伴大豆球蛋白亚基色谱分离和制备及结构表征.doc

伴大豆球蛋白亚基色谱分离和制备及结构表征 作者：袁德保 杨晓泉 黄科礼【摘要】 研究了色谱方法对伴大豆球蛋白组成3个亚基的分离纯化工艺条件，并利用圆二色光谱对纯化得到的3个亚基的二级结构和三级结构进行了表征。结果显示：利用离子交换色谱（DEAEsepharose fast flow， DEAE为二乙氨乙基）和金属螯合层析（Immobilized metal affinity column， IMAC）相结合的方法，能将3个亚基组分完全分开，得到了能制备相对大量的3个亚基, 和 的稳定工艺，纯度为95%，回收率达75%。远紫外CD结果显示，在3个亚基的二级结构中， 螺旋较少，但都具有较高含量的折叠和无规卷曲； 近紫外CD结果显示， 3个亚基在制备过程中因为尿素的变性作用，都已经散失了三级结构。 【关键词】 伴大豆球蛋白； 亚基； 纯化； 结构Abstract The isolation process of the three constituent subunits of soybean conglycinin was studied by the chromatographic method and then the secondary and tertiary structures of three constituent subunits were characterized. The results showed that the combination of diethylaminoethyl (DEAE)Sepharose Fast Flow column and immobilized metal affinity column (IMAC) succeeded in isolating these subunits completely, giving high purity (95%) and a total recovery ratio of 75%. The data from farUV CD showed the subunits had relatively low content of helix and high content of sheet, turn and unordered structure. The contents of their sheet in the isolated subunits were higher than those of conglycinin, whereas their contents of unordered structures were lower than conglycinin. The nearUV CD showed the isolated subunits lost their tertiary structure due to the denaturalization of urea in the purification process.Keywords Conglycinin; Subunits; Purification; Structure 1 引 言 伴大豆球蛋白是大豆的两种主要贮藏蛋白之一，占大豆贮藏蛋白含量的30%1,2。伴大豆球蛋白通常以由3个亚基,和通过非共价键形成的三聚体形式存在。大豆贮藏蛋白因其良好的营养及功能特性，使其在食品领域中广泛应用。目前，伴大豆球蛋白的亚基水平的研究是一个热点，因为这类研究能解释伴大豆球蛋白在保健功效和食品应用方面的机制36。 Maruyama等利用基因工程的方法，得到了未进行后期糖基化修饰的亚基以及不具有扩展区的亚基（c和c）。Lovati等3利用制备型双向电泳得到了单一的亚基和, 的混合物。Maruyama等8,9从大豆缺失体中分离得到了3种亚基组分。Duranti等10建立了从传统大豆品种中较大规模制备的方法。此外，从传统大豆品种中制备3个亚基的方法也有报道11,12。但仍需建立一种能制备高纯度且较大制备量的分离制备方法13,14。而上述提到的几种制备方法在一般实验室难以操作(如制备型双向电泳、大豆缺失体品种)，且制备量小。 本研究建立了能普遍适用的制备(具有一定制备量)高纯度伴大豆球蛋白的制备方法， 并对制得的3个亚基的二级结构和三级结构进行了表征。2 实验部分2.1 仪器与试剂 UVP 凝胶成像系统；AKTA蛋白质纯化仪（美国GE公司）；PYCZ30垂直板电泳仪（北京六一仪器厂）；MOS450园二色谱仪(法国BioLogic公司)。 低变性脱脂大豆片（白豆片，山东新嘉华有限公司提供）。白豆片粉碎后，过 mm孔径筛并储存于4 下密闭容器中。豆粉蛋白质含量为（55.50.4），氮溶指数84.0。树脂（DEAEsepharose fast flow和Immobilized metal affinity column）和柱子（4.5 cm30 cm, 美国GE公司）。试剂为分析纯或更高级别。2.2 实验方法2.2.1 伴大豆球蛋白的制备采用 Nagano法15制备伴大豆球蛋白，电泳鉴定纯度后，透析、冻干后4 保存以备用。2.2.2 亚基组分的分离纯化5 g伴大豆球蛋白溶解在60 mL含6 mol/L尿素的TrisHCl缓冲液（简称为标准缓冲液, pH 7.0）中，先用标准缓冲液将离子交换柱平衡。上样后,穿透部分洗下2个穿透峰，然后进行线性梯度洗脱（00.5 mol/L NaCl），其中第二个峰为纯度很高的和的混合物。将第二个洗脱峰透析、冻干，以便进行进一步的IMAC分离。将和的混合物（5 g）溶于60 mL 0.05 mol/L TrisHCl缓冲液（pH 7.0, 含0.5 mol/L NaCl和6 mol/L尿素）。先将吸附了Ni2+的IMAC柱子用0.05 mol/L TrisHCl缓冲液（pH 7.0,含0.5 mol/L NaCl和6 mol/L尿素）平衡好，然后上样。用上述缓冲液将柱子上未被吸附的部分洗脱下来， 用含有0.1 mol/L咪唑的上述缓冲液可以将洗脱下来。将各部分洗脱液收集，透析、冻干以备用。2.2.3 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE) SDSPAGE 电泳按照Laemmli法16进行。 远紫外和近紫外圆二色谱分析采用园二色谱仪器进行CD测定。远紫外圆二色光谱测定样品浓度为0.1 g/L, 近紫外圆二色谱测定样品浓度为1 g/L。样品溶解在5 mmol/L TrisHCl 缓冲液中。扫描次数为2次。二级结构计算软件为CD Pro。3 结果与讨论3.1 伴大豆球蛋白制备 通过Nagano方法15制备得到了伴大豆球蛋白。如图1所示，伴大豆球蛋白（图1，泳道2）具有其典型的条电泳条带，分别对应的是3个亚基, 和 （分子量分别为75,71和51 kDa）。通过光密度扫描技术，计算得到3个亚基条带的光密度之和占总个泳道的光密度比值的95%，即制备得到的伴大豆球蛋白的纯度约为95%。 3.2 伴大豆球蛋白组成亚基的色谱分离和制备 利用离子交换色谱对制备得到的伴大豆球蛋白，进行了第一阶段的纯化。纯化后得到两个穿透峰(峰1和峰2)，然后进行线性洗脱（00.5 mol/L NaCl），洗脱得到峰3、峰4和峰5。 各个洗脱峰的电泳图谱见图1。从图1可见，峰1主要组分是一些未被吸附的杂质，峰2的主要组分是亚基，峰3的左半部是亚基，而右半部是未完全分开的含有一些杂带（介于, 和 之间）的组分。峰4是纯度很高的和的混合物。峰5是部分受大豆球蛋白中的碱性亚基污染的和的混合物。将纯度很高的和的混合物（峰4）收集，透析冻干，以便用金属螯合层析进行下一步的分离纯化。而将峰2和峰3的左半部收集，透析、冻干，作为纯化的亚基以备用。5 g伴大豆球蛋白经过离子交换色谱可制备得约1.0 g 亚基、 3.1 g高纯度的和的混合物，回收率接近82%。 纯化的第二部分是用金属螯合层析进行和混合物的进一步分离以得到纯的和的单亚基。载有Ni2+的金属螯合柱对其中部分蛋白有吸附作用，而对另外一部分蛋白无吸附作用。峰1为穿透峰，通过使用含有0.1 mol/L咪唑的缓冲液洗脱下来的峰为峰2。通过电泳分析，峰1为基本没有吸附作用的，而峰2为吸附作用强的。将对应峰进行收集，透析，然后冻干，以备用。5 g 和的混合物经过IMAC色谱分离，分别制得约2.4和2.2 g，回收率约92%。总回收率为两部分回收率之积，约75%。 将冻干的样品进行了SDSPAGE分析（见图2）。其中泳道1为标准分子量，泳道2为起始原料伴大豆球蛋白，泳道3为，泳道4和5分别是和。通过光密度扫描，各个亚基的纯度都接近95%。3.3 制备得到的亚基的远紫外CD 利用远紫外圆二色光谱对纯化得到的样品的二级结构进行了表征（图3）。从图3可见，各个亚基组分呈现典型的远紫外CD曲线形状，利用软件CD Pro对得到的图谱进行分析，得到了各个样品二级结构的数据（表1）。从表1可见，包括伴大豆球蛋白在内的各个样品的二级结构中，螺旋含量比较少，均少于10%，尤其以伴大豆球蛋白的含量最少（5.4%）。相比伴大豆球蛋白，各个亚基的折叠结构都略微减少。而转角的含量相差不大。可能是因为受纯化过程中变性剂尿素的作用，各个亚基的无规卷曲结构均比伴大豆球蛋白的含量高。表1 伴大豆球蛋白及纯化得到亚基的二级结构的计算结果（略）3.4 制备得到的亚基的近紫外CD 利用近紫外CD对伴大豆球蛋白以及纯化得到的，和的三级结构进行了表征（图4）。从图4可见，伴大豆球蛋白在270 nm处有一个很明显的三级结构特征峰，表明使用Nagano办法提取得到的伴大豆球蛋白具有天然的高级结构。而纯化得到的、和都已经不具有明显的三级结构应具有的特征峰。表示在分离纯化过程中，各个组分在尿素等变性剂的作用下，已经完全散失了三级结构。4 结 论 本研究以伴大豆球蛋白为原料，利用离子交换色谱和金属螯合层析对其组成亚基的分离、纯化以及对得到的亚基的结构性质的表征，结论如下：（）利用本方法可以制备较大量的伴大豆球蛋白，纯化得到的亚基组分纯度能达到95%，回收率能达到75%； （）远紫外CD显示，伴大豆球蛋白及其亚基，螺旋含量都较少，而折叠、转角、无规卷曲含量较高。相比伴大豆球蛋白，各亚基的转角含量相近，折叠含量稍少，而无规卷曲含量稍高； （3）近紫外CD显示，用Nagano法提取得到的伴大豆球蛋白具有明显天然的三级结构，而纯化得到的各个亚基在纯化过程都已造成其三级结构的散失。【参考文献】 1 Kinsella J E. Advances in food and nutrition research. San Diego: Academic Press, 1992: 892082 Damodaran S, Alain Paraf. Food proteins and their applications. New York: CRC Press. 1997: 2572913 Lovati M R, Manzoni C, Gianazza E, Sirtori C R. J. Agric. Food Chem., 1998, 46（7）: 247424804 Manzoni C, Lovati M R, Gianazza E, Sirtori C R, Morita Y. J. Agric. Food Chem., 1998, 46（7）: 248124845 Manzoni C, Duranti M, Eberini I, Scharnagl H, Maerz W, Castiglioni S, Lovati M R. J Nutr.， 2003, 133（7）: 214921556 Krishnan H B, Kim W S, Jang S, Keller M S. J. Agric. Food Chem., 2009, 57（3）: 9389437 Maruyama N, Katsube T, Wada Y, Oh M H, Barba dela Rosa AP, Okuda E, Nakagawa S, Utsumi S. Eur. J. Biochem.， 1998, 258（2）: 8548628 Maruyama N, Sato R, Wada Y, Matsumura Y, Goto H, Okuda E, Nakagawa, Utsumi S. J. Agric. Food Chem., 1999, 47（12）: 527852849 Maruyama N, Salleh MRM, Takahashi K, Yagasaki K, Goto H, Hontani N, Nakagawa S, Utsumi S. J. Agric. Food Chem., 2002, 50（15）: 4323432610 Duranti M, Lovati MR, Dani V, Barbiroli A, Scarafoni A, Castiglioni S.