用改良消减法克隆类风湿性关节炎滑膜细胞中的高表达基因.doc

用改良消减法克隆类风湿性关节炎滑膜细胞中的高表达基因作者：王吉村药立波吕厚山刘新平邓艳春赵忠良聂晓燕孙铁铮燕太强 【关键词】改良消减杂交法 关键词:改良消减杂交法;滑膜细胞;类风湿性关节炎 0引言 在类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis，RA）中，关节内滑膜细胞（fibroblast-likesynovialcells，FLS）的过度增生是造成关节软骨破坏和关节畸形的关键环节，为了研究滑膜细胞发生增殖的机制，我们采用赵忠良等人设计的改良消减杂交法1，并以骨性关节炎（osteoarthritis，OA）滑膜细胞为对照筛选RA滑膜细胞中的高表达基因. 1方法 将RA滑膜细胞和OA滑膜细胞分别设定为实验组和扣除组，用扣除组的cDNAs杂交扣除掉实验组中与前者相同的cDNAs，得到的就是目的产物:实验组中高拷贝数的或独有的cDNAs，也就是RA滑膜细胞中高表达的cDNAs.具体步骤为:分别提取RA和OAFLS的mRNAs，对于实验组RAmRNAs，反转录时采用带锚定序列的反转录引物，引物序列为5-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT（30）N-1N-3，同时在反应体系中加入根据mRNA5GGG帽结构设计的5锚定引物，序列为5-AAGCAGTGGTAA-CAACGCAGAGTACGCGGG-3，使其在反转录时在cDNA5末端引入与3端相同的锚定序列.对于扣除组OAmR-NAs，采用普通的反转录方法;将扣除组OAcDNAs通过随机引物PCR扩增，掺入Biotin-dUTP，制成扣除探针;将实验组RAcDNAs与过量OA扣除探针进行液相杂交，然后用连有链亲和素的磁珠分离杂交产物，去除杂交体和未杂交上的扣除探针;以未杂交上的RAFLScDNA为模板进行长距离PCR扩增，两侧引物序列均为5-AAGCAGTG-GTAACAACGCAGAGT-3，将扩增产物回收并克隆入质粒载体;酶切质粒，将回收的酶切片段点于硝酸纤维素膜上，与扣除组cDNAs进行反向点杂交，排除假阳性克隆后，将阳性克隆测序. 2结果 酶切显示，在已鉴定的150个白色克隆中，55个（占36.7%）克隆的插段长度大于400bp.12个（占8%）克隆的插段长度大于1000bp.反向点杂交结果表明，55个克隆中，假阳性克隆为13个，占23.7%.对42个阳性克隆中的18个进行序列分析显示，其中12个为已知基因，占66.7%;分别为核糖体蛋白S4，S23，S25基因、干扰素诱导基因、铁蛋白轻链基因、层粘连蛋白受体基因、转化生长因子基因、tubu-lin-polypeptide基因、组织蛋白酶B基因、前I型胶原基因、A-raf原癌基因和IGF-1结合蛋白特异性丝氨酸蛋白酶基因，这些序列大多为已知基因的3部分.另外，还有6个克隆为新序列，占33.3%.序列分析表明，这六个新序列均有编码区，其中4个序列各有一完整读框，分别编码85个氨基酸（aminoacids，aa），45aa，139aa和45aa，另外两个序列分别为各自读框的5部分（135aa）和3（75aa）部分. 3讨论 3.1关于改良消减杂交法这种方法是本室赵忠良博士等首先建立的，此方法较代表性差异分析技术和抑制消减杂交法等两种消减杂交技术有两点改进之处:一是在反转录时将实验组cDNAs的两端分别引入锚定序列，这不仅有利于杂交后差异基因的扩增和克隆，而且有利于获得全长cDNA或较长cDNA片段;二是扣除探针中掺入生物素，这样利用生物素与链亲和素结合的特性，就可以将杂交混合物中的杂交体和未杂交上的扣除组成分去掉. 本研究发现，在所得到的基因片段中，8%长于1000bp，36.7%长于400bp，而且6个新序列都有编码区，反向点杂交显示，假阳性率为23.6%.所以无论从获得片段的长度上还是特异性上都明显优于差示PCR方法.另外，在测序克隆中，33.3%为新序列，在已知基因中，转化生长因子基因和A-raf原癌基因等都是表达丰度较低的基因，提示这种方法可以克隆到低丰度的差异表达基因，在这一点上，它要优于代表性差异分析技术和抑制消减杂交法.还有，此方法的简便快捷也是显而易见的. 但实验中也发现了两个问题，一是扩增产物不易被克隆，大片段尤其如此;二是很多片段还不完整，为已知基因3部分.分析原因，可能是由于PCR过程中循环数太多，导致因引物的不足使PCR产物中单链cDNAs太多所造成. 3.2一些高表达的已知基因与滑膜细胞病变的关系 3.2.1丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶是一类细胞分泌的具有底物相对特异性的蛋白酶.RA滑膜细胞高表达的这种蛋白酶是IGF-1结合蛋白（IGF-1bindingprotein，IGFBP）特异性的丝氨酸蛋白酶，它可分解IGFBP，而IGF-1结合蛋白的减少有利于IGF-1游离而发挥生物学活性3.所以RA滑膜细胞可能通过以下途径:“分泌丝氨酸蛋白酶-分解IGFBP-提高游离IGF-1水平”来促进滑膜细胞的增殖，若这条途径存在，则丝氨酸蛋白酶就可成为抑制滑膜细胞增殖的一个新靶点.所以有必要进一步研究丝氨酸蛋白酶在RA滑膜细胞中的作用. 3.2.2A-rafA-raf是一类原癌基因，它所编码的蛋白A-Raf是一种重要的细胞内信号转导分子，并在介导细胞增殖、分化和凋亡中具有重要意义.A-raf基因的表达水平增高和活化可能是RA滑膜细胞过度增殖的细胞内机制，同时也提示，Ras-Raf-MAPK信号转导途径可能是介导滑膜细胞增殖的一个主要途径. 3.2.3组织蛋白酶B有研究表明，组织蛋白酶B参与RA关节破坏.Lemaire等4研究也发现，在一些细胞因子刺激下，滑膜细胞选择性分泌组织蛋白酶B和L，所以RA患者滑膜细胞高表达组织蛋白酶B可能是受炎症因子刺激所至.高表达组织蛋白酶B可能是RA滑膜细胞表现有软骨侵蚀性的一个重要原因. 参考文献: 1ZhaoZ，HuangX，LiNetal.Directcloningofcelldifferentialexpressiongeneswithfull-lengthbyanewstrategybasedonthemultipleroundsoflongdistancepolymerasechainreactionandmagneticbeadsmediatedsubtractionJ.JBiotechnol，1999;73（1）:35-41. 2KumonY，SuehiroT，HashimotoKetal.Localexpressionofa-cutephaseserumamyloidAmRNAinrheumatoidarthritissyn-ovialtissueandcellsJ.JRheumatol，1999;26（4）:785-790. 3LowmanHB，ChenYM，SkeltonNJetal.Molecularmimicsofinsulin-likegrowthfactor1（IGF-1）forinhibitingIGF-1:IGF-bindingproteininteractionsJ.Biochemistry，1998;37（25）:8870-8878.