变性聚丙烯酰胺凝胶制备体会.doc

变性聚丙烯酰胺凝胶制备体会【关键词】 变性聚丙烯酰胺凝胶；垂直电泳分离；制备体会 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用技术之一，凝胶的灌制比水平电泳槽凝胶灌制困难，漏胶和产生气泡常在所难免，需经过反复实践才能掌握其灌制技巧。我们在用mRNA差异显示技术筛选成人难治性肾病与激素敏感性肾病综合征患者间差异基因的实验中，运用变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离PCR产物条带，硝酸银染色显示条带进而筛选两者间差异基因。现结合相关参考文献1-2就凝胶制备的体会报道如下。1 胶板准备 (1）胶板的清洁是灌胶能否成功的第一关键步骤。反复使用时要将玻璃板和间隔片上凝胶去除干净，彻底洗净后干燥。用乙醇擦拭玻璃板上残留水渍。不能有一点残留的凝胶和残渣，否则灌胶时会产生气泡。(2）灌胶前要对玻璃板分别进行处理。长玻璃用亲和硅烷，短玻璃用剥离硅烷处理，便于电泳结束后长短玻璃板的分离，凝胶都粘附在长玻璃板上。处理时先用剥离硅烷涂抹短玻璃，再用亲和硅烷涂抹长玻璃，能不更换手套就避免亲和硅烷污染短玻璃。玻璃板上不能有多余硅烷，否则干燥后会留下水印，在后续实验如硝酸银染色显示条带时会有水印痕迹，影响显色条带的观察。可用镜头纸拭去多余硅烷。涂抹均匀后分开放置干燥玻璃，最好干燥过夜，否则会粘胶。2 胶室制备 在凝胶灌制中胶室底部漏胶不可避免，需要准备较多的胶液以防漏胶过多而灌胶不足。胶室的制备对漏胶多少极为重要。一般胶室玻璃板间两边放置有间隔片而底部无间隔片，而底部是最容易发生漏胶的地方。为防止漏胶常用方法有用胶布封边或用琼脂糖凝胶封底。用胶布封边时胶布一遇水就失去粘性，特别是在玻璃板的两个底角，常封固不牢而很容易发生渗漏。用琼脂糖封边的不便之处为：一般变性聚丙烯酰胺凝胶面积较大，厚度常不到1mm，在灌制中如果有极小的琼脂糖液滴不能流到底部，在聚丙烯酰胺凝胶灌注时会在残留的琼脂糖附近产生气泡；琼脂糖浓度偏低则凝聚时间长，延长灌胶时间，且灌制琼脂糖时也要发生漏胶。我们参照分子克隆实验指南1的第三种方法：在胶室底部插入间隔片。选择稍长于玻璃板宽度的间隔片，仅需插入1mm即可，紧密对齐两边的间隔片，用弹簧夹夹住。此法仅需35ml胶液就能灌制47cm17cm0.04cm大小凝胶，渗漏很少。凝胶凝聚后取出底部间隔片，用移液器吸取200ul左右电泳液沿玻璃板边缘充满底部间隙，不能留有空泡，否则电泳时凝胶下端电泳泳道会歪斜。使用该方法节约试剂，减少剩余胶液污染，操作简便快捷。3 凝胶灌制 采用回流灌注法灌注凝胶。因制备好的胶室有弹簧夹，将胶室放置在一水平支架上。一人操作时以靠近操作者一侧胶室底角为最低点，左手托住对侧玻璃板中部抬高胶室约30。右手从低侧短玻璃处缓缓灌注胶液成连续的细流，到达底部后逐步放低胶室，直至灌满，水平放置后插入梳子，6%凝胶聚合常需12小时。灌胶中如有气泡形成，调整胶室角度消除气泡后稍放缓灌胶速度常能凑效。【参考文献】 J.萨姆布鲁克, D.W拉塞尔.分子克隆实验指南M.第3版.北京:科学出版