植物组织培养产业化生产技术要点(电子版).doc

CHINESE HORTICULTURE ABSTRACTS植物组织培养产业化生产技术要点刘良宏1 李 斌2 胡广益1 王 玲3（1湖北省咸宁市园林绿化管理局 湖北 咸宁 437100 2湖北省咸宁市建设委员会 湖北 咸宁 4371003 湖北省咸宁市农业科学研究所 湖北 咸宁 437100）-138-摘 要：植物组织培养已经成为现代园艺领域中，作为种苗的主要生产方式之一，其优势明显，在我国已经形成产业化生产模式。植物组织培养产业化技术流程划分为stage0、stage、stage、stage四个阶段，其生产控制需要从外植体材料预处理、外植体的选取、原种研发与制种、继代培养以及生根收获等各个阶段加以把握。组培苗生产存在“三大杀手”，即褐化、玻璃化、污染，应作为生产控制的主要对象。生产工艺卡是企业进行标准化生产的技术文件，它不仅科学、有效地反映企业生产的合理流程，同时也是规范员工正确操作的指导性文件，也是企业进行生产过程调控及产品质量判定的标尺。关键词：组织培养；产业化；生产工艺CHINESE HORTICULTURE ABSTRACTS1 引言植物组织培养，又称植物克隆或植物微繁，是从上世纪30年代初期发展起来的一项重要生物技术，目前已经成为现代园艺领域中，种苗繁殖不可或缺的又一种手段。1902年德国著名植物生理学家Haberlandt提出了植物“细胞全能性”这一概念，经过半个多世纪的探索和发展，这一理论被越来越多的实验所证实。1960年，Morel提出了离体无性繁殖兰花的新方法，其繁殖系数之高，可谓始料不及，于是很快被兰花生产者所采用，从而在西方迅速建立起了“兰花工业”。可以说，这是植物组织培养技术第一次在园艺作物上形成规模化的生产应用。目前全世界许多国家都拥有离体快繁的专业公司，如荷兰，既是一个花卉生产出口的大国，同时也是植物组培苗的生产王国，其每年出口花卉种苗达5000万株以上。我国也不乏组培苗生产的专业公司，目前年生产总量约2亿株，其中近一半用于出口。从花卉种苗的生产情况来看，全世界将近80%的种苗均来源于组织培养。植物组织培养，作为种苗的主要生产方式之一，具有明显的优点：(1)繁殖速度快，尤其适宜于新、优、特品种推广的需要；(2)不受季节限制，可全年生产；(3)植物性状一致，生长势旺，尤其是作为盆栽植物，丛生性强，丰满度高，具有更强的观赏性；(4)可防止种质退化，是去除病毒病害的一种有效手段；(5)作为品种改良的一个重要手段；(6)可极大地方便种苗出口。基于上述优势，植物组织种苗培养的产业化，日益成为许多园艺企业热衷投资的方向之一。2 植物组织培养产业化的概念所谓植物组织培养产业化，是指将植物组织培养技术成功地应用于某种或多种植物的离体繁殖实践之中，使这一生产过程的各个环节（人、机、料、法、环等）得到有效控制，从而形成一系列标准化的生产工艺、达到一定的生产规模、并取得良好效益的生产活动。需要从下面几个方面理解这一概念：(1)生产技术相对成熟；(2)生产过程应该标准化；(3)生产达到一定的规模（有别于实验室研究）；(4)产品质量标准化；(5)取得良好的经济效益。3 植物组织培养产业化技术流程及其控制要点3.1技术流程作为产业化的组织培养过程，其技术流程通常可划分为四个阶段：外植体及其预处理阶段、原种研发与驯化阶段、继代增殖阶段、生根收获阶段，我们习惯分别用stage0、stage、stage、stage表示。stage0 stage stage stage3.2控制要点3.2.1 外植体材料预处理 在组织培养中，我们把由活植物体上切取下来得以进行培养的那部分组织或器官叫做外植体（Explant），被切割的活植物体则称之为母本（Mother plants；Stock plants）。在建立无菌培养体系之前，通常需要对母株和外植体进行必要的预防处理。预处理的目的有两个方面，一是降低污染，提高外植体的无菌成活率；二是打破外植体的休眠，提高外植体的诱导成功率。对于母本植株，通常的处理方法有干燥法、凉晒法、地苗盆栽法、药剂处理法。有些植物的种胚或芽，存在休眠期的问题。为了适当进行培养，必须采用人工方法打破其休眠期，从而提高外植体诱导成功的机率。外植体常见的预处理方法有：低温处理法和化学试剂解除法。3.2.2 外植体的选取 组织培养能否成功，除培养基的成分和激素的调节选择之外，外植体选择是否合理，是另外一个最重要的因素。根据植物细胞的全能性，从理论上讲，植物的每一个细胞都具有再生新植株的可能性，因此，任何器官，组织或细胞都能作为外植体，但是，实事表明，不同品种、不同的器官或组织，其分化能力存在着巨大的差异；甚至植物不同部位的同一器官或组织之间，其差异也极为显著。外植体的大小和采集时间也是影响的组织培养能否顺利进行的制约因素。概括起来外植体的选取，通常需要从外植体的来源、取材时期、取材大小、外植体的生理年龄或取材部位四个方面加以考虑。来源：一般说来器官到器官相对容易；但也有例外；存在着一种条件化效应(Conditioning effect)，即从培养条件下的植物上取得的外植体，其形态发生能力会大大增强。如用试管中的百合鳞茎(Lilium auratum)作外植体进行培养，则100%再生出鳞茎；出瓶炼苗不久的红掌(Anthurium)组培种苗为外植体进行培养，其愈伤形成能力和再分化能力要比用成品苗为外植体要快得多。当然，这也可能与植株生理学年龄差异存在着一定的关系。取材时期：一般选择母株生长旺盛的时期进行取材。这一时期，通常代谢旺盛，再生能力强，离体培养则容易成功，在休眠期或接近期取材，则外植体对诱导反应表现迟钝或不发生反应。（如马铃薯在4月和12月取的茎叶外植体有较高的块茎发生能力。又如番木瓜，茎尖培养，冬季取材难于成活，春秋季取材则成活率也低，唯有夏季温热取材，不仅成活率高且增殖率大。对于一些酚类物质含量较高的植物，则应选择酚类分泌物含量低的季节，采集外植体，从而可以提高接种成活率。取材大小：外植体越小，成活率越低。因此，除了是脱毒的需要（0.5mm以下），外植体不宜太小。研究表明：在木薯中，只有外植体大于200um时，才能够形成完整植株，再小的茎尖或是形成愈伤组织或是只能长根。香石竹茎尖大小为0.09mm时，已失去形态发生能力；茎尖大小为0.2mm时，只能微弱生长，茎尖达到0.35mm时，就能大量产生正常的嫩茎；菊花茎尖在0.10.2或0.2_0.5mm时，都只能产生一条茎，如茎尖切割的长度达0.51.55mm时，则可产生出多条茎。但是，外植体也不宜太大，太大则灭菌难以彻底，且内生菌携带机会大大增加，从而在高代培养中，细菌污染比例急剧上升。植株生理年龄：组织培养中的许多事例充分地证明了这一点。如桉树茎尖培养中，从基部抽出的枝条比上部枝条上取的外植年，成功率高30%左右，鸢尾（lris）唐昌蒲茎切段上能产生茎的只是靠近芽的最幼嫩组织。木本植物中胚和实生苗组织具有较高的再生能力，杜鹃茎切段产生根的能力，随着茎的年龄增加而削弱。常春藤幼年期的组织胚和器官，具有较高的再生能力，而成熟的组织则不具有。一般的规律是：幼年的组织都比老年的组织具有较高的形态发生能力。但是也有相反的结论。如河北杨的试验中，同一枝条的取用的茎段作为外植体，其不定芽的诱导率差异显著，上部高达90%以上，甚至100%，而下部的分化率只有6070%。同时，上部的分化速度还比下部快，不定芽的生长快而且数量多。3.2.3 原种研发与制种 要着重注意以下几个方面，首先，要按大小对外植体做好分类，从而预估好消毒时间；其次，要尽可能地对即将消毒的外植体作精细处理，如去除多余组织、取出褐化组织、去除苞片、鳞片等。第三，关于接种数量的选择，以每杯（试管）接种一个材料，污染率最低。第四，要做好勤转代工作。主要目的在于消除灭菌试剂及褐化对外植体产生的毒害作用。第五，对初期驯化材料要进行内生菌的检测工作，以排除隐性污染。最后，关于培养基的选择运用，当然至关重要，这个我们将另设专门篇幅加以介绍。3.2.4 继代培养阶段 据统计，构成组培苗的直接生产成本中，有近35%为能耗成本，为人员工资之外的又一个高成本项目。因此，在做好污染控制的前提下，首先要做好光温的控制工作，以便最大程度的节约能耗。通常做法是，当生产规模达到一定程度时，需要将培植房间划分几种不同的温度区（高温房、中温房、低温房），这既是植物组织培养的需要，更是节能降耗的需要；照明灯管也要划分为几种类型。其次要科学合理的把握每一代苗的继代周期，达到继代标准的要及时进行转代，决不可拖延，从而避免能源空耗，无菌苗品质下降。另外，在组培苗的工厂化生产过程中，每一种苗的继代周期通常都有相对的作业标准，但尽管如此，灵活把握苗的长势，学会“看苗做苗”的本事也是必不可少的。“看苗做苗”不光指是要根据苗的长相，灵活调整转代周期，同时还要学会调整继代的培养基的营养成分。在企业中，一般配有专门的技术员负责此项工作。值得指出的是，继代培养前的苗木无菌程度筛选工作尤其重要，我们通常称之为“挑苗”，其主要工作就在于，通过精心观察，彻底淘汰那些已遭污染或有污染嫌疑的半成品，以防止污染的进一步延续（交叉污染）。不负责任的“挑苗”工作，给企业带来的结果必然是：污染速度同组培苗的繁殖速度一样，以几何级数的形式向上攀升，最终使企业付出沉重的代价。3.2.5 生根收获阶段 重点在于做好生根接种前的种苗分级工作。不同级别或形态的生根苗不仅生根培养周期不同，所用的培养基成分也可能有较大的差异，其上市品质标准也截然不同，有的品种单价相差一倍以上。没有任何客户愿意接受品质参差不齐的产品，尤其是在出口型生产企业中，品质稳定、苗相整齐一致是赢得外商信任和获取外商订单的最为有效的途径。4 影响组培苗产业化的几个技术难点众所周知，组培苗生产存在“三大杀手”或称“三大困惑”，即褐化（browning）、玻璃化(vitrification)、污染（contamination）控制。这充分说明了这三方面的控制在组培生产过程的难度。4.1 褐化 很多植物尤其木本植物体内含有较多的酚类化合物。在完整的植物体细胞中，酚类化合物与多酚氧化酶分隔存在，因此不会发生反应。当植物组织遭受切割时，这种分割被打破，两者相互作用，生成褐色的醌类物质。醌类又会在络氨酸酶等酶的作用下，使外植体的蛋白质聚合，生长停顿，最终导致死亡。外植体的核化程度受其基因型、生理状态及培养条件影响强烈。一般说来，木本植物比草本植物易产生褐化；生理年龄较小、木质化程度较低的外植体褐化程度较低；外植体的取材季节褐化程度不同也是因为冬春所发新梢较嫩、夏天新梢较老的缘故。在外界条件中，以光照和温度对培养物褐化程度影响强烈。根据上述原因，要想有效减轻培养物的褐化程度，可从适宜选材、控制培养条件及添加抗褐化物质三方面着手改进。适宜选材是指选材时要注意采用幼年型外植体，一些夏季不宜制种的品种可考虑冬春采枝制种；较低的温度和前期的全黑暗培养，可显著地减少外植体的褐化程度。在培养基中添加维生素C、柠檬酸钠、硫代硫酸钠等抗氧化物质，也是防止培养物核化的一些有效手段。另外，通过水中切割、缩短转代周期、振动培养、添加活性物质(如聚乙烯吡咯烷酮、高锰酸钾、活性炭等)也可减缓褐化物对培养物的毒害程度。4.2玻璃化 玻璃化又称过度含水化，玻璃化的苗通常简称玻璃苗。玻璃苗是组织培养中出现的半透明状的、畸形的试管植物。玻璃苗的叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，水浸状植株矮小失绿、叶片皱缩，脆弱易碎。由于组织畸形，吸收养料与光合功能不全，分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养和扩繁，加上生根困难，很难移栽成活。有关试管苗玻璃化的机理至今未有一致看法。一般认为，培养基中水势偏高，易导致试管苗玻璃化现象。但据我们在组培实践中发现，一些园艺植物，如金铁锁、蓝粉石竹、大岩桐的组织培养中，细胞分裂素用量过高、培养温度偏高、培植光照过短或过弱均会使玻璃苗的比例大大提高。另外，玻璃苗的发生还与细胞分裂素的种类有关，如同是细胞分裂素，采用6-BA就比采用KT更易产生玻璃苗，即使是在同样功效的用量条件下。4.3污染控制 在组织培养中，污染是经常发生的。造成污染的原因很多，可以追朔到组培生产的各个环节。母株预处理不适宜、外植体灭菌不净、培养基或培养器皿消毒不彻底、员工操作不当、操作机台不达标、环境不洁等，总之，生产过程中的人、机、料、法、环等均会造成污染。有的污染甚至在厂房装修时便留下致命的隐患。组培污染依据其病原可分为细菌污染和真菌污染两种类型，其中以细菌污染较难控制。生产实践证明，对起始培养的外植体进行早期细菌检测，是目前降低整个生产过程细菌污染最为有效的手段之一。在污染的诸多成因中，尤以螨虫造成的污染最难治理，所带来的损失也可能最大。减少螨虫污染，需要从各个细节做起：厂房装修切忌使用木质（如天花板）、纸质（如墙纸）材料或地毯类材料；要其员工或其他进出人员严格做好个人卫生（勤洗澡、勤换衣、勤洗头）；经常用洗衣粉溶液擦洗培植架、拖地板；合理安排工作日程等。一旦发生螨虫污染时，迅速采用阿维菌素（2000倍）、克螨特（2500倍）、三氯杀螨醇、螨虫净等治螨药物对培植环境进行喷洒。5 组培生产工艺卡的制作与运用生产工艺卡是企业进行标准化生产的技术文件，它不仅科学、有效地反映企业生产的合理流程，同时也是规范员工正确操作的指导性文件，也是企业进行生产过程调控及产品质量判定的标尺。在目前国内外的组培生产中，虽然尚无标准化的文件可供参考，但作为一个现代企业参与该项生产，应力求摸索和建立一整套的标准化指导文件，这也是现代企业质量与管理标准化（ISO2000）认证的必然趋势和必备条件。生产工艺卡的制定是一个技术逐步积累与改善的过程，其根本来源于试验探索。首先，需要技术人员开展大量的试验，从而获取足够的试验数据（此过程就是常说的产品研发）；其次，要求科学分析试验数据，从中总结出最为经济、最为有效的生产流程；第三，在上述基础上撰写书面文件。值得指出的是，不是任何产品都能够开发成功并形成工艺卡的，一些品种即使在理论上可以进行生产，但可能因其生产成本偏高而无法为企业带来效益，更没有必要形成工艺卡片，因为企业生产绝对不等同于科学研究。同样值得指出的是，组培生产工艺卡一旦制定，也并不是一成不变的，它通常会因生产过程的偶然发现或新的试验数据而得以完善或修正；另外由于客户对组培种苗产品质量的变更也会导致对工艺卡片的改变。组培生产工艺卡也不是单方向的，通常因组培技术本身的要求或最终产品形态的不同，使得工艺卡派生出不同的分支，从而使其对生产具有更强的指导性。毋庸置疑，组培生产工艺卡的作用是非产巨大的，至少表现在如下几个方面：(1)对新员工而言，是企业进行员工技能培训的重要文件；(2)是规范员工标准操作的指导文书；(3)是企业进行生产过程调控的有力依据；(4)是企业评判产品质量优劣及员工绩效的标尺。参考文献：1 Ediwin F. Ph. D Plant propagation by tissue cultureM 2nd edition,1993/1996 Publisher by Exegetics limited.2 陈正华主编，木本植物组织培养及其应用M 北京:高等教育出版社，1986.3 刘良宏,陈威,涂少军. 蓝粉石竹的组织培养和快速繁殖 J中国文艺文摘 2009（3）27-284 孙新秀,刘良宏 玉荷包的组织培养技术J 中国园艺文摘2008( 6) 55-565 谭文澄 戴策刚主编 观赏植物组织培养技术M 北京:中国林业出版社19916 李浚明主编 植物组织培养教程M 北京:中国农业大学出版社 1992.7陈振光主编。园艺植物离体培养学M 中国农业出版社 北京:1996-140-8潘瑞炽. 植物组织培养M. 广东:广东高等教育出版社，2001.9韦三立. 花卉组织培养M. 北京:中国林业出版社2001.第一作者简介：刘良宏（1970），男，工程师；现主要从事园林绿化管理、植物组织培养等工作。 The Key Technical Points of the Industrialization of Plant Tissue CultureLIU Liang-hong Li-Bin HU Guang-yi WANG LingAbstract:The plant tissue culture has been widely used in the filed of the moden garden. As one of the main propogation ways,the plant tissue culture has the obvious advantages and han been come into industrialization. The plant tissue culture can be divided into 4 stages, described as stage0,stage,stage and stage. The product control should begin from the pre-treatment and selection of the ex-plant. Many control measures must to be taken in the stages of the orignal seed devolopment, sub-cuture and rooting-culture also. There are “three-killers” in the product of seeding in the ways of tissue culture, they are browning, vitrification and contamination.They are should be regarded as the main contents in the production management. The process cards are kinds of files based on the standdard prodution,ther can not only reflect the scientific process of product, but also standard the staffs behaviours and they are the effective rulers for production control and judgment of the production quility.Key word: tissue; tindustrilization; production process(上接16页)响芮城芦笋优质绿色产品品牌。3.3 落实责任，加强配合芦笋产业发展实行