫血的动物为模型通过检测外周血指标就可能检测受试物的造血毒性。2.2 模型建立方法苯肼可作用于机体红细胞，使多种动物发生溶血。通过文献调研11,19,22,25,29,37和预实验结果，明确诱导C57BL/6小鼠溶血性贫血模型的建立的最佳诱导条件为：以为0.6 mg/10g的剂量腹腔注射苯肼，可有效诱溶血性贫血，从而刺激骨髓等红系造血已恢复外周血红细胞水平，在苯肼注射后约经过大约7天外周血红细胞水平恢复正常。因此本实验准备采取此剂量进行贫血模型建立的探索。2.2.1材料8-9周龄健康SPF级小鼠C57BL/6小鼠，雄性，购买自北京大学医学部试验动物中心；氢醌购自Sigma公司；分析纯苯肼购自国药集团化学试剂有限公司；ABX-MICROS-60型全自动血细胞分析仪产自法国ABX公司。2.2.2实验步骤将16只雄性C57BL/6小鼠随机分为2组，即溶剂对照组和苯肼组（溶血性贫血组），每组8只。苯肼组每只小鼠经腹腔注射苯肼40mg/kg体重的新鲜配置苯肼溶液（无菌PBS配置，pH 7.4）（作为第0天）；溶剂对照组腹腔注射等体积的PBS。于第0（给药当天但在给药前采血）、2、4、6、8、10和12天经鼠尾采集血样进行检测。2.2.3实验操作方案苯肼稀释方案：根据预实验，获得诱导8-9周龄雄性C57BL/6小鼠的剂量约为40-50mg/kg。小鼠平均体重约为20g左右，那么每只小鼠注射苯肼的剂量约为0.8-1.0mg。苯肼密度为1.098g/cm3，即每只小鼠注射苯肼剂量约为1l。因此本实验中将10l苯肼溶于10ml的PBS溶液中，稀释1000倍，配置成为稀释液。每只小鼠注射约1ml左右的稀释液即可完成苯肼所需的注射剂量，可以实现注射剂量与小鼠体型相匹配。尾尖取血方法：一般当所需血量很少时采用本法。固定动物并留出鼠尾，将鼠尾在45温水中浸泡数分钟，使局新血管扩张。将鼠尾擦干，剪去尾尖，血自尾尖流出，让血液滴入盛器或直接用移液器吸取。因本实验需间隔一定时间，多次采取鼠尾尖部血液。每次采血时，将鼠尾剪去很小一段，取血后，用沾有碘伏的棉球进行压迫止血，防止伤口感染同时保护伤口。2.2.4血液样品检测将采集的鼠尾血10l 加入到2 ml稀释液内混匀，利用全血分析仪检测外周血红细胞数量（RBC）、血红蛋白含量（HGB）、红细胞压积（HCT）、红细胞平均体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度（RDW）、白细胞数量（WBC）、血小板数量（Plt）等血液指标变化。2.2.5数据处理和统计学方法苯肼诱发小鼠溶血性贫血模型时检测的各项指标，以溶剂对照为参照计算出苯肼组的相对水平，以RBC数量为例的计算方法为：红细胞数量相对水平（%）=100苯肼组红细胞数量/对照组红细胞数量。应用学生t检验比较两组间的差异显著性，实验数据以均值标准差表示，p0. 05被认为差异具有统计学意义。2.3 模型评价2.3.1苯肼注射后小鼠皮肤颜色和精神状态的变化给药前动物活泼好动，脚爪、口唇等部位皮肤颜色红润，而给药后前几天逐渐变得精神萎靡，皮肤颜色变得苍白，表现出明显的贫血体征，后几天又逐渐恢复正常。2.3.2 苯肼注射后小鼠外周血红系指标的变化苯肼注射后12天内，小鼠外周血RBC数量、HGB和HCT等红系指标先明显下降，随后逐渐恢复至正常水平，其中RBC和HGB在第4天达到最低，分别只有对照的62.6%和80.8%，HCT在第2天达到最低，只有对照的67.0%；而外周血MCV、MCH、MCHC和RDW等红系指标先明显升高，随后逐渐下降并恢复到正常水平，其中MCV、MCH和RDW在第4天达到最高，分别是对照的124.7%、129.1%和249.2%，MCHC在第2天达到最高，为对照的123.4%。2.3.3苯肼注射后小鼠外周血非红系指标的变化苯肼注射后12天内，小鼠外周血WBC数量没有统计学意义的显著变化，虽然在第4天只有对照的81.5%；但Plt数量在第4天下降到最低，只有对照的49.2%，随后逐渐回升至正常水平。图2.2 苯肼腹腔注射后小鼠外周血指标的变化（n=8）2.4 结论通过上述数据，可以看出，本实验中所用的剂量40mg/kg和一次注射确实可以一定程度上诱导小鼠发生溶血性贫血。相应的红系指标，包括红细胞数、血红蛋白浓度、红细胞压积等均发生了较为一致的下降，随后又表现出了较为一致的恢复水平。表明本实验中设定的苯肼致小鼠溶血性贫血模型的建立方案可以诱导C57BL/6小鼠形成溶血性贫血。以红系指标红细胞和血红蛋白为评价指标，可以基本判断苯肼所致小鼠溶血最严重期为苯肼注射后第四天。随后缓慢恢复，约7天左右恢复至正常水平。小鼠的各项血液指标变化均较显著，但均可以在7天内基本恢复至初始状态。这位此模型可以用作药物血液毒性贫血模型的使用提供了良好的基础。这也是此模型作为药物血液毒理学检测模型的一大优势。因此可以基本判定由药物苯肼诱导产生的C57BL/6小鼠的溶血性贫血模型构建成功。3 探索氢醌对小鼠贫血模型恢复影响3.1 基本原理氢醌具有骨髓毒性，会引起造血抑制，但单次接触很难观察到外周血的变化10。氢醌进入人体之后，部分氢醌可以富集在骨髓组织，进一步被人体代谢生成对本半醌和对苯醌15，对人体产生一系列毒害反应。有实验研究发现用含有5%的氢醌喂养大鼠9周之后，大鼠体重明显减轻，发生再生性贫血障碍，出现骨髓衰竭，肝萎缩，消化道粘膜溃疡和出血等表现。可以发现氢醌具备一定的亚急性血液和骨髓毒性40。最近有研究发现，氢醌合一通过影响前转录和转录后某些机制进而实现影响脂多糖诱导细胞因子分泌和中性粒细胞产生一氧化氮9,13。Shimada等人的研究中，将小鼠置于低浓度苯二酚吸入环境中，发现低浓度氢醌可以削弱循环系统中的单核细胞向发炎部位的迁移。氢醌对于肺细胞中的产物单核趋化蛋白1（MCP-1）的直接抑制作用与对于单核细胞趋化性的损伤直接相关9,31。同样，氢醌也具有一定的慢性毒性和潜在毒性。一般情况下较低浓度和氢醌的长期作用会对机体造成慢性毒性和具有一定的潜在致癌性。因为氢醌为苯体内代谢物中的主要产物之一，而苯属于现今非常普遍的室内污染物，人们不可避免的具有很大的几率去接触到。因此对氢醌的慢性血液毒性方面的探究具备非常重要的研究意义。3.2 模型建立方法苯肼可作用于机体红细胞，使多种动物发生溶血。有研究表明11,19,22,25,29,37，诱导C57BL/6小鼠溶血性贫血模型的建立的最佳诱导条件为：以为0.6 mg/10g的剂量腹腔注射苯肼，可有效诱溶血性贫血，从而刺激骨髓等红系造血已恢复外周血红细胞水平，在苯肼注射后约经过大约7天外周血红细胞水平恢复正常。因此本实验准备采取此剂量进行贫血模型建立的探索。氢醌稀释方案：根据氢醌注射预实验，获得诱导8-9周龄雄性C57BL/6小鼠的剂量约为50mg/kg左右。小鼠平均体重约为20g左右，那么每只小鼠注射苯肼的剂量约为1.0mg左右。氢醌密度为1.329g/cm3，即每只小鼠注射苯肼剂量约为0.75l。因此本实验中将10l苯肼溶于10ml-15ml左右的PBS溶液中，稀释1000-1500倍，配置成为稀释液。每只小鼠注射约1ml左右的稀释液即可完成氢醌所需的注射剂量，可以实现注射剂量与小鼠体型相匹配。3.2.1材料89周龄健康SPF级小鼠C57BL/6小鼠，雄性，购买自北京大学医学部试验动物中心；氢醌购自Sigma公司；分析纯苯肼购自国药集团化学试剂有限公司；ABX-MICROS-60型全自动血细胞分析仪产自法国ABX公司。3.2.2实验具体方案将32只雄性C57BL/6小鼠随机分为4组，即对照组、氢醌组、苯肼组和苯肼+氢醌组，每组8只。苯肼组每只小鼠第0天经腹腔注射苯肼40 mg/kg体重的苯肼溶液，第4天经腹腔注射相应体积的PBS；苯肼+氢醌组每只小鼠第0天经腹腔注射苯肼40 mg/kg体重的苯肼溶液，第4天（贫血最严重的时期）经腹腔注射50 mg/kg体重的氢醌（无菌PBS新鲜配置，pH 7.4）；氢醌组每只小鼠第0天经腹腔注射相应体积的PBS，第4天经腹腔注射50 mg/kg体重的氢醌；溶剂对照组每只小鼠第0天和第4天腹腔注射相应体积的PBS。于第4天和第6天经鼠尾采集血样进行检测。3.2.3血液样品检测同建模血样检测方案。3.2.4数据处理和统计学方法同建模数据处理和统计学方法。3.3 实验结果如表3.1中所示，苯肼注射后第4天，小鼠外周血红系指标的一般达到最大程度的变化然后开始逐渐恢复正常，第6天就已经有很大程度的恢复，因此为观察氢醌是否对溶血后的恢复产生影响，在注射苯肼后第4天注射氢醌，然后分析第6天外周血相关指标的变化。与溶剂对照相比，单独注射氢醌小鼠外周血相关指标没有明显变化。苯肼组动物的RBC、HGB和HCT从第4天的5.311012/L、117 g/L和0.39分别恢复上升到第6天的6.401012/L、131 g/L和0.47，而苯肼+氢醌组第6天的RBC、HGB和HCT分别只有4.861012/L、99 g/L和0.33，明显低于苯肼组；苯肼组动物的MCV、MCH、MCHC和RDW在第4天显著高于对照组，分别达到73.7 fL、22.1 pg、299 g/L和40.0 %，第6天MCHC和RDW恢复性下降到对照水平，而苯肼+氢醌组第6天的MCHC和RDW明显高于苯肼组，但是苯肼组和苯肼+氢醌组第6天的MCV和MCH仍然维持高的水平。苯肼注射对WBC没有明显影响，苯肼+氢醌组第6天的WBC也没有明显改变；但第4天苯肼组的Plt从对照的1299109/L显著下降到670109/L，第6天有所恢复，但仍维持较低水平，而苯肼+氢醌组第6天的Plt与对照组没有明显差异。表3.1 苯肼腹腔注射后第4天注射氢醌后小鼠外周血指标的变化（n=8）对照组氢醌组（第6天） 苯肼组 第4天 第6天苯肼+氢醌组（第6天）RBC（1012/L）8.500.348.330.575.310.576.400.494.861.25*HGB（g/L）1455146111171213179926*HCT0.500.020.490.050.390.030.470.030.330.08*MCV（fL）59.22.560.83.273.73.773.52.767.94.6*MCH（pg）17.10.616.90.522.10.920.40.820.30.4MCHC（g/L）289428710299122781130018*RDW（%）16.10.916.02.140.02.016.61.329.62.6*WBC（109/L）16.35.016.14.413.33.316.21.516.31.6Plt（109/L）129939011893276703198233011138358注：以苯肼注射当天为第0天，氢醌在第4天注射，检测第6天外周血指标。与苯肼组第6天相比，*表示p0.05，*表示p0.01。4 讨论利用苯肼诱导溶血性贫血，建立溶血性贫血动物模型，已有的不同报道在所使用的苯肼的化学结构形式、注射剂量、次数和持续时间，以及所用动物种属等方面不尽相同，因而获得的贫血效果以及此后的恢复过程也出现一定的差异。有报道显示，雌性SD大鼠腹腔注射苯肼（40 mg/kg/次, 即0.37 mmol/kg/次，间隔24h注射2次，累计0.74 mmo