远东偏顶蛤核糖体DNA第二转录间隔区（ITS2）测序及分析-畜牧渔业论文.doc

远东偏顶蛤核糖体DNA第二转录间隔区（ITS2）测序及分析-畜牧渔业论文远东偏顶蛤核糖体DNA第二转录间隔区（ITS2）测序及分析 林杉杉，鲍相渤*，刘忠颖，王超，杨慧花 （辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁省海洋水产分子生物学重点试验室，辽宁 大连116023） 摘要：利用通用引物成果扩增了远东偏顶蛤核糖体DNA第二转录间隔区序列，并对其进行了一致性比对和系统进化分析，结果表明：远东偏顶蛤ITS2序列全长共245 bp，四个个体的序列无差异。与其他物种相比，与远东偏顶蛤一致性最高的物种为同属的偏顶蛤，系统进化树中，远东偏顶蛤与同属的其他两个种聚为一支。本文研究结果为该种的遗传进化及多样性研究提供了基础数据。 关键词：远东偏顶蛤；ITS2；系统进化 基金项目：辽宁省海洋与渔业厅科研项目（201506）。 作者简介：林杉杉（1988-），女，助理工程师；研究方向：贝类繁殖与养殖。E-mail:emailprotected 通讯作者：鲍相渤，女，助理研究员；研究方向：海洋生物分子生物学。E-mail:emailprotected DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2016.06.004 远东偏顶蛤Modiolus kurilensis F.R.Bernard，1983 是广泛分布于中日韩俄海域的大型双壳贝类，隶属于瓣鳃纲、贻贝目、贻贝科、偏顶蛤属，由于其形态学特征与来自欧洲的偏顶蛤 Modiolus modiolus (Linnaeus,1758) 模式标本非常近似，致使很多人误将远东偏顶蛤当成偏顶蛤。2014年作者通过线粒体COI基因分析，确认大连黄海北部所得标本为远东偏顶蛤1。 真核生物核糖体 DNA (rDNA) 在染色体上的排列顺序为 18S、5.8S、28S rDNA，其中18S与5.8S rDNA之间存在着一个转录间隔区被称为第一转录间隔区（ITS1），而5.8S与28S rDNA之间的间隔区被称为第二转录间隔区（ITS2）。两个转录间隔区与18S 、5.8S 和 28S rDNA 一起在基因组中组成多拷贝转录单元。其中两个转录间隔区由于不加入成熟核糖体，进化过程中的选择压力小，进化速度较快，因而用于多种生物的进化关系构建、遗传变异、近似种类的区分及杂交种的鉴定2-5。本文首次测定并报道了远东偏顶蛤大连群体的ITS2 序列全长，并与近缘物种进行了初步比较分析，旨在为该种的系统发育、遗传多样性及遗传结构研究提供基础数据。 1材料与方法 1.1实验材料 本文所用实验材料于2015年8月采自辽宁省大连市付家庄海域。个体解剖后，取闭壳肌保存于95%乙醇溶液中。 1.2试验方法 剪取适量样本，去离子水浸泡以去除乙醇，采用TIANamp Marine animals DNA kit进行基因组DNA提取。 两个转录间隔区的PCR扩增引物序列分别为ITS-2A/ITS-2B:5acute; GGGTCGATGAAGAA CGCAG -3acute; / 5acute; -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3acute;6。PCR扩增体系为：TaKaRa LA Taq（5 U/L）0.5 L，10LA Taq Buffer II（Mg2+ Plus）5 L，dNTP Mixture（2.5 mM each）8 L，DNA模板50 ng，正反引物终浓度均为1.0 M。PCR扩增程序为：94 预变性 2 min；33 个循环包括94 /30 s，52 /30 s，72 /1 min；最终72 /5 min 延伸。扩增所得片段经琼脂糖电泳检测后送交上海生工行克隆测序。 从GenBank中下载贻贝科中其他物种的ITS2序列，去掉两端5.8S及28S序列，用于比较分析，用DNAMAN计算远东偏顶蛤与其他物种ITS2序列的一致性，以虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）的ITS2序列为外群，采用PHYLIP软件以邻位相连法（neighbor joining) 进行系统发育树（bootstrap=1 000）。 2结果与讨论 2.1远东偏顶蛤ITS2序列 本实验共进行了四个个体的ITS2 PCR扩增，扩增得到的片段约500 bp（图1），经克隆测序，去除片段两端的5.8S及28S序列，得到长度为245 bp的ITS2全序列，四个个体扩增片段序列完全一致，碱基序列及长度无多态性（图2）。 2.2远东偏顶蛤与其他物种ITS2序列的比较 利用DNAMAN计算了远东偏顶蛤与贻贝科其他物种及虾夷扇贝ITS2序列的一致性，结果列于表1。结果显示：贻贝科内物种ITS2长度在242-386bp之间，与远东偏顶蛤一致性最高的物种为其同属的的两个物种，其中Modiolus modiolus与远东偏顶蛤相比仅有3个碱基的缺失和3个碱基的突变。虽然贻贝Mytilus_edulis与远东偏顶蛤同属一科，然而其ITS2一致性小于非同科的虾夷扇贝，可能是由于贻贝的ITS2序列过长，导致了其与远东偏顶蛤序列一致性的严重降低。 ITS2在进化过程中选择压力较小，致使其长度及序列差异不仅存在于种间，还存在于同种的不同种群、同群体的不同个体间，甚至同一个体也存在碱基的突变7。喻达辉等在研究珠母贝属 6个种的 ITS 2分子标记时曾发现同种不同个体间存在少数碱基突变现象8。本研究虽然尚未发现个体间ITS2碱基的差异，但由于本实验仅以一个群体的四个样本为材料，不能武断地认为该种ITS序列中不存在差异。 2.3贻贝科ITS2系统进化树的构建 在利用上述ITS2序列构建的系统进化树中，同属的物种基本分布于同一姊妹分支上，东方偏顶蛤与同属的Modiolus modiolus 和Modiolus rectus聚为一支，而贻贝与同一亚科的Perna属的两个物种也分布在较近的分支上（图3）。虽然个别分支置信度仅为60%，但其显示出的进化关系与传统的形态学分类结果保持一致。上述系统进化树显示了该科进化的总体趋势：贻贝科进化分大分支，以贻贝亚科为代表的为一大分支，而另一分支则以偏顶蛤亚科代表。这一结果与Distel9使用18S序列研究该科进化的结果相似。 作者曾经利用东方偏顶蛤ITS1序列进行进化树构建，发现无论长度还是碱基顺序，不同物种ITS1均显示出很大的差异，以此构建的进化树与已有的分类系统大相径庭，差异很大，而本文用ITS2序列构建的系统进化树则与现有分类系统吻合的较好。孟学平等10曾经使用ITS2序列构建了蛤蜊科 3 种贝类的系统进化树，其显示的进化关系与使用16S序列构建的相似。综上所述，与ITS1相比，用ITS2构建的进化树能更好地反映近缘物种的进化关系。 参考文献： 1 LIU Weidong,HE Jing,BAO Xiangbo.Mitochondrial DNA Supports the Validity of Modiolus kurilensis F.R.Bernard,1983.Shell Discoveries J，2014 (3): 18-19 2 Weekers PHH,De Jonckheere FJ,Dumont HJ.Phylogentic relationships inferred from ribosomal ITS sequences and biogeographics patterns in representative of the genus Calopteryx (Insecta: Odonata) of the West Mediterranean and adjacent west European zone J.Mol Phyl Evol，2001，20: 89-99 3 Chilton NB,Newton LA,Beveridge I,Gasser RB.Evolutionary relationships of trichostrongyloid Nematodes (Strongylida) inferred from ribosomal DNA sequence data J.Mol Phyl Evol，2001，19: 367-386 4 孙桂金，潘杰，刘可春，等.2011.毛蚶、泥蚶和魁蚶 ITS1 核苷酸序列分析J.生物技术通报，2011（7）：117-120 5 龚理,徐晖,李军，等.褐牙鲆()、夏鲆()及其杂交子一代的 ITS1 序列特征分析J.中国水产科学，2015,22(1): 17-23 6 Hedgecock D,Li G ,Banks M A,et al.Occurrence of the Kumamoto oyster Crassostrea sikamea in the Ariake Sea,Japan J .Marine Biology.1999,133(1):65-68. 7 唐伯平，周开亚，宋大祥.核rDNA ITS 区序列在无脊椎动物分子系统学研究中的应用J.动物学杂志，2002，37（4）:67-72 8 喻达辉,朱嘉濠.珠母贝属6个种的 ITS 2分子标记研究J.南方水产，2005，1（4）:6-12. 9 Distel DL.Phylogenetic Relationships among Mytilidae (Bivalvia): 18S Rr