新技术在毒理学中应用.doc

题 目： 新技术在毒理学中的应用姓 名 戴黛 所在学院 茶与食品科技学院 专业班级 食品质量与安全（3）班 学 号 08118065 指导教师 汪雪雁 日 期 2010 年 06 月 23 日新技术在毒理学中的应用08级食品质量与安全（3）班 戴黛 08118065摘要：近20年来，毒理学领域发生前所未有的巨大进展，而这些进展的取得，在很大程度上得益于科学新思想的渗透和新技术的应用。特别是细胞生物学和分子生物学理论和技术的飞速发展，给毒理学研究提供了新的思维和研究工具，改变了毒理学研究的基本格局，使毒理学研究从经典的整体器官水平向细胞和分子水平飞跃。纵观近年来毒理学的发展历程，一些常用的分子生物学技术，如PCR技术、核酸杂交技术、DNA测序技术以及一系列突变检测技术已广泛应用于外源化合物和环境致癌物引起的DNA损伤、基因突变、加合物形成及癌基因和抑癌基因研究等方面。特别是近年来基因差异分析技术、转基因技术、基因芯片技术等分子生物学新技术的建立和引入，大大提高了毒理学研究的整体水平。关键字：毒理学 细胞生物学 分子生物学正文：“民以食为天”，饮食是人类社会生存发展的第一需要。食品的安全性是一个听起来生疏却与我们的生活息息相关的一个概念。现在，人们已经把食品的安全性作为食用的重要原则和取舍标准。可是，近年来，因为食品污染造成的急性食物中毒事件越来越多，随着食品的数量和种类日益丰富，如何提高食品的质量和安全性已经成为了社会公众普遍关注的问题。毒理学就是研究外源化合物对生命机体损伤作用及机制的一门科学。食品毒理学是研究食品中外源化学物的性质、来源与形成以及它们的不良作用与可能的有益作用和机制，并确定这些物质的安全限量和评定食品安全性的一门科学。所谓外源化学物外源化合物是指存在于人类生活的外界环境中，可能与机体接触并进入机体，在体内呈现一定生物学作用的化学物质。主要有人类在食品生产、加工中使用的物质和食物本身生长中存在的物质，就是某些外源化学物进入人类机体从而产生了对中毒现象。现代科技发展日新月异，新技术在毒理学方面的应用主要体现在分子生物学和细胞生物学上。细胞是构成生物体形态结构和生命活动的基本结构单位，外环境中的多种有害因子，包括物理因子（电离辐射、噪声、紫外线等）、化学因子和生物因子（细菌微生物、病毒）等，通过不同途径（如人的消化道、呼吸道及皮肤伤口等）作用于机体，引起机体的器官组织结构和功能的改变，而这些改变都是要通过细胞结构与功能的变化反映出来的。通过检测靶细胞形态、结构和功能的改变就可以了解有害因子的毒性机制和毒作用效应。因此，细胞生物学方面的毒理学研究主要是用细胞进行毒理学研究，应用体外培养模型对环境有害因子进行检测，评价其对人体可能产生的危害。而分子生物学水平上毒理学则是在毒理学发展过程中，受到分子生物学理论和技术促进而发展起来的，从分子水平上研究外源化学物外源化合物与生物机体相互作用的一门学科。它要不仅探讨众多的外源化学物外源化合物对生物机体组织中的各种分子，特别是生物大分子的作用机制，从而阐明外源化学物外源化合物的分子结构与其毒效应的相互关系，还要从分子水平上表述生物体对外源化合物的效应。下面主要列举细胞生物学和分子生物学水平上的六大类新技术在毒理学方面的应用。一、PCR-SSCP 技术PCR技术称聚合酶链反应技术，又称无细胞克隆技术，是一种对特定的DNA 片段在体外进行快速扩增的新方法。其主要过程由变性、退火和延伸三个步骤反复的循环组成。在高温下，待扩增的DNA 双链受热变性，成为两条单链DNA 模板；而后在较低温度条件下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA 模板结合，形成部分双链；再在高温条件下，通过DNA 聚合酶作用，以引物3/端为合成起点，单核苷酸为原料，沿模板以5/3/方向延伸，合成DNA 新链。这样，每一双链的DNA模板经过一次解链、退火和延伸三个步骤的热循环后就形成两条双链DNA分子PCR-SSCP 分析的主要优点是简易且敏感性较高。但该技术不能确定基因变异的类型和部位。其检测敏感性随PCR 产物长度的增加而降低。二、SCGE 技术真核细胞的DNA 相对分子质量很高且具有严密的超螺旋结构。在理想条件下，正常对照组细胞DNA 在电泳之后保持在原来位置。当细胞DNA 受损伤产生链断裂时，DNA 的超螺旋结构受到破坏；在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA 及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中，而核DNA 相对分子质量很高不能进入凝胶，只能留在原位。在碱处理和碱性电泳液的作用下DNA 解螺旋，使DNA 的断链和碱易变性DNA片断从严密的超螺旋结构中释放出来；由于这些DNA 断链相对分子质量较小且碱变性为单链，所以在电泳电场中就可以离开核DNA 向阳极移动，形成彗星状图像，用荧光染料染色就可观察至彗星状细胞核，拖尾的长度体现了DNA 损伤程度。DNA 受损伤越严重，产生的断链和碱易变性片断就越多，断链也越小，在相同电泳条件下迁移的DNA 量就越多，迁移的距离就越长SCEG技术主要的应用有DNA 的损伤与修复、DNA-蛋白交联、遗传毒性评价。三、基因差异分析技术研究基因差异表达主要技术有消减文库筛选、差异杂交、mRNA 差异显示、代表性差异分析、基因表达系列分析和电子消减等技术。其中mRNA 差异显示和代表性差异表达分析是基于PCR 技术，很灵敏的检测差异表达基因的方法。1992 年，Liang 等根据高等生物成熟的mRNA 带有polyA 的特性，用特异的锚定引物反转录后，进行扩增，建立了mRNA 差异显示技术，成为一种筛选和克隆新基因的方法。mRNA DD 如同蛋白质双向电泳，都是研究基因的表达产物，但mRNA DD 对基因表达的微量产物可以扩增放大，这是蛋白质双向电泳无法比拟的。mRNA DD 在分离、筛选和鉴定差异表达的基因方面具有广泛的应用前景，已应用于农业、植物、动物、医学等各个领域，对生命过程中细胞发育和分化、细胞周期调节、细胞衰老和死亡及细胞在病理条件下的变化的调节机制的探索极有意义。四、荧光原位杂交技术荧光原位杂交是指通过荧光标记的各类DNA 和RNA 探针与细胞或组织进行杂交，在不改变其结构和分布格局的情况下，进行细胞内DNA、RNA 某特定序列的测定的一种方法。具有操作、观察分析简便、立体分辨率高、信号明亮清晰以及安全风险小的优越性。利用不同荧光物质所修饰的核苷酸标记不同探针，可在同一样品中同时识别和分析多个目标顺序，大大拓宽了FISH 的应用范围。通过以不同荧光物质标记同一探针，可增加镜下所观察到的荧光信号种类，从而增加了每次杂交可引用的探针类型。荧光原位杂交技术在毒理学研究中可应用于检测中期或间期细胞染色体畸变、哺乳动物精子非整倍体检测及微核来源的鉴定等随着特异染色体探针的制备及商品化的供应，荧光原位杂交技术用于间期细胞染色体非整倍体异常的检测独具优势，同时使用不同标记的多个探针，可一次检测靶细胞的多个染色体。五、基因芯片技术基因芯片的概念来源于计算机芯片。利用大规模集成电路的手段控制固相合成成千上万个靶基因或寡核苷酸探针，并把它们有序地、高密度地排列在玻璃或硅片等不同载体上。一块基因芯片相当于一个集成处理器，其中的每个探针相当于一个探头，能对相关的大量信息实现同时、自动和快速的采集传输、分析和处理，给出相应的检测、诊断结果。它将生物学中许多不连续的分析过程，移植到固相的介质芯片上，并使其连续化和微型化。基因芯片的检测是基于芯片上的探针与样品中的靶基因片段之间发生的特异性核酸杂交。基因芯片中所用的探针为核酸分子探针，是指特定的已知序列的核酸片段，与互补核酸序列发生杂交。可以利用探针检测样品中特定基因的特征片段或测定未知基因的序列基因芯片技术可以用于毒物的筛选及毒作用机制的研究、确定单独的或混合的毒性物质的遗传毒性，并测定低剂量下的毒性影响。根据基因芯片测定的基因表达谱图对接触到不同类型毒性物质的基因表达信号进行分析和比较。基因芯片可以评价模型系统、通过体内和体外实验去比较基因表达的变化，用已知毒性物质处理，毒性物质导致的信号响应将改变基因芯片上基因表达的信号，这些信号代表组织或分子对毒性物质的响应。利用基因芯片可比较正常组织及病变组织中大量相关基因表达的变化，发现疾病相关基因作为毒物筛选的靶标六、转基因动物试验转基因动物通过转基因技术，将改建后的目的基因或基因组片段导入实验动物的受精卵，使其与受精卵DNA 发生整合。然后将此受精卵转移到雌性受体的输卵管或子宫中，使其顺利完成胚胎的发育。因此，后代的体细胞和性细胞的基因组内携带有目的基因，并能表达而呈现其生物效应。转基因动物集整体、细胞和分子水平于一体，更能体现整体研究的效果。转基因动物的基因组中含有外来遗传物质，通过转基因动物模型表达人类基因，可以鉴定和评估非基因毒性化学药品。七、流式细胞术流式细胞术是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。现代流式细胞术，结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用。流式细胞仪是把根据目的细胞特有的表面标志标记后的悬液中单细胞依次通过测量区，当每个细胞通过测量区时产生电信号，这些信号可以代表荧光、散射光、光吸收或细胞的光阻抗，于是细胞的一系列重要的物理特性和化学特性就被快速地、大量地测定。再根据所规定的参数把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来。流式细胞术可以研究一个细胞从新生到死亡，从细胞膜到胞浆和核内物质及染色体，还可以探讨不同物质之间的关系。其在毒理学中的应用有以下方面：淋巴细胞分型及鉴定、T细胞活化信息传递研究、DNA含量与细胞周期分析、细胞凋