慢性排斥反应移植肾组织TIAF1的表达及其意义.doc

慢性排斥反应移植肾组织TIAF-1的表达及其意义 作者：周广臣 何小舟 巢志复 【摘要】 目的 探讨移植肾慢性排斥反应（CR）时转化生长因子-1诱导的抗凋亡因子-1（TIAF-1）的表达及其意义。方法 采用SP免疫组织化学染色法对6例因肾细胞癌行肾切除的未受肿瘤侵犯的正常肾组织和8例供肾正常肾组织、16例急性排斥反应和28例慢性排斥反应移植肾组织中TIAF-1的表达进行观察，并对间质浸润细胞中CD3、CD20、CD68阳性细胞数进行分析。结果 正常供肾组织未见TIAF-1表达。急性排斥反应移植肾间质TIAF-1阳性细胞数明显增加，肾小管上皮细胞呈微弱的TIAF-1表达。在慢性排斥反应移植肾组织中，TIAF-1在间质浸润细胞中的表达呈弥漫性、强阳性,较多的肾小管上皮细胞呈高度染色。移植肾间质浸润的TIAF-1阳性细胞数与CD3和CD20阳性细胞数呈正相关。结论 TIAF-1在慢性排斥反应移植肾组织中的表达可能与Th1细胞向Th2细胞的免疫偏离有关，移植肾肾小管上皮细胞的TIAF-1表达可能反映了某种保护性机制的诱导。 【关键词】 肾移植；慢性排斥反应；转化生长因子-1诱导的抗凋亡因子-1 Abstract: Objective To investigate the characteristics of TGF-1-induced antiapoptotic factor-1 (TIAF-1) expression in renal allograft of chronic rejection (CR) and to study the possible pathogenic role of TIAF-1 in chronic allograft rejection. Methods Immunohistochemistry of streptavidin-perosidase (SP) method was applied in the observation of the expression of TIAF-1 in each group, including tissues obtained from the unaffected part of nephrectomized kidneys with renal cell carcinoma (n=6) and cadaveric donor of normal kidneys (n=8) as the control group, tissues with acute rejection (AR, n=16) and those with chronic rejection (CR, n=28), and in the analysis combined with the number of positive cells of CD3, CD20 and CD68 infiltrated in the interstitium. Results The expression of TIAF-1 was not detectable in normal kidney. The expression of TIAF-1 positive cells in the interstitium of renal allografts with acute rejection was up-regulated and TIAF-1 was weakly expressed in tubular epithelial cells. In tissues with chronic renal allograft rejection, a high and diffusive expression of TIAF-1 was found in the positive cells infiltrated in the intersitium of the renal allografts, with more tubular epithelial cells highly stained, most of which were CD3 and CD20 positive cells. Conclusion The expression of TIAF-1 in renal allografts with chronic rejection might be correlated with the immune deviation of Th1 to Th2 cells. The expression of TIAF-1 in tubular epithelial cells of renal allografts may be induced by a certain protective mechanism. Key words: renal transplantation; chronic rejection; TGF-1-induced Anti-apoptotic Factor-1 (TIAF-1) 慢性排斥反应（chronic rejection,CR）是器官移植后期移植物失功能的主要原因，制约着移植受体长期生存率的提高，其确切的发病机制目前尚未阐明。研究表明，凋亡在同种异体排斥反应中起重要作用，肾移植慢性排斥反应与肾小管上皮细胞凋亡有关，而凋亡并非仅限于移植组织，移植物浸润的T细胞亦存在凋亡现象，后者可能下调受体对移植物的排斥反应1-3。近年来研究发现，CR与辅助性T细胞型（Th1）向辅助性T细胞型（Th2）免疫偏离密切相关4。转化生长因子-1诱导的抗凋亡因子-1(TGF-1-induced antiapoptotic factor-1, TIAF-1)是极化的Th2细胞表达的免疫分子之一。实验证明，TIAF-1能抑制肿瘤坏死因子（TNF-）对成纤维细胞的细胞毒作用，提示该分子对其他细胞的凋亡有保护作用5。本研究旨在通过观察同种异体慢性排斥反应移植肾组织中TIAF-1的表达及分布，初步探讨TIAF-1在慢性排斥反应中的作用。 1 材料和方法 1.1 标本 取自苏州大学附属第三医院肾移植中心2000年7月2003年5月发生慢性排斥反应和急性排斥反应（AR）的受体移植肾，分别为28例和16例，所有肾移植患者术后均采用常规免疫抑制治疗（环孢素A+霉酚酸酯+泼尼松）。AR和CR根据临床表现和移植肾病理确诊，病理诊断参照Banff 诊断标准6。6例因肾细胞癌行肾切除的未受肿瘤侵犯的正常肾组织和8例供肾正常肾组织为实验对照。 1.2 试剂 兔抗人TIAF-1多克隆抗体由Mattison教授惠赠，兔抗人CD3多克隆抗体、鼠抗人CD68和鼠抗人CD20单克隆抗体均为美国Santa Cruz公司产品，SP试剂盒为美国AYMED公司产品。 1.3 免疫组织化学检查及结果分析 免疫组织化学染色采用SP法7：4 m厚石蜡切片常规脱蜡水化，微波抗原修复。0.3% H2O2甲醇溶液浸泡30 min，正常山羊血清室温孵育20 min，兔抗人TIAF-1多克隆抗体工作浓度为1100，兔抗人CD3多克隆抗体、鼠抗人CD20单克隆抗体工作浓度分别为150和180，4下过夜，滴加SP复合物后置37下40 min，PBS液洗5 min3次；滴加DAB-H2O2显色剂，苏木素复染细胞核，脱水，封片。PBS代替一抗、二抗作阴性对照。 结果判定：细胞膜或细胞质染成棕黄色或棕褐色为阳性，不着色为阴性。用显微测微器在高倍镜（1040）视野下计数16个视野，将阳性细胞数之和乘以4即得每平方毫米间质阳性细胞数。 1.4 统计学处理 所有数据以s表示。组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 移植肾组织中TIAF-1的表达分布 肾细胞癌行肾切除的未受肿瘤侵犯的正常肾组织和正常供肾组织未见TIAF-1表达。在急性排斥反应移植肾组织中，TIAF-1表达有增强趋势，其中间质TIAF-1阳性细胞数明显增加，肾小管上皮细胞有微弱的TIAF-1表达。在慢性排斥反应移植肾组织中，TIAF-1在间质浸润细胞中的表达呈弥漫性、强阳性，较多的肾小管上皮细胞呈高度染色。在连续的移植肾组织切片中，TIAF-1阳性浸润细胞弥漫性分布的区域同时存在大量CD3和CD20阳性细胞浸润，提示T细胞和B细胞均表达TIAF-1。 2.2 移植肾间质浸润细胞TIAF-1表达的比较及其与CD3、CD20和CD68阳性细胞数的关系 见表1。AR组移植肾组织间质浸润的TIAF-1阳性细胞数显著高于对照组（P<0.05），CR组移植肾组织间质TIAF-1阳性细胞数显著高于AR组（P<0.01）。对移植肾组织间质TIAF-1阳性细胞数与CD3、CD20、CD68阳性细胞数进行相关性分析发现，TIAF-1阳性细胞数与CD3和CD20阳性细胞数呈正相关（P0.05），而与CD68阳性细胞数无相关性（P0.05）。表1 3组肾间质浸润细胞TIAF-1的表达及CD3、CD20和CD68阳性细胞数的比较 3 讨 论 T淋巴细胞对同种异体抗原的识别是启动细胞免疫的基础。目前认为至少有2种不同的T细胞识别途径，即直接识别和间接识别。在间接识别途径中，CD4+T细胞的TCR能够识别被抗原递呈细胞（APC）加工处理并呈递的供体MHC分子分解的同种异体抗原肽，也称CD4+Th2反应。研究表明，异基因识别的间接途径的强化，加大了急性排斥反应，并在慢性移植物失功中起主导作用，是诱发和维持慢性排斥反应的关键4。最近发现，极化的Th2细胞能表达一种TGF-1诱导的抗凋亡细胞分子-1(TIAF-1)，TIAF-1可抑制TNF-对成纤维细胞的细胞毒作用，据此推测TIAF-1对其他细胞的凋亡有抑制作用5。本研究发现，正常供肾组织中几乎无TIAF-1表达；AR肾组织中，TIAF-1表达有增强趋势，其中以间质浸润细胞染色为主，肾小管上皮细胞轻微染色。CR肾组织中，TIAF-1在间质浸润细胞的表达呈弥漫性、强阳性，肾小管上皮细胞亦呈重度染色，肾小球及血管内皮细胞几乎不染色。连续移植肾病理切片免疫组化染色显示，在TIAF-1显著染色的区域可见大量CD3阳性细胞和CD20阳性细胞存在；此外，CR肾组织间质中TIAF-1阳性细胞数与CD3、CD20阳性细胞数呈正相关，而与CD68阳性细胞数无相关性，提示移植肾间质浸润的T、B淋巴细胞均可表达TIAF-1。 研究表明，细胞凋亡在急、慢性排斥反应发生、发展过程中起重要作用，同种异体肾移植慢性排斥反应与移植肾肾小管上皮细胞凋亡密切相关2，8。而在移植肾组织中，细胞凋亡并不仅仅局限于实质细胞，间质浸润的T淋巴细胞亦存在凋亡现象。研究表明，移植肾间质浸润T淋巴细胞的凋亡将下调受体对移植肾的免疫排斥反应，预示急性排斥反应的结局3，9。本研究结果表明，慢性排斥反应移植肾浸润淋巴细胞和肾小管上皮细胞均强烈表达TIAF-1，提示这种抗凋亡因子的表达可能对移植肾产生正负两方面的影响。TIAF-1在移植肾肾小管上皮细胞上的表达可能反映了一种保护性机制的诱导，使得肾小管上皮细胞避免凋亡。慢性排斥反应移植肾间质浸润淋巴细胞的TIAF-1高表达可能反映了Th1向Th2的免疫偏离。研究表明，自身免疫性甲状腺炎浸润Th2淋巴细胞产生的细胞因子IL-4、IL-10可诱导甲状腺腺上皮细胞表达抗凋亡因子c-Flip和 BCL-XL，以上2种抗细胞凋亡因子能阻止自身免疫反应引起的实质性细胞的破坏10-11。至于移植肾间质浸润Th2淋巴细胞产生的细胞因子能否诱导肾小管上皮细胞表达TIAF-1及其他抗凋亡因子，尚待进一步研究。 【参考文献】 1 Zavazava N, Kabelitz D. Alloreactivity and apoptosis in graft rejection and transplantation tolerance J. J Leukoc Biol，2000，68(2):167-174. 2 Laine J, Etelmki P, Holmberg C, et al. Apoptotic cell death in human chronic renal allograft rejection J. Transplantation，1997，63(1):101-105. 3 August C, Schmid KW, Dietl KH, et al. Prognostic value of lymphocyte apoptosis in acute rejection of renal allografts J. Transplantation，1999，67(4):581-585 4 Haval S Chronic allograft rejection: Do the Th2 Cells Preferentially Induced by Indirect Alloantigen Recognition Play a Dominant Role?J. Transplantation，1999，68（6）：715-726. 5 Chang NS, Mattison J, Cao H, et al. Cloning and characterization of a novel transforming growth factor-beta1-induced TIAF1 protein that inhibits tumor necrosis factor cytotoxicity J. Biochem Biophys Res Commun，1998，253(3):743-749 6 Racusen LC， Solez K， Colvin RB, et al. The Banff 97 working classification of renal allograft pathology J. Kidney Int，1999，55（2）:713-723. 7 苏 红，谷化平，胡海霞，等.LASB法与ABC法免疫组化染色敏感性的对比研究J.中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4（3）：296-300. 8 Hayakawa K， Naka H， Ma