《基因克隆的载体》PPT课件.ppt

基因克隆的载体,载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：,1、分子较小，可携带比较大的片段。 2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。 4、有适合的标记，易于选择。 5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。 6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。,载体,功能 克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断 表达载体: 用于一个基因的蛋白表达 整合载体: 把一个基因插入到染色体组中,载 体,来源： 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 真核细胞克隆载体,载体的种类和特征,第一节 质粒（plasmid）载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。,质粒（plasmid） 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数千碱基对。常 有1 3个抗药 性基因，以利于 筛选。,质粒载体,克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。,一、质粒的生物学特性： 1、质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA） 2、不同质粒的分子量大小差异相当显著： 106108D 3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分： 复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点,L,OC,SC,4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。 抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等 5、质粒DNA的类型： 接合型和非接合型；含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌 素抗性基因的R质粒；F因子和F因子等。,6、质粒DNA的复制类型： 低拷贝的质粒（13）：严紧型复制控制的质粒 （接合型） 高拷贝的质粒（1060）：松弛型复制控制的质粒（非接合型） 7、质粒的不亲合性 在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒的不相容性。 是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。,（二 ） 、质粒DNA的分离与纯化 1、氯化铯密度梯度离心法； 2、碱变性法； 3、微量碱变性法。,1.氯化铯密度梯度离心法 1、质粒DNA占总DNA的1%2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。,流程： 首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。 将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链的碱基中去。 在EB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。,2.碱变性法： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。 在PH值12.012.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。 通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA,3.碱变性法： 1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀； 2、加入100微升冰冷的液，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，45mg溶菌酶）静置5分钟； 3、加入200微升微冷的液（0.2NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。 65度水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作用。 4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠，振荡后，冰浴5分钟。 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。,4.影响质粒DNA产量的因素： 1、寄主菌株的遗传背景 使用endA基因发生突变的菌株，编码核酸内切酶 从野生型的菌株中提取质粒须采取的措施： 选择最适的培养条件，以限制在细胞生长期间，体内核酸内切酶 的表达； 在纯化质粒DNA的过程中，用加热法核酸内切酶使失活； 采用最佳的实验流程，减少核酸内切酶的污染并在纯化了质粒DNA之后，迅速除去污染的核酸酶。,2、质粒的拷贝数及分子的大小 插入分子量大的外源DNA会引起质粒拷贝数的下降。,（三）、质粒载体的构建与类型 1. 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标 的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含有一个EcoR酶切位点，一个四环素抗性选择记号（Tetr ），插入外源片断后不影响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。,ColE1质粒在其唯一的单切割位点EcoRl中克隆外源DNA片断后，可根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素E1的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌素E1的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。,2.质粒载体必须具备的基本条件 (1) 、具有复制起点； 自我增值的基本条件，一般具一个复制子。 (2) 、具有抗菌素抗性； 理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。 (3) 、具有若干限制酶切单一位点（CMS）； (4) 、具有较小的分子量和较高的拷贝数。 低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断 后仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因,以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。,（4363bp）,3.质粒载体的选择记号 新陈代谢特性； 对大肠杆菌素E1的免疫性； 抗菌素抗性； 四环素抗性、氨苄青霉素抗性、 链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因； 抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。,4.不同类型的质粒载体 高拷贝的质粒载体 克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因 低拷贝的质粒载体 有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。 编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。,(1)失控的质粒载体 复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。 Example： pBEU1和pBEU2质粒，在30度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过35度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续23小时。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒DNA占细胞总DNA的50%。,(2)插入失活型质粒载体 将外源DNA片断插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。 Example： 在pBR329质粒载体的EcoR1位点插入外源片断，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片断的重组体质粒的几率会显著上升。,(3)正选择的质粒载体 正向选择：应用只有突变体或重组体才能 正常生长的培养条件进行选择。 这种质粒载体具有直接选择记号 并可 赋予寄主细胞相应的表型。,Example： 质粒pKN80有来自Mu噬菌体DNA的EcoR1-C的片断，编码一种致死功能的kil基因。 该质粒在Mu噬菌体的溶源菌株中正常复制；在非溶源菌株中是致死的。 在Hind 或Hpa 位点插入外源DNA片断后，会产生具Ampr表型的Mu噬菌体的非溶源的转化子菌株。,正向选择质粒载体的条件限制： 1、需要特殊的寄主菌株或选择培养基 2、可使用的克隆位点少 3、 假阳性水平高 4、 不能够调节插入序列表达活性,(4)表达型的质粒载体,表达载体： 按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。,主要包括：大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。 待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末端这一头靠近启动子方向插入，才能在启动子控制下进行有效的转录。,四、重要的大肠杆菌质粒载体 1、pSC101质粒载体； 2、ColE 质粒载体； 3、pBR322质粒载体； 4、pUC质粒载体； 5. 其它的重要的质粒载体,1.pSC101质粒载体 一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有12个拷贝；分子量9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr ）。有Hind 、EcoR、BamH 、Sal 、Xho 、Pvu、 Sma 7种核酸内切限制酶。其中在Hind 、 BamH 、 Sma 3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr 基因失活。 是第一个真核生物的克隆载体。,（1）应用pSC101质粒作基因克隆载体 葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达 金黄色葡萄球菌的质粒p1258,编码若干种能 在大肠杆菌检测的结构基因；能被核酸限制酶 EcoR 切割成4段。,（2）应用pSC101质粒作基因克隆载体 在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA 用核酸内切酶EcoR 消化非洲爪蟾的核糖体DNA（ rDNA ），与EcoR 消化的pSC101质粒进行重组。 在挑取的55个转化子中，经 EcoR 酶切，电泳后13个转化子含有外源片断。转化率23.6,2.ColE 1质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝的质粒，能产生细菌素。细菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用（复制、转录、转译能量代谢等）。但含有对细菌素的免疫基因。,用 ColE 1质粒特征为基础建立的转化细胞系，存在一定的缺陷性： 1、应用大肠杆菌素免疫作为标记操作上不方便； 2、在细菌群体中，能够以相当高的频率自发的产生出抗菌素的突变体细胞。,3.pBR322质粒载体 “P”表示是一种质粒； “BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”; “322”表示实验编号。,pBR322的构建： 为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能力）,pBR322的结构来源,pBR322质粒载体的优点： 1、具有较小的分子量； 它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，,Example: a. 在pBR322质粒的BamH或Sal位点插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。,B X B,B,B,X,Ampr,ori,Amps,Tetr,ori,A,B,B,Tets,X,b.在Pst或Sca识别位点插入外源片断会导致Ampr基因的失活，产生AmpsTetr表型的质粒。转化大肠杆菌之后，获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Ampr表型的细胞可以合成 内酰胺酶，它能使青霉素转变成青霉酮酸，而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子，经37度培养过夜后，在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素 内酰胺酶Ampr的菌落，其周围的碘指示剂溶液变得明亮，而Amps菌落无此反应。,3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累10003000个拷贝。,pBR322质粒载体的改良 为了更加实用，人们对pBR322质粒进行了改良，得到许多pBR322质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。,应用pBR322质粒作为基因克隆载体 水稻叶绿体光诱导基因psbA的结构分析 基因psbA编码的蛋白质，与光合作用系统相关，并且它能与除草剂阿特拉津结合，它的第264位氨基酸发生取代反应，由丝氨酸变为甘氨酸，可导致其失去与除草剂阿特拉津结合的能力，推测是三维结构发生了改变 ；在原生生物衣藻、蓝色细菌中，此蛋白质在同一位置由丝氨酸变为丙氨酸的取代反应，会使他们获得对除草剂的抗性功能。 而且，非竞争条件下，对除草剂阿特拉津抗性的千里光属和苋属，干物质产量比敏感植物下降了25%和40%。,通过对基因psbA的体外操作，有可能创造出抗除草剂的或高光效的转基因植株。用pBR322质粒作为载体，成功的克隆了水稻的psbA基因。 首先将水稻叶绿体DNA，用EcoR内切酶消化，经含有溴化乙锭的熔点琼脂糖电泳，回收分子大小为1.82.5kb之间的DNA片断。 再与经过EcoR内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的pBR322质粒DNA连接。 然后转化给大肠杆菌，在氨苄青霉素的选择培养基上，形成Ampr转化子菌落群体。 用经32p标记的玉米psdADNA探针作菌落杂交，从1000多个菌落中筛选出8个阳性克隆。,对这8个阳性克隆进行进一步的Southern分析，表明6个片断带有长度为2.2kb的编码水稻叶绿体psdA基因。实际上其中1.2kb的片断编码着水稻psdA基因的全部序列。通过dna序列分析表明与高等植物的同原性在92%，与蓝色细菌同源性75%,4. pUC质粒载体 人们应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，组入了一个在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。,一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分： 1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）； 2、氨苄青霉素抗性基因（ampr ）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。 3、大肠杆菌-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ基因； 4、位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。,Ampr,ori,pUC18 (3 kb),MCS (Multiple cloning sites, 多科隆位点）,Lac promoter,lacZ,pUC质粒载体的形体图,pUC质粒载体的优点 第一， 具有较小的分子量和更高的拷贝数; 仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500700个拷贝。 第二，适用于组织化学检测重组体； 具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与- 互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。 第三，具有多克隆位点MCS区段 方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。,5.其它的重要的质粒载体 丧失迁移功能的质粒载体 能在体外转录克隆基因的质粒载体 穿梭质粒载体,（1）丧失迁移功能的质粒载体 第一：拥有较高水平的拷贝数,平均每个大肠杆菌寄主细胞可达3045份; 第二:失去了bom位点，即便在共存的F质粒提供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。,（2）能在体外转录克隆基因的质粒载体 pGEM-3Z是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体，总长度2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。 pGEM-3Z与pUC质粒之间的主要区别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异的识别位点。,pGEM-11,现在以发展出了一大批在多克隆位点区附近参入噬菌体RNA聚合酶启动子的简单的质粒载体，它们都是由pUC系列载体派生而来的。 噬菌体的RNA聚合酶，所合成的RNA转录本除了可作为杂交探针之外，在兔网织红细胞裂解物转译体系或在麦胚无细胞转移体系中进行体外蛋白质的合成。在反应混合物中加入m7GpppG，能形成5的帽子结构，进行有效的蛋白质合成。,（3）穿梭质粒载体 （ shuttle plasmid vector ） 是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。,早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体 大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体 大肠杆菌-牛乳头瘤病毒 迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞穿梭载体。,五、质粒载体的稳定性问题 1、质粒载体不稳定性的类型 结构的不稳定性：主要指由转位和重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失。 分离的不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增值成为无质粒的优势群体。,结构的不稳定性 DNA的缺失、插入和重排是造成质粒载体结构不稳定性的原因。 1、质粒的自发缺失：同向重复短序列之间的同源重组。 2、寄主染色体及质粒载体上的IS因子或转位因子也会引起结构的不稳定性。,分离的不稳定性 细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，也是导致质粒不稳定性的重要原因，将这种起因于质粒的缺陷性分配所造成的质粒的丢失现象，叫作质粒分离的不稳定性。,要使质粒能够稳定的遗传，必须保证平均每个世代质粒最少复制一次；并且，细胞分裂过程中，质粒复制的拷贝必须分配 到两个子细胞中去。 主动分配： a.平均分配机理：使每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 b.配对位点分配机理：只有一半数目的质粒呈主动分配，其余是随机分配的。 随机分配：细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞之间是随机分配的。,影响质粒载体稳定性的主要因素： 1、新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应。 质粒载体会加重寄主细胞的代谢负荷； 外源克隆基因的产物对寄主细胞的毒害作用。 2、拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响。 差度：不同细胞个体之间的质粒载体的拷贝数的差 异程度，可影响质粒载体丢失的速率。 差度越大稳定性越差；差度越小稳定性越高。,3、寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应 在野生型的大肠杆菌细胞中，质粒重组的重要结果是形成质粒寡聚体，它也是造成质粒载体不稳定的原因之一。 质粒DNA分子之间的重组频率； 含质粒寡聚体细胞的生长速率。 影响质粒重组的突变也会影响质粒的稳定性。,第二节 噬菌体载体 （Bacteriophage，简称phage）,一、 噬菌体的一般生物特性 可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。 除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能： 1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环境化学物质的破坏； 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞； 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒； 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒,1. 噬菌体的结构和其核酸类型： 结构：无尾部结构的二十面体型、 具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、 双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。,不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较复杂；对寄主的依赖性较低。 有些噬菌体的DNA碱基不是由标准的A/T/C/G组成的。 Example： T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞嘧啶（HMC）;SP01噬菌体DNA中没有T碱基，取代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。,2.噬菌体的溶菌生命周期 噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期 只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 烈性噬菌体溶菌生长的基本过程： 1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来,3.噬菌体的溶源生命周期 溶源生长周期： 是指在感染过程中没有产生出子代 噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上，成 为它的一个组成部分。 现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期,温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶 源生命周期。 溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌 溶源化： 用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶 源性细菌的过程 整合： 噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体 DNA中 原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的 噬菌体 超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并 使之溶源化的同种噬菌体再感染。,溶源周期的主要特征： 噬菌体和P1噬菌体 噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。,噬菌体P1基本特征： 不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。,溶源噬菌体的诱发： 依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。阻遏物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌体转录。 需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染色体上删除下来，使之形成环形的DNA分子，恢复溶源周期开始时的状态。,二、噬菌体载体, phage,48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends),溶菌阶段 (复制和释放),溶源阶段 (整合到寄主染色体上),A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2,cI cro cII O P Q S R,att int xis gam red cIII N,COS,COS,头部基因 尾部基因 功能不明区,溶源化 重组 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌,生长非必须区段,cI基因：溶源过程控制基因。,噬菌体的基因组结构,DNA,Protein coat,cos,cos,Nonessential region,Long (left) arm,short (right) arm,Exogenous DNA (20-23 kb), phage,12bp,5-CGGGGCGGCGACCTCG-3 3-GCCCCGCCGCTGGAGC-5 Cleavage Ligation (during packaging) (after infection) GGGCGGGCGACCTCG-3 5-CG + GC-5 3-GCCCCGCCGCTGGA,The phage cos ends,Circular form,Linear form,Viruses that can infect bacteria. 48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends), phage,Lytic phase (Replicate and release),Lysogenic phase (integrate into host genome),噬菌体载体的主要类型 1. 插入式载体 一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的 派生载体。 2. 替换型载体（取代型载体） 具有成对的克隆位点，在这 两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。 3. 凯伦噬菌体载体,插入式载体： 噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。 cI基因插入失活：如 gt10、NM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。 Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。,cI,EcoR I,LA 32.7,RA10.6,gt 10,lac Z,LA 19.9,RA21.9,EcoR I,Charon 16A, 替换型载体（取代型载体）,外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段 ( 20 kb) 高感染效率 (109 转化株/ug 载体 DNA, 比质粒高100-倍),e.g. EMBL3, DASH,替换式载体 野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 EMBL 3/ 4、Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。 换型噬菌体是使用最广泛的载体。,Lac 5,EcoR I EcoR I,EcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I,MCS MCS,Charon 4A,EMBL3/4,Charon 40,替换型载体克隆外源DNA的步骤 1. 应用适当的核酸内切酶消化载体， 除去可取代的DNA片段； 2. 将上述所得的 DNA载体臂同外源 DNA片段的连接； 3. 对重组体的DNA分子进行包装和增 殖，以得到有感染性的重组噬菌体, 取代载体,2. 组装.,连接,3. 侵染,体外包装 噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106108/gDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103105/ gDNA。 噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的75%105%。,凯伦噬菌体载体 既有插入型；又有替换型 在基因工程实验中的用途十分广泛 承受外源DNA的能力：几个kb到23kb,（左右臂连接） （三段自身连接） （插入片段）,根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选,三、单链DNA噬菌体载体 (M13),单链DNA噬菌体载体 M13、f1、fd。 优越性： 1. 单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式 的 DNA简称RFDNA； 2. 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3. 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多制约的，不存在包装限制 问题； 4. 容易测定外源DNA片断的插入取向； 5. 可产生含外源片断的单链DNA分子。,M13噬菌体载体 M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链片段，这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。,M13噬菌体的特点 感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型（ replication form DNA, RF DNA）。可以象质粒那样在体外进行纯化和操作。 成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。 噬菌体颗粒的大小是受其的大小制约的，这一点正好与噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。,M13单链DNA噬菌体的生命周期,RF DNA,Phage M13 replication in the host cell:,Nicked by gene 2 protein,+,ss-Rolling circle replication, then cut and ligate,Coated with gene 5 protein,Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phagereleased from the cell.,M13载体 具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。 可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（）链，所以M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全取决于外源克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。,Blue-white selection,M13载体系列的优点 1. 在这类载体的基因组中有一条饰变的-半乳糖苷酶基因片段（Hind片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列； 2. M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。,M13mp18 MCS M13mp19 MCS,EcoRI BamHI HindIII PstI BglI BglI PstI HindIII BamHI EcoRI,B P,P B,B P,B P B P,BamHI & PstI,M13克隆载体分子结构图,四、噬菌粒载体,噬菌粒载体 由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。,常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119 1. 具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作； 2. 编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择； 3. 拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA； 4. 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；,5. 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5-端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子； 6. lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达； 7. 含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子 8. 带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；,9. 在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA； 10. 可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。,pBluescript噬菌粒载体 基本结构： 1. 在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动； 2. 同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA； 3. 编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子记号； 4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。,T7,T3,用于体外转录,五、柯斯质粒载体,柯斯质粒载体 cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。,柯斯质粒载体的特点 具有噬菌体的特性； 具有质粒载体的特性； 具有较高容量的克隆能力； 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力,C) Packaging and infect,Formation of a cosmid clone,Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.,大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出3045kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；,细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。,六、其他载体 酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YAC） 细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BAC） 动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）,人基因组十分庞大，约含4109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要,CEN1, centromere sequence; TEL, telomere sequences; ARS1, autonomous replicating sequence; Amp, gene conferring ampicillin-resistance; ori, origin of replication for propagation in an E. coli host.,The vector is used with a specialized yeast host cell, AB1380, which is red colored because it carries an ochre mutation in a gene, ade-2, involved in adenine metabolism, resulting in accumulation of a red pigment. However, the vector carries the SUP4 gene, a suppressor tRNA gene which overcomes the effect of the ade-2 ochre mutation and restores wild-type activity, resulting in colorless colonies. The host cells are also designed to have recessive trp1 and ura3 alleles which can be complemented by the corresponding TRP1 and URA3 alleles in the vector, providing a selection system for identifying cells containing the YAC vector. Cloning of a foreign DNA fragment into the SUP4 gene causes insertional inactivation of the suppressor gene function, restoring the mutant (blue color) phenotype.,the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping,The functional elements of a yeast chromosome,正常酵母人工染色体含有： * 四膜虫端粒（tel) * 酵母自主复制序列（ARS) * 酵母着丝点 (CEN) * 酵母的选择标记 (TRP1、URA1),YAC载体,BAC载体,Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.,PAC载体,小 结,载体的概念、性能,plasmid,质粒载体必须具备的基本条件,pUC质粒载体,pBR322质粒载体,phage, phage,cos ends,主要类型,包装长度,M13vector,RF DNA,噬菌粒载体,柯斯质粒载体,特点、结构特征、,OVer!,Hock等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒，因此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进行包装的信号（一段尚未鉴定的DNA顺序）。用这种缺陷的逆转录病毒去感染某种细胞株，这种细胞株包含有辅助病毒（helper virus）。辅助病毒能合成蛋白外壳，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录病毒的RNA进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助病毒外壳蛋白中的逆转录病毒RNA，进入骨髓细胞，病毒DNA插入宿主细胞基因组，基因的活性得到表达。这时，由于骨髓细胞里面没有辅助病毒，所以整合进宿主基因组的逆转录病毒，不再有外壳蛋白可供包装，因此也就无法增殖，而只能被“陷”在宿主基因组中，通过细胞分裂而传给下一代子细胞。,人基因组十分庞大，约含4109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要,正常酵母人工染色体含有： * 四膜虫端粒（tel) * 酵母自主复制序列（ARS) * 酵母着丝点 (CEN) * 酵母的选择标记 (TRP1、URA