骨桥蛋白在乳头状甲状腺癌中的表达及意义.doc

骨桥蛋白在乳头状甲状腺癌中的表达及意义作者：孙咏梅刘韶平马喆王正滨吴俐【摘要】 目的：通过mRNA和蛋白质水平检测乳头状甲状腺癌组织中骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达,探讨其与甲状腺癌发生、发展的关系。方法：收集48例新鲜的乳头状甲状腺癌组织，采用实时荧光定量PCR法检测OPN mRNA的表达，通过免疫组织化学方法检测组织中OPN的表达。30例甲状腺良性病变及20例正常甲状腺组织作为对照。结果：乳头状甲状腺癌组织中OPN mRNA的表达水平为56.8249.16,高于甲状腺良性病变组织（19.7228.56）及正常甲状腺组织（13.7620.65）。免疫组织化学结果表明,OPN主要定位于癌细胞的细胞质，OPN蛋白表达结果与mRNA基本一致。OPN mRNA的表达与乳头状甲状腺癌的瘤灶数目、瘤体大小、肿瘤淋巴结转移及肿瘤临床分期无明显相关性（P>0.05）,病理发现砂粒体的乳头状甲状腺癌OPN mRNA的表达高于未发现砂粒体者（P<0.05）。结论：OPN在乳头状甲状腺癌中的表达高于甲状腺良性病变及正常甲状腺组织。乳头状甲状腺癌OPN mRNA的表达量与病理砂粒体的存在相关。OPN在乳头状甲状腺癌的发生、发展中发挥一定作用。 【关键词】 甲状腺肿瘤骨桥蛋白聚合酶链反应 【ABSTRACT】 Objective： To investigate the expressions of osteopontin in human thyroid papillary carcinoma. Methods： Forty-eight fresh samples of thyroid papillary carcinoma were collected. The expressions of OPN mRNA and protein were analyzed by using FQ - PCR and immunohistochemical staining respectively. Thirty samples of thyroid benign lesions and 20 samples of normal thyroid tissues were selected as control group. Results： The expression levels of OPN mRNA and protein in thyroid papillary carcinoma were higher than those of control. No significant relevance was found between the expression of OPN and clinical features（include lesion numbers, tumor size, lymph metastasis and TNM stage）. The expression levels of OPN mRNA were related with psammoma bodies in tumor tissue. Conclusions： The expression levels of OPN in thyroid papillary carcinoma were higher than benign lesions and normal thyroid tissues. The expression levels of OPN mRNA was related with psammoma bodies in tumor tissue. OPN may play a role in the development of thyroid papillary carcinoma. 【KEY WORDS】 Thyroid neoplasmsOsteopontinPolymerase chain reaction 甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，主要组织学类型包括乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌和未分化癌,其中乳头状癌占所有甲状腺恶性肿瘤的75%以上。甲状腺癌发病率呈逐年上升趋势，迄今为止尚无明确的预防措施和控制手段,有关甲状腺癌的发病机制及有效治疗手段仍在不断探索中。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的磷酸化糖蛋白,参与细胞信号转导,促进细胞粘附和迁移,与肿瘤细胞的生长、侵袭、转移密切相关，近年被认为是一个新的肿瘤标志物2。本研究分别从mRNA和蛋白质水平检测乳头状甲状腺癌组织中OPN的表达,探讨OPN与甲状腺癌发生、发展的关系。 1资料与方法 1.1一般资料选择2006年6月2008年2月在青岛大学医学院附属医院普外科收治的经病理组织学检查证实为乳头状甲状腺癌的患者48例，病例资料均完整。其中男13例，女35例，年龄1968岁，平均年龄43.6岁，中位年龄41岁；淋巴结转移19例，无淋巴结转移29例；临床TNM分期（参照UICC1987年分期标准）：期33例，期15例。另选取同院同期甲状腺良性病变组织标本30例，其中男11例，女19例，年龄2171岁，平均年龄45.2岁，中位年龄43岁，包括结节性甲状腺肿23例，甲状腺腺瘤7例；正常甲状腺组织20例，取自良性病变周围组织。所有患者术前均未接受放、化疗及其他药物治疗。所有标本均在手术切除后半小时内处理完毕，每例标本均分成两份,一份用4%甲醛固定,作常规病理及免疫组织化学染色，另一份置于-80液氮罐中。 1.2主要试剂PCR引物及探针：从PUBMED/Nucleotide GenBank中查出OPN基因全序列，以GAPDH基因序列作为内参照，应用Primer Premier 5.0软件，设计引物。经预实验后，确定探针序列，由上海生物工程技术服务有限公司合成。OPN 5端引物序列5-AGGACTCCATTGACTCGAACGA-3, 3端引物序列为5-CACCTCGGCCATCATATGTGT-3，扩增产物长度为183 bp。OPN Taqman探针序列：5-ACGGACCTGCCAGCAACCGAAGTT-3；内参照基因采用葡萄糖磷酸脱氢酶（GAPDH） , 5端引物序列为5-ACTCTGGCAAAGTGGATGTTGTC-3, 3端引物序列为5-GCATCACCCCACTTGATGTTG-3，扩增产物长度为150 bp。GAPDH Taqman探针序列为5-ATGATTCCACCCACGGCAAGTTCCA-3。荧光定量PCR两步法试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，RNA提取试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司，鼠抗人OPN单克隆抗体（一抗）及羊抗鼠IgG（二抗）购自北京中山生物技术公司。 1.3检测方法 1.3.1实时荧光定量聚合酶链反应测OPN mRNA 1）RNA的提取及cDNA 的合成。将冻存的手术标本取出，总RNA提取参照Trizol试剂盒说明逐步操作。成功提取后，取适量RNA进行甲醛变性凝胶电泳，并用紫外分光光度计测定波长260 nm和280 nm处吸光度值，计算A260A280比值（OD值），确定RNA的含量、浓度和纯度。参照实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time PCR）试剂盒要求的条件对提取的总RNA进行逆转录反应，均采用10 L反应体系，所得cDNA用于PCR扩增。2）PCR扩增条件及OPN序列测定。以GAPDH为内参照进行PCR扩增。条件为95预变性10 s，95变性5 s，60延伸45 s,共40循环。取10 L PCR扩增产物，采用2%琼脂糖凝胶电泳,以DL600为分子量参照,紫外透射仪下观察拍照。PCR产物送上海生物工程公司进行纯化,测序鉴定。3）Real-Time PCR。使用7500 Real-Time PCR仪（美国Applied Biosystems公司），按照试剂说明书提供的参考用量及终浓度范围，制备PCR反应混合液。用20 L反应体系，以最佳PCR条件扩增40个循环。由PCR仪采集、分析荧光信号,自动生成荧光强度曲线，计算反应体系中待测样本GAPDH及OPN基因的Ct值。 1.3.2免疫组织化学法检测组织中OPN蛋白的表达标本石蜡包埋、切片，常规脱蜡至水化,以3的过氧化氢灭活内源性酶15 min，微波炉加热15 min修复抗原，自然冷却，滴加非免疫性羊血清，以阻断组织中的非特异性结合。依次滴加OPN鼠抗人单抗（一抗）、羊抗鼠IgG（二抗）、SP液、DAB显色35 min，苏木精复染、脱水、透明，中性树胶封片，显微镜下观察。PBS液代替一抗作为阴性对照。观察不同甲状腺组织中OPN的蛋白表达。 1.4结果判定 1.4.1Real-Time PCR定量分析本研究用Ct方法进行目的基因的相对定量检测，计算公式为：Ct = Ct GI（未知样品）- Ct GAPDH（未知样品）- Ct GI（校正样品）- Ct GAPDH（校正样品），用2-Ct表示目的基因OPN的相对表达量。2-Ct值越高，表明样本的OPN mRNA含量越高。 1.4.2免疫组织化学检测每例标本均由两位经验丰富的病理科医师读片,以细胞质棕黄色染色且无非特异性背景染色的细胞为阳性细胞,选择5个高倍视野，按阳性细胞数占同类细胞的百分比，将结果分为：阴性（-），<5；弱阳性（+），525；阳性（+），2650；强阳性（+），>50。其中（-）和（+）为低表达，（+）和（+）为高表达。 1.5统计学处理应用SPSS10.0软件包进行统计学分析。计量资料以xs表示,样本率的比较采用2检验和Fisher精确概率法,样本均数的比较采用单因素方差分析和t检验。P0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1骨桥蛋白mRNA在不同甲状腺组织中的表达电泳所得PCR产物经序列测定证实为目的基因（图1）。48例乳头状甲状腺癌组织中OPN mRNA表达的范围为9.58298.93，均值为56.8249.16。30例甲状腺良性病变组织中OPN mRNA的表达范围为1.3084.43,均值为19.7228.56。20例正常甲状腺组织中OPN mRNA的表达的范围为2.5547.83,均值为13.7620.65（图2）。经单因素方差分析检验,乳头状甲状腺癌组织中OPN mRNA的表达高于甲状腺良性病变（P=0.013）和正常甲状腺组织（P=0.003）, 甲状腺良性病变与正常甲状腺组织表达差异无统计学意义（P=0.779）。 2.2不同甲状腺组织免疫组织化学结果免疫组织化学结果显示,OPN的阳性免疫组织化学染色呈棕褐色,主要定位于肿瘤细胞质（图3）。本研究48例乳头状甲状腺癌组织，OPN蛋白阳性表达率为89.58%（43/48），其中高表达率为70.83%（34/48）；对照组30例甲状腺良性病变组织中OPN蛋白阳性表达率为53.3%（16/30）,高表达率为20%（6/30）；20例正常甲状腺组织中OPN阳性表达率为45%（9/20），高表达0例。甲状腺癌组织OPN高表达率均明显高于甲状腺良性病变及正常甲状腺组织（P均<0.05，表1）。 2.3骨桥蛋白mRNA的表达与乳头状甲状腺癌临床病理特征的关系本研究发现乳头状甲状腺癌组织中OPN mRNA的表达与瘤体内砂粒体（微钙化灶）的存在相关，有砂粒体的瘤体OPN mRNA的表达量明显高于无砂粒体的瘤体；OPN mRNA的表达与瘤灶数目、瘤体大小、肿瘤淋巴结转移及肿瘤临床分期均无明显相关（表2）。 3讨论 OPN是最初在骨基质中发现的一种分泌型钙结合磷酸化糖蛋白,广泛分布于人体组织中，具有多种功能，在骨组织的矿化与重建、免疫调节、信号转导等过程中发挥重要的作用。近年来,OPN与肿瘤的发生发展,特别是与肿瘤转移的关系日益引起人们的关注。研究证实,OPN所含的RGD序列是与细胞粘附有关的重要功能域,通过与整合素受体及CD44V6等结合，调节细胞基质相互作用和信号转导，促进肿瘤细胞的黏附、移行浸润和血管新生，对肿瘤的发生、发展及转移发挥重要作用1-2。已有文献报道OPN在结肠癌、胃癌、肝癌、卵巢癌及乳腺癌等恶性肿瘤中呈高表达3-6。 本研究在mRNA和蛋白质水平均证实乳头状甲状腺癌组织中OPN的表达明显高于甲状腺良性病变及正常甲状腺组织。Guarino等7研究方法以免疫组织化学染色为主，仅对少数病例采用普通PCR方法检测；研究发现，OPN在甲状腺癌（尤其是乳头状甲状腺癌）组织中呈高表达，OPN的表达量与甲状腺癌的淋巴转移及瘤体大小相关，并提出OPN可能通过OPNCD44V6轴，调节细胞基质相互作用和信号转导，促进甲状腺肿瘤细胞的黏附和移行浸润。本研究增加了病例数量，采用了Real-Time PCR技术，使OPN mRNA的表达定量更精确。本研究对乳头状甲状腺癌患者临床病理特征进行分析发现，存在淋巴结转移、瘤体较大患者与无淋巴结转移、瘤体较小患者相比，OPN表达有增高趋势，然而差异并无统计学意义，此结论与Guarino等研究不同。本研究结果还显示OPN mRNA的表达与瘤灶数目、临床分期亦无明显相关。故我们认为，乳头状甲状腺癌组织OPN的表达量与淋巴转移和临床分期的关系，需扩大样本量进一步研究论证。 瘤体内的微钙化是诊断乳头状甲状腺癌的常用影像学征象，超声检查早已将其作为提示诊断的特异性指标。文献报道，超声显示的微钙化即是病理学中的砂粒体8-9，它是病理学确诊乳头状甲状腺癌的重要特征之一。以前的观点认为，乳头状癌由于乳头排列分支多，乳头供血较差，容易发生坏死钙化，但只是一种推测。1995年Hirota等10发现OPN与脑膜瘤、乳腺癌中的微钙化形成有关。此后Fluge等11用原位杂交等方法发现OPN mRNA表达的细胞位于砂粒体的周围，并用免疫组织化学方法表明OPN的分布与砂粒体的分布一致，由此证实了OPN对甲状腺乳头状癌砂粒体的形成起重要的作用。本研究发现OPN mRNA在伴有砂粒体的乳头状甲状腺癌组织中表达量明显高于不伴砂粒体者，进一步证实了Fluge的报道，推测OPN可能参与了癌组织的钙化过程，在肿瘤的发生、发展过程中发挥了多方面的作用。【参考文献】 1 Oldberg A, Franzen A, Heinegard D. et al. Cloning and sequence analysis ofrat bone sialoprotein （osteopontin） cDNA reveals an Arg-Gly-Asp cell-binding sequenceJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1986,83:8819-8823.2 Wai PY, Kuo PC. The role of osteopontin in tumor metastasisJ. J Surg Res, 2004,121:228-241.3 贺斌,刘银坤,汤钊猷,等. 肝癌中骨桥蛋白表达的临床意义J.中华肝脏病杂志,1998,4:208-210.4 Rudland PS, Higgins AP, Tanani ME, et al. Prognostic significance of the metastasis-associated protein osteopontin in human breast cancerJ. Cancer Res, 2002,62:3417-3427.5 Ariztia EV, Subbarao V, Solt DB, et al. Osteopontin contributes to heaptocyte growth factor-induced tumor growth and metastasis formationJ. Exp Cell Res, 2003,288:257-267.6 Ue T, Yolozaki H, Kitadai Y, et al. Co-expression of osteopontin and CD44v9 in gastric cancerJ. Int J Cancer, 1998,79:127-132.7 Guarino V