中药制剂分析第十章、中药制剂分析的新方法与新技术简介.ppt

第十章,中药制剂分析的新方法与新技术简介,第一节 高分辨气相色谱,高分辨气相色谱法（HRGC），又叫毛细管柱气相色谱法。内径为0.1-0.6mm，长达10-100m。分为开管型和填充型毛细管柱。 一、开管柱类型 （一）普通开管柱 1、壁涂层开管柱（WCOT柱）：内径0.1-0.5mm，柱长15-90m，最长达300m。经典WCOT柱通常是将固定液直接涂在玻璃或不锈钢毛细管内壁上而成。WCOT柱涂与柱壁极性相反的固定液很困难，且热稳定性差，柱寿命短，因此经典WCOT柱的应用和发展受到限制。 现在的WCOT柱一般都是先对玻璃或石英毛细管内壁进行表面处理后，再涂渍固定液。,2、载体涂层开管柱（SCOT柱）制备方法是将载体，如硅澡土、石英粉等惰性物质粘在事先涂有机胶的厚壁玻璃管内壁上， 600700下拉制成中空的毛细管。 该柱的优点是易于涂渍各类固定液，制柱重复性好，柱效较高，柱容量较大，可作痕量组分分析；固定液细吸着牢固，柱寿命较长，近年来生产的交联弹性石英开管柱是当前最佳的SOCT柱。 （二）大内径厚液膜开管柱 常见的大内径厚液膜开管柱是内径为0.320.6mm,固定液膜厚度约为0.55m的交联型WCOT柱。,二、基本管理 （一）开管柱速率方程 开关柱速率方程：H=B/u+(Cg+C1)u H为理论板高，u为载体气线速度（cm/s）,常数B/Cg和C1分别为组分分子的纵向扩散、气相传质阻力和液相传质阻力。 （二）主要色普条件的选择 1、柱效能 柱长一定时，理论板高H越小，则柱效越高。 2、载气流速 柱内径小的开管柱，更适于快速分析。 3、柱内径 柱内径越小越好，但常用的开管柱柱内径为0.250.53mm，柱内径太小，渗透性差，固定液涂渍量降低，柱容量小。,4、液膜厚度 减小df可减小液相传质阻力C1，是提高柱效的重要方法。 5、柱温 柱温的影响和填充柱气色相色普类似，尽可能在低柱温下操作。但柱温不可太低，否则k值太大，分析时间加长。 6、进样量 可见最大允许进样量与柱内半径、柱长和容量因子成正比，与理论搭板数成反比。 三、色谱柱评价 一支好的开管柱应该是选择性好、柱效高、热稳定、柱子惰性。柱子的选择性主要通过对要分离的对象进行考察，涉及固定液和柱温的选择。,1、柱效 柱效可用理论塔板数和涂渍效率来评价。 表征柱效常用理论塔板数（n）和有效理论塔板数（neff）表示。越大，柱效越高，所得色普峰越窄、越尖。柱效也可用理论板高H和有效理论板高Heff表示。n或neff越大，柱效越高，所得色谱峰越窄、越尖。柱效也可用理论板高H和有效理论板高Heff表示。,2、热稳定性 在开管柱上进行分离分析，大多数是在较高柱温下或采用程序升温来实现的，因此柱的热稳定性必须良好，要求高温条件下固定液保持稳定，即其流失和分解最小，并能使固定的惰性表面层上的固定液膜保持厚薄均匀，不会变成液滴，这样方可保证柱效不下降。柱效稳定性一般用程序升温基线漂移信号或GC-MC中总离子流基线漂移等来评价，也可在连续使用过程中某一组分的k和n及峰对称性来评价。,3、柱惰性 它是反映柱子的去活性（即为吸附活性和催化活性）。惰性好的柱子所得的峰形对称，并给出定量的响应。柱惰性主要取决于柱管的材料和处理方法。 四、进样方式 1、分流进样 目前应用最广的进样方法。它适用于分析浓度高、各组分的浓度相近的混合物。 优点：适合大多数类型的样品，且使用方便。 缺点：不适于痕量分析和宽沸程样品。 2、不分流进样 优点：特别适用于痕量分析，对宽沸程样品也能得到满意的结果。 缺点：操作较难，必须利用溶剂效应或冷阱；受溶剂的选择和起始柱温的限制；洗脱时间很严格，且不能定量收回。,3、柱头进样 它是一种针对分流和不分流进样的缺点而设计的进样方法。 一般采用冷太柱头进样。 优点：是对于对热不稳定、稀的和宽沸程的样品比较理想，且能给出定量结果。 缺点：是样品中的非挥发性组分在柱中积累，导致柱变性和柱效损失，缩短柱寿命。 4、直接进样 它是指样品在进样器中快速蒸发进样的方法。 优点：适用于分析浓度范围要比不分流进样宽一个数量级以上的样品，并可缓慢地直接进样；在分析很稀地大体积样品时无需先浓缩；进样器温度可较低，利于热不稳定样品的分析；载气和样品无需分流，故载气耗量小，分析所需药品量也小。 缺点：当样品中含有挥发性低的组分时难于定量分析。,第二节 顶空气相色谱法,顶空气相色谱法（顶空GC）也叫液上气相色谱法或顶空分析法。它是对样品基质上方的气体成分进行GC分析来测定这些组分在原样品中的含量。顶空GC通常包括三个过程：即取样、进样和GC分析。 常用的方法是样品中不断地通人惰性气体（称气体萃取剂），挥发性成分即随萃取气体从样品中溢出，然后由一个吸附装置（捕集器）将其收集，再解析后进入GC仪进行分析。,一、顶空GC装置 （一）静态顶空GC装置 该装置由顶空进样装置和GC仪组成，其中进样装置分为手动进样和自动进样两种，现分述如下： 1、手动进样 主要部件是样品瓶、恒温槽和取样装置，其取样装置可以是气密性好地注射器或气体进样阀和注射器结合的装置。 2、自动进样装置 常见的两种是压力平衡顶空进样装置和压力控制定量管进样装置。,3、静态顶空进样应注意的问题 气体样品的保存温度低于采样温度，顶空进样时要防止汽化不完全。液体和固体样品应注意“基质效应”的影响。 样品量主要影响平衡时间和相比。 平衡温度主要影响被测组分蒸气压，即分配系数K。 平衡温度高，液体粘度低，固体样品粒度较小和机械搅拌，则平衡时间短。 样品瓶壁和密封盖不要有吸附，反复使用时注意保证清洁干净和密封盖不漏气，其容量最好准确测量，其体积视识样品情况和GC进样体积大小而定。,（二）动态顶空进样装置吹扫捕集进样器 吹扫捕集技术分析的样品多为水溶液。 为了确保动态顶空GC的分析精度，应严格控制样品处理、吹扫温度、捕集器温度和连接管温度、吹扫时间和吹扫气流速等操作条件。 三、定量分析技术 GC常用的定量方法归一化法、内标法和标法,第三节 高效毛细管电泳,高效毛细管电泳（HPCE）是20世纪80年代发展起来的一类高效快速的分离分析方法，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，HPCE的主要特点是：高效，高速，微量，仪器操作简单，低耗，应用范围广 基本原理 （一）电泳与电渗 电泳是在电场作用下，带电粒子在缓冲溶液中作定向移动，也称电迁移。迁移速度（ep）用下式表示： epep .E 式中E为电场强度，ep为电泳淌度。 电渗或电渗流是指管内溶液在外加电场作用下整体朝一个方向运动的现象。,电渗的大小可用电渗速度或电渗淌度来表示。 eoeo .E=E/ 式中eo为电渗迁移速度，为溶液的介电常数，为双电层的Zeta电位（即固定相发生相对移动的平面与本体溶液间的电势差），E为电场强度，eo为电渗流的离子淌度（eo=/）。 在毛细管电泳中。电渗与电泳同时存在，不考虑二者的相互作用，则粒子在毛细管内的迁移速度是电泳和电渗的矢量和： ap=ep+eo=(ep+eo)E=ap.E ap为粒子的表观迁移速度，ap为粒子的表关淌度，二者可通实验测得活求得。 在HPCE中，多数情况下，电渗速度是电泳速度的5-7倍，因此，利用电渗流可将正负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移而使其分离。,（二）分析参数 1、迁移时间 就是样品组分从进样口迁移到检测窗所需要的时间（tm） tm =l/=l/(ep+eo)E=lL/V 式中的l为毛细管有效长度；L为毛细管总长度；E为电场强度；V为操作电压VEL。 2、理论塔板数 HPCE的分离效率用理论塔板数n表示。 n（ep+eo）Vl/2DL D为粒子在区带中的扩散系数。 n=16(tm/W)2=5.54(tm/w1/2)2 式中的tM为粒子的迁移时间，W为宽峰，W1/2为办宽峰。,3、分离度 分离度是指将淌度相邻近的组分分开的能力 Rs=2(tm2_tm1)/W1+W2 式中的RS为分离度，tm1、tm2分别为相邻两个组分的迁移时间，W1、W2分别为相邻二组分的峰宽。 二、常见的毛细管电泳模式 （一）毛细管区带电泳（CZA） 毛细管区带电泳的特点是操作简单，快速，分离调率高，应用范围广，从理论上讲可用于所有具有不同淌度的荷电粒子的分离，分子量从十几的小子到十几万的生物大分子。,（二）胶束电动毛细管色谱 胶束电动毛细管色谱（MEKC）是以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的巧妙结合。 （三）毛细管凝胶电泳 毛细管凝胶电泳（CGE）是用凝胶物质作为支持物进行的区带电泳。它将凝胶电泳对生物大分子的高分离能力和毛细管电泳的快速、微量和定量相结合，成为现代分离度极高的一种电泳分离技术。从理论讲，凝胶是毛细管电泳的理想介质，其粘度大、抗对流、能减少溶质的扩散，从而可以限制谱带的展宽，所得峰形尖锐，柱效高。,（四）毛细管等电聚焦电泳 毛细管等电聚焦电泳（CIEF）是一项根据等电点差别进行对蛋白质或多肽分离电泳技术。CIEF能分离等电点差异小于0.005PH值的蛋白质。 （五）毛细管等速电泳 毛细管等速电泳（CITP），是一种“移动界面”电泳技术，在CITP中采用两种不同的缓冲溶液系统，一种是前导电解质，充满整个毛细管柱，另一种称尾随电解质，置于一端的电泳槽中，前者的淌度高于任何样品组分，被分离的组分按其不同的淌度夹于其中，以一个速度移动，实现分离。,（六）毛细管电色谱 毛细管电色谱（CEC）是将HPLC中的各种型号的固定相微粒填充到毛细管中作为固定相，以电渗流为流动相的驱动力，由于样品和固定相之间相互作用的差异而分离。 三、高效毛细管电泳仪 （一）高效毛细管电泳仪的基本结构 主要由毛细管柱、高压电源、进行系统、检测系统和数据处理系统组成。,（二）检测器 1、紫外可见光检测器 紫外检测器是高效毛细管电泳嘴常见的一种检测器，原理是根据Lambert-Beer定律，常见的有固定波长、可见波长和快速扫描检测三种类型。固定波长检测器一般用贡灯作光源，可变波长和快速扫描检测器常用氘灯、钨灯作光源，波长范围190800nm。 2、荧光检测器 荧光检测器也在柱上进行，荧光检测尤其激光诱导荧光是目前灵敏度最高的一种检测方法，有的甚至可对单细胞中的核酸进行定量测定，对于荧光效率较高的物质可达到但分子检测。 3、电化学检测器 根据检测器原理的不同又可分为电位检测器、电导检测器和安培（电流）检测器三种。 4、质谱检测方法 HPCE应用质谱检测，灵敏度高，专属性强，且可提供分子结构信息，对分析复杂大分子混和物样品更为有用。,（三）进样技术 常见的最简单的进行方式主要有电动进样和气动进样，这两种方式试用于CZE、CGE和MEKC 1、电动进样 是利用电渗机制使样品在外加进样电压的作用下，沿毛细管内壁进入毛细管。这两种方式对粘度较大的样品更为适用，但重现性较差。 2、气动进样又称压差进样或动力进样，是通过毛细管两端差来实现，即利用毛细管虹吸原理进样，只要将毛细管插入缓冲液，准确记时，即可控制进样体积。,第四节 超临界流体色谱,超临界流体色谱 是以超临界流体作为流动相的色谱方法，所谓超临界流体，是指在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态。 一、基本原理 （一）超临界流体的特征 对于某些纯物质来说，具有三相点和临界点，物质在三相点，气、液、固三态处于平衡状态，当处于临界温度和临界压力以上，则不伦施加多大压力，气体也不会液化，此时既非气体，也非液体，而是以超临界流体形式存在。,（二）、色谱分离原理与效能 SFC以超临界流体为流动相，以固体吸附剂（如硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）的高聚物为固定相，混和试样在SFC上基于各组分在两相间分配系数的不同而得到分离。 二、超临界流体色谱仪 （一）、高压泵 高压泵是输送超临界流体的关键部件，一般采用注射泵，以获得无脉冲、小流量的流动相输送，超临界流体源在进入高压泵之前要进行预冷却。,（二）进样系统 SFC一般采用类似于HPLC的手动或气动进样阀，样品溶于适当的溶剂后即可注入样品阀进样。 （三）色谱柱 1、填充柱 填充柱与HPLC柱相似，基于分配平衡实现分离，柱长可达25cm，分离柱内径05.4.6mm。 2、毛细管柱 较常用的填充毛细管柱内径0.5mm,柱长为1030mm。 （四）检测器 对于SFC色谱，气相及液相色谱所用检测器在一定条件下几乎都可以使用。 1、气相色谱检测器 以FID为多用，在SFC也可以使用氮磷检测器（NPD）、火焰光度检测器（FPD）等。,2、液相色谱检测器 紫外检测器（UVD）是用改性剂流动相的填充柱SFC的最常见的检测方法。 如使用毛细管柱，UVD的流通池可由一段熔融石英毛细管构成，内容积在200L左右，这样不会影响柱效；荧光检测器（FD）也可以如此应用。对于填充柱，蒸发光散射检测器也是一种常用的通用检测器。,三、流动相和改性剂 （一）流动相 SFC的流动相为超临界流体，超临界流体的主要特点是在不同压力下对各种样品有不同的溶解能力。 几种常用的超临界流体的溶解能力在相同的压力条件下顺序是：乙烷二氧化碳氧化亚氮三氟甲烷，在相同条件下其分离能力是：二氧化碳氧化亚氮三氟甲烷乙烷。 CO2是最常用的流动相。 （二）改性剂 在SFC中，弱极性或非弱极性超临界流体流动相如CO2，对于一些极性化合物的溶解能力较差。为了加强其对极性溶质的溶解和洗脱能力，常常向其中加入一定比例的极性溶剂（称为改性剂），以甲醇最常用，其次是其他脂肪醇。,第五节 色谱联用技术,一、多维色谱 （一）二维平面色谱法 二维平面色谱法是将样品在正方形薄层板或滤纸等平面层上的一角，按通常方式展开。两次展开的流动相可以相同，亦可以不同。第一展开方向分离得到的斑点，作为第二展开方向时的“原点”。采用这一技术甚至可能在第一法方向展开后、第二方向展开前，对色谱进行改性，使之在两项展开中具有完全不同的选择性，从而使在第一方向展开后未得到分离的组分，在第二方向展开中得到进一步分离。,（二）多维气相色谱法 多维气相色谱法（MDGC）是指使用两根以上的色谱柱或两个以上的检测器，通过阀切换或改变个柱前后压力来改变载气流向的方法，使能得到壁单柱系统更多得分离信息。 （三）多维液相色谱法 多维液相色谱法与多维气相色谱法类似，其关键技术使柱切换。 二、气相色谱质谱联用技术 （一）概述 气相色谱质谱联用（GCMS），始联用技术中最活跃得方法之一，它的最大优点是使样品的分离、鉴定和定量一次完成，对中药分析的发展起到了很大的促进作用。,（二）质谱单元 用于GCMS联用的质谱仪主要由离子源、质量分析器、检测器和数据处理系统组成。 1、离子源 （1）电子轰击源（EI）：这种离子源的特点使电离效率高，能量分散小，结构简单，操作方便，所得MS图具有特征性。 （2）化学电离源（CI）：其特点是分子离子峰强度较弱，而M+1峰却很强，以此可获得有关分子量信息，也可用之判断化合物的主体结构。 （3）其他类型的离子源：用于联用系统的还有场致离子源（FI）、场解吸附源（FD）解析化学电离源（DCI）等。,2、质量分析器 质量分析器的作用是将电离室中形成的离子按其质荷比（m/z）的大小分开，以进行质谱检测，联用系统中常用的质量分析器主要两种。 （1）四极杆质量分析器 （2）磁式质量分析器 （三）接口技术 1、直接偶合法 2、浓缩性接口 3、开口分流形接口,（四）色谱单元 1、色谱柱 色谱柱有填充柱和空心柱 2、载气 所用的载气应是化学惰性，对MS检测无干扰。 3、样品量 正常的样品量应以不超载为限，但有时为了对小组分检测，也可过量进样。 4、接口温度 一般略低于柱温 （五）应用与示例 1、GC-MS联机分析的信号参数 （1）色谱保留值 （2）总离子流色谱图（TIC） （3）质量色谱图（MC） （4）选择离子检测图（MF） （5）质谱图,2、分析方法 （1）未知物的MS如图解析，首先验证最高m/z峰是否为分离子高峰，如不是，可借助其他信息，根据“N-规律”、同为素峰、Beyono表等可拟处的分子式；再由分子离子峰和主要碎片离子推断分子具有的特征基团和基本骨架，拟出可能的结构式；最后再与标准谱图进行对照，通常使用的是库谱检索法。 （2）定量分析，大多数质谱定量分析是基于比较样品中待测组分的离子流和内标物的离子流强度记录离子流的方法，通常为选择性离子监测，此法灵敏度很高。,三、气相色谱红外光谱联用技术 （一）概述 （二）红外光谱单元 用于联用系统的光谱仪主要由光源、干涉仪、检测器、数据处理系统和谱图检索系统组成。 （三）接口技术 1、流通池（光导管）接口 2、冷阱接口 （四）色谱单元 1、色谱柱 2、进样 3、载气 4、柱温,（五）应用与示例 1、GCFTIR数据采集与处理GC-FTIR可获得的信息参数主要有： （1）色谱保留值 （2）重建色谱图 四、液相色谱质谱联用技术 （一）概述 高效液相色谱质谱联用技术既是以质谱仪为检测手段的色谱技术，它集HPLC高分离能力与MS高灵敏度、强选择性于一体，是一种强有力的分离分析工具。,（二）接口技术 1、直接液体导