GITRmRNA在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平.doc

GITR mRNA 在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平作者：林志强 钱炜 吉均祥 王海生 陈建国 仝佳 王胜军【摘要】 目的： 探讨糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoidinduced tumor necrosis factor receptor,GITR)与变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)的关系。方法： 采用实时荧光定量PCR方法检测变应性鼻炎未治疗组(n=23，男12例，平均年龄34岁)、临床缓解组(n=17，男8例，平均年龄31岁)及正常对照组(n=24，男11例，平均年龄28岁)外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中GITR mRNA的相对表达水平。结果： 变应性鼻炎未治疗组GITR mRNA相对表达水平明显高于变应性鼻炎临床缓解组和正常对照组(P<0.05，P<0.01)，而变应性鼻炎临床缓解组GITR mRNA相对表达水平与正常对照组相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论： GITR可能参与了变应性鼻炎的病理过程，具体机制有待进一步研究。 【关键词】 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体; 变应性鼻炎; 外周血单个核细胞; 实时定量PCRAbstract Objective: To find out the correlation between glucocorticoidinduced tumor necrosis factor receptor(GITR) and allergic rhinitis(AR).Methods： Thirtythree(male 12, average 34 years old) patients with active AR, 17 AR patients with symptoms controlled(male 8, average 31 years old), and 24 normal controls(male 11, average 28 years old) were recruited in the study. The relative expression of GITR mRNA in peripheral blood mononuclear cells was detected by means of realtimefluorescence quantitative PCR method. Results： The relative expressions of GITR mRNA in the group of AR patients without treatment were significantly higher than that in the groups of AR patients with symptoms controlled and normal controls(P<0.01, respectively),but there was no statistically significant difference in relative expression of GITR mRNA between the groups of AR with symptoms controled and normal control(P>0.05). Conclusion： GITR might be involved in the pathological process of AR. The role of GITR in process of AR remains further investigation.Key words glucocorticoidinduced tumor necrosis factor; allergic rhinitis; peripheral blood mononuclear cell; realtime quantitative PCR糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoidinduced tumor necrosis factor receptor,GITR)为肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，又被称为TNFRSF18。1997年, Nocentini等1在地塞米松处理的T细胞杂交瘤中克隆出GITR。1999年以来,人类和鼠类的GITR配体(GITRL)也分别被克隆出来2-3。Shimizu 等4报道GITR 持续高表达于CD4+CD25+Treg表面, 并能有效地消除Treg细胞的免疫抑制功能。Patel等5以抗GITR单抗注入关节炎鼠模型后，炎症恶化，同时伴有肿瘤坏死因子、干扰素、胶原特异性IgG1的升高。此外，GITR单抗刺激同样可以加剧卵清蛋白(OVA)诱导的鼠哮喘模型的气道炎症，多种炎性细胞因子分泌增多。在体外试验中，研究者观察到转录因子Tbet和GATA3的表达。这些试验结果均提示GITR信号参与Th1和Th2的炎症反应。因此GITR/GITRL在免疫调节中的作用,以及GITR与Th细胞的相关性受到免疫学研究者的高度关注。但是近年来的相关研究结果多数是在动物细胞和动物模型上获得的, 有关人类GITR/ GITRL在免疫调节中的作用, 特别是在变态反应疾病等病理情况下如何变化的研究报道不多。因此，我们采用实时荧光定量PCR技术检测变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)患者外周血单个核细胞中GITR mRNA的相对表达水平，从而探讨其在变应性鼻炎中的表达变化以及其与变应性鼻炎发生、发展的相关性。1 材料和方法1.1 研究对象1.1.1 变应性鼻炎患者未治疗组 按照中华医学会耳鼻喉科学分会2004年兰州会议变应性鼻炎诊断标准6，选择2008年1月至2008年10月在镇江市第一人民医院就诊的23例患者，男12例，女11例，年龄1256岁，平均34岁，均有变应性鼻炎典型症状，经过粉尘螨、屋尘螨、豚草等20种常见阳性变应原血清特异性IgE检测，至少一种为阳性。1.1.2 正常对照组 24例中，男11例，女13例, 年龄1642岁，平均28岁。均无变应性鼻炎病史及哮喘、特应性皮炎等其他变应性疾病史，变应原血清特异性IgE过筛试验检测阴性。1.1.3 临床缓解组 为AR发作期患者经皮质类固醇激素鼻喷剂等药物治疗后临床症状缓解1月后复诊，并经表1疗效评分标准显示为有效或显效的患者。AR临床治疗缓解组患者的筛选根据症状和体征记分评定疗效，记分方法见表1。表1 AR症状和体征评分方法疗效评定标准:治疗前总分-治疗后总分治疗前总分100%计算值66%为显效，65%26%为有效，25%为无效。23位AR未治疗组经治疗后17例显效，3例有效，3例无效，20例有效或显效患者停药1月后有3例重新出现部分症状且评分低于显效标准。我们去除无效及症状复发的，取17例(男8例，女9例, 年龄1248岁,平均年龄31岁)显效和有效且停药1月症状未复发的为临床缓解组。1.2 主要试剂和仪器Trizol(Invitrogen公司)，Ficoll淋巴细胞分离液(天津灏洋生物技术有限公司)，逆转录试剂盒(ToYoBo公司)，SYBR Green I Real Time PCR Kit(杭州Bioer公司)， rTaq酶、dNTP、10缓冲液、pMD18T(TakaRa公司)，Rotor Gene RG 6000荧光定量PCR仪(澳大利亚Corbett公司)。1.3 标本处理取外周静脉血5 ml经肝素抗凝后，按照Ficoll淋巴细胞分离液说明书操作分离PBMC，然后，加入1 ml Trizol试剂裂解细胞，严格按照说明书操作提取PBMC中总RNA。最后，利用逆转录试剂盒将总RNA逆转成cDNA，其中，在20 l的逆转反应体系中加入1 g总RNA为模板，合成的cDNA于-80冰箱保存备用。1.4 引物设计及合成利用primer primer 5.0软件根据NCBI 基因库中GITR 和肌动蛋白mRNA序列分别设计定量PCR引物，其中GITR：上游5GGGTCGGGATTCTCAGGTCA3;下游5CGGGTTTCAAGAGCCCACAG3;扩增片段103 bp。肌动蛋白：上游5CACGAAACTACCTTCAACTCC3;下游5CATACTCCTGCTTGCTGATC3;扩增片段262 bp。1.5 构建标准质粒以上述制备的cDNA为模板，利用PCR扩增GITR 和肌动蛋白，反应体系均为10缓冲液 2 l，dNTP1.6 l，上下游引物(20 mol/L)各0.2 l，cDNA模板1 l， rTaq酶(5 U/l)0.2 l，ddH2O补足至20 l。其中GITR反应条件：94 5 min，94 30 s，63 30 s，72 30 s，共40循环。肌动蛋白反应条件：94 5 min，94 30 s，56 30 s，72 30 s，共30循环。以上述PCR产物分别与pMD18T载体进行TA克隆，并将筛选出来的阳性克隆稀释后作为标准质粒于-20冰箱保存备用。1.6 制备标准曲线以上述稀释的标准质粒作为模板在荧光定量PCR仪上采用四步法进行SYBR Green实时定量PCR来制备标准曲线7。反应体系如下: 2SYBR 混合物10 l，上下游引物(20 mol/L)各0.2 l，Taq酶0.12 l，cDNA或标准质粒1 l，ddH2O补足至20 l。其中，GITR反应条件：94 5 min，94 30 s，65 30 s，72 30 s，88 8 s，扩增40循环。肌动蛋白反应条件：94 5 min，94 30 s，56 30 s，72 30 s，86 8 s，共30循环。1.7 标本GITR mRNA相对表达量测定将标本cDNA与标准质粒按照上述反应体系和反应条件同时进行扩增,根据标准曲线分别检测标本中GITR和肌动蛋白mRNA拷贝数/l，最后以肌动蛋白为参照来校准目的基因GITR相对表达。1.8 统计学处理3组数据比较利用SPSS12.0软件中KruskalWallis H 检验 ，3组数据进行两两比较利用Nemenyi法检验，采用Spearman秩相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 AR未治疗组、AR临床缓解组和正常对照组GITR mRNA相对表达的比较AR未治疗组、AR临床缓解组和正常对照组3组GITR mRNA相对的表达结果如图1所示。3组间GITR mRNA相对表达水平比较差异有统计学意义(2=13.71，P<0.01)。其中，AR未治疗组GITR mRNA相对表达水平明显高于临床缓解组和正常对照组(2=7.80，P<0.05;2=12.43，P<0.01)。而临床缓解组GITR mRNA相对表达水平与正常对照组相比较，差异无统计学意义(2=0.056，P>0.05)。2.2 AR患者GITR mRNA相对表达水平与症状体征记分相关性分析AR患者未治疗组GITR mRNA相对表达水平与症状体征记分相关性如图2所示，两者呈正相关(n=23,r=0.534,P<0.01)。3 讨 论GITR在鼠和人Treg细胞上组成性高表达8-10,在小鼠体内，活化GITR信号，可遏制多克隆的或抗原特异性的鼠Treg细胞的抑制功能9，而在人类，GITR信号并不干扰Treg的抑制活性，这显示GITR信号对Treg细胞的作用有着物种间的差异11。然而，无论在小鼠还是人类，在受到刺激后，Th细胞表面GITR的表达均出现上调11，且GITR信号与CD28的共刺激信号还有一定的协同作用12，表明GITR信号对效应性T细胞具有明显的活化作用，参与了效应性T细胞的炎性反应。变应性鼻炎是耳鼻咽喉头颈外科的常见病之一，临床上以鼻痒、喷嚏、鼻分泌亢进、鼻黏膜肿胀为主要特点，可分为常年性变应性鼻炎和季节性变应性鼻炎, 其中约20 % 为季节性，40 % 左右为常年性，其余约40 %为两者并存13。该病发病率有逐年增加的趋势13。细胞因子在气道变态反应疾病的免疫病因学中起着重要的作用, 呼吸道上皮细胞是呼吸道炎症应答反应的主要调节者, 前炎症因子、介质和环境因素如病毒、过敏、吸烟和空气污染等刺激使呼吸道上皮细胞产生生物活性介质, 参与了免疫调节及炎性反应14。综上研究，理论上讲GITR信号与变态反应疾病应该是有密切相关性的，而目前现有的证据仅停留在实验阶段。尽管GITR在免疫调节中的作用仍未完全清楚，但本研究通过实时荧光定量PCR方法检测，显示AR未治疗组GITR mRNA相对表达水平明显高于临床缓解组和正常对照组，临床缓解组GITR mRNA相对表达水平与正常对照组相比较差异无统计学意义，提示变应性鼻炎患者体内由于GITR信号的活化抑制了 Treg细胞，免疫调节功能下调，使得Th2细胞逃脱了抑制，从而造成了免疫紊乱，产生了一系列临床症状，而治疗后症状缓解的患者GITR mRNA表达水平恢复正常，Treg细胞发挥正常免疫调节功能，抑制了Th2细胞，从而抑制了变应性鼻炎的发病过程。但这种表达水平的下降与症状缓解之间的联系是由GITR信号变化所引起，抑或由皮质类固醇激素对免疫系统的调节所引起，目前还不能肯定，因为尽管我们在使用皮质类固醇激素治疗后停药1个月，仍然不能完全忽视其在免疫反应中可能产生的作用。同时，尽管本研究提示AR患者GITR mRNA相对表达水平与疾病的发生、发展有一定的相关性，但为证明GITR在变应性疾病中的作用，我们将利用GITR多克隆抗体进行进一步的实验15。总之，本次研究认为GITR可能参与了AR的病理过程，从而为深入研究AR免疫调节病理机制奠定了一定基础，为临床治疗变态反应疾病提供了新的思路。【参考文献】 1 Nocentini G, Giunchi L, Ronchetti S,et al. 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