《研究氨基酸生产》PPT课件.ppt

用遗传学与生理学相结合的方法 研究氨基酸生产,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,2,前 言 对微生物的代谢途径及代谢网络进行有目的的改造从而提高氨基酸的产量仍然是现代生物工程学的一个主攻目标。为了攻克这个目标，就有必要对尚待进一步完善的细胞生理学、生物化学、分子生物学及生物过程工程等学科的基本状况做一番描述，主要有如下几个话题:,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,3,与生物工程相关的氨基酸产生菌的相关途径的研究进展情况，其中必须包括这些途径的代谢调节以及细胞的整个调节网络的研究进展情况。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,4,对所有的相关途径进行详细的代谢流量分析。这涉及到基质进入细胞的碳架物流量，流经向心途径、中心代谢途径和离心途径的碳架物流量，以及代谢中间产物流出细胞的碳架物流量 （ the central and peripheral carbon fluxes）。 还原力的流量 （ redox flux ）及能量流量（energy flux）。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,5,以协调和调节的方式对碳架流、氧化还原反应的电子流、能量流进行导向，以提高基质的吸收能力、限制前体物向支路途径的流量、减少中间产物的积累及副产物的形成，还要绕过氧化还原平衡及能量平衡中可能出现的难题。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,6,传统的设计育种（ 随机诱变加定向筛选），以及DNA重组技术在设计育种中的应用已经大大提高了 微生物对氨基酸的生产能力， 但人们对于氨基酸产生菌的生理学与生物化学等 主要领域的基础知识还相当匮乏。 目前可从以下几方面理解氨基酸的代谢基础：,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,7,具有生物工程学重要性的微生物的基本代谢途径及其对应的酶的性质； 酶及其调节方式，途径及其调节方式； 中心代谢途径及离心途径代谢流量的定量分析； 对跨膜传送（基质吸收和产物分泌）的详尽的了解。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,8,目的产物的合成途径是理解氨基酸生产的前提和核心内容 。相关的代谢途径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸的合成的专用途径，也包括提供前体碳架物的途径、从专用途径分流最终导致副产物生成的分支途径、相应氨基酸自身被降解的途径、以及那些提供还原力和代谢能量的途径。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,9,除了以上这些反映代谢途径基本信息的资料外，代谢流量的相对固定的分布以及代谢流量的动力学响应同样是至关重要的。这既涉及到中心代谢途径（提供碳架物质、还原力及代谢能）的代谢流的定量分析，又涉及到特定氨基酸专用的合成途径的代谢流的定量分析。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,10,此外，基质吸收和目的产物输出等有方向性的跨膜反应对于氨基酸的生产也是极其重要的。除大肠杆菌外，一般工业微生物基质吸收方面的知识是相当欠缺的。氨基酸跨膜输出的研究领域近年才受到关注。方向性的跨膜反应的机理、微生物能学及氨基酸分泌的调节等方面的知识对于理解氨基酸生产过程也是相当重要的。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,11,我们将一起回顾发酵法生产氨基酸的代谢基础的建立过程，一起讨论代谢流量分析对于了解细胞生理的意义和氨基酸生物合成的代谢工程，还将一起讨论跨膜输送方面为数不多的研究工作，以及这方面研究对于微生物过量合成氨基酸的意义。在此基础上，讨论以氨基酸为目的产物的微生物代谢设计的新进展和新方法。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,12,1. 氨基酸生产的代谢基础 2. 氨基酸生物合成的代谢流量 分析 3. 基质的跨膜吸收与氨基酸的 跨膜输出 4. 氨基酸生产的代谢设计,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,13,氨基酸生产的代谢基础 1.1 氨基酸的生物合成 1.2 代谢产物生产的生理学,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,14,1. 1 氨基酸生产的代谢基础 氨基酸的生物合成涉及以下5个方面： （1）基质吸收； （2）进入中心代谢途径前的准备途径； （3）经中心代谢途径产生碳架化合物（氨基酸的前体化合物）、还原力（如NADPH、NADH ）和代谢能（ ATP 和磷酸烯醇式丙酮酸等）；,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,15,（4）通过同化（ 合成） 途径将碳架化合物转化成目的氨基酸，此过程涉及到还原力与代谢能的供需平衡，同时也涉及主要载流途径与分支途径之间的关系； （5）目的氨基酸的跨膜输出等； （6）目的产物进一步代谢的途径。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,16,谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成是研究得最为广泛的。图 2 列出了谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物合成相关的途径及重要步骤的代谢调节情况。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,17,图1. 微生物细胞合成氨基酸的相关途径及代谢调节示意图,其中，各相关酶及途径水平上的代谢调节，以及整个细胞水平上的全局调节对于代谢流的导向和改造是至关重要的。对微生物整个代谢网络进行有目的的改造和设计涉及到大范围的遗传改造。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,18,该同化（合成）途径通过草酰乙酸 （OAA）与中心代谢途径相接，天冬氨酸是该族氨基酸的共同前体物。 来自回补途径及TCA 环的草酰乙酸， 进入合成途径并在天冬氨酸 - 半醛（ ASA）处分为两条支路，一条通往赖氨酸，另一条通往苏氨酸、蛋氨酸（ 甲硫氨酸 ）及异亮氨酸。该途径上主要调控点是天冬氨酸激酶（ AK ），其他重要的酶包括高丝氨酸脱氢酶（ HDH ） 和苏氨酸脱氢酶（TDH）。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,19,再往后的流量控制点是是通往赖氨酸 DDP合酶（见图中DHDPS） 以及赖氨酸的需能输出。要获得令人满意的结果，必须全面考虑这些方面，仅仅对于个别反应（即便是最重要的调控点）进行改造并不是理想的方法，Broer 等曾将脱敏的 AK 的基因导入野生菌中进行表达，但并未获得很令人满意的赖氨酸产量。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,20,该途径上另一值得关注的特征是从六氢吡啶二羧酸出发合成二氨基庚二酸的旁路途径的出现，借助于 NMR 手段已经得知，旁路的出现依赖于某些代谢条件，特别是可利用的NH4+的存在。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,21,另一个重要的方面是参与特定氨基酸合成途径及与之相关的其他代谢途径的酶的调节特性，包括酶活力的调节和酶的表达的调节。特别是必须详细研究中间产物或终端产物对途径起点或分支处的关键酶的调节。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,22,图2.,天冬族氨基酸的生物合成及代谢调节.,(其中 表示反馈抑制； 表示反馈阻遏),I,R,缩写符号： ASA为天门冬氨酸-半醛，Hse为高丝氨酸，SucAKPA为琥珀酰二氨基庚二酸；AK为天冬氨酸激酶，DHDPS为二氢吡啶二羧酸合酶，HDH为高丝氨酸脱氢酶，HK为高丝氨酸激酶，TDH为苏氨酸脱氢酶，AHAS为乙酰羟酸合酶； PEPS为PEP合成酶，PK为丙酮酸激酶，PC为丙酮酸羧化酶，OAADC为草酰乙酸脱羧酶，PEPC为PEP羧化酶，PEPCK为PEP羧激酶。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,23,要想根据细胞粗提取液的测定结果对这些酶的调控性质做出适当的解释是靠不住的。这一方面是因为它们在这些条件下可能不稳定；另一方面，对于需要什么样的辅因子才能保持它们的活性或（和）它们在缓冲液中的稳定性，也知之甚少；而且特别是因为在抽提的过程中，那些参与胞内酶活性调节的必需因子会丢失。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,24,谷氨酸棒杆菌中存在 - 酮戊二酸脱氢酶便是一例。人们最初认为这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存在。正因为如此，才出现了这样的假设，即：TCA 环在该处的中断引起 - 酮戊二酸的 “ 溢出 ”， 最终导致谷氨酸的分泌。后来才弄清这个酶在谷氨酸棒杆菌中实际上是存在的，但是它似乎很不稳定。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,25,另外，在关于代谢流的研究中有迹象表明，在谷氨酸棒杆菌中-酮戊二酸脱氢酶的活性已被调低了（dawn-regulated）， 但这在细胞抽提物中至今不能得到证实。进行详细的代谢流量（包括相关中间产物的流量）分析，或许是解决这一问题的唯一办法。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,26,正确描述代谢网络的主要节点的调控模式是十分必要的，但常常是十分困难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸节点的复合模式就是最好的例子。谷氨酸棒杆菌中PEP、PYR和OAA所构成的 “ 奇异三角区 ”（magic triangle）是研究的热点 。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,27,Glc,PEP,PYR,AcCoA,OAA,G6P,Glc,注： PK, PC, PEPC, PEPCK, OAADC, PEPS, PTS,奇异三角区,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,28,PEP通过PYR和AcCoA向TCA环提供C2单位，同时，PEP、PYR 以及 AcCoA 还通过回补反应（ 通过乙醛酸环）为TCA环提供重要中间产物，这些回补反应对于以TCA环代谢中间产物 为前体的氨基酸的生产来说是非常必要的。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,29,该区包含可能有多达七个酶的参与，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ PEPCK ）、丙酮酸激酶 （ PK ）、 草酰乙酸脱羧酶 （OAADC ）和磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移酶系统（PTS）都已得到鉴定，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶（ PEPS ）已被假定存在。丙酮酸羧化酶（ PC ）的存在已得到代谢流量分析的实验数据的支持。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,30,合成代谢途径通常受反馈抑制和反馈阻遏的严格调控，比如 图2 中的AK、HDH、TDH、AHAS等。 不过，相对于大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌中的调节尤其是天冬族氨基酸合成途径的调节还是比较简单的。,2019/4/15,张星元：发酵原理（讲座）,31,研究表明，仅仅研究与合成途径直接相关的酶的调节以及还原力和能量的供给，以及对“瓶颈”处关键酶的解调节或过量表达仍是不够的。中心代谢途径和合成代谢途径，特别是合成代谢途径，同全局调控机制密切相关，如紧缩控制、营养阻遏、供氧控制、氮源调节、渗透压调节及生长阶段调节等。这些问题对于氨基酸的合成非常重要，但对它们了解得并不多。,20