毕业论文丹参SmPAP1基因的生物信息学分析.docx

摘 要丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge），为唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，其根和根茎皆可入药，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效。近年来随着丹参需求的日益扩大，野生资源的逐渐减少，人工种植品种退化及病虫灾害等一系列问题的产生，导致丹参产量和质量的逐年降低。因此，有效提高丹参中活性成分的含量、培育优质新品种已成为丹参现代化开发利用的必由之路。丹参中主要次生代谢产物分为两大类：一类为水溶性的酚酸类化合物；另一类为脂溶性的丹参酮类物质。基于传统中药多以水煎服的用药方式，水溶性的酚酸类成分被认为是丹参发挥药效的活性物质。研究报道丹参中主要的酚酸类活性成分生物主要源于酪氨酸代谢途径和苯丙烷类代谢途径，多为咖啡酸的衍生物，并且其合成受到一些MYB和BHLH类转录因子的调控。鉴于此，本论文在已有研究的基础上，选取丹参-基因为研究对象，克隆其启动子序列并进行序列的生物信息学分析，探究其潜在的表达调控模式，为更好地研究丹参-基因的功能及在丹参酚酸类合成中的作用奠定基础。1.利用PCR的方法从丹参gDNA水平克隆得到了-基因的启动子序列，该序列全长-bp。2.利用启动子在线分析软件进行启动子顺式作用元件分析。分析结果显示，该基因启动子区域上分布有与生物或非生物胁迫相关的顺式作用元件如-、-、-等，以及与激素响应相关的顺式作用元件-、-等。关键词：丹参，-基因,启动子，顺式作用元件。Abstract57第1章 引言第1章 引言1.1丹参的研究概况丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge），又名赤参、逐乌、郁蝉草、奔马草等，为唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，产河北，山西，陕西，山东，河南，浙江，江苏，安徽，江西及湖南等地，生于海拔1201300米的山坡、林下草丛或溪谷旁1。根和根茎可入药，味苦，微寒。归心，肝经。具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦的功效。在临床上广泛用于用于月经不调，经闭痛经，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠，肝脾肿大，心绞痛等症的治疗2。丹参具有种植条件简单、繁殖周期短、即能杂交授粉又能自交授粉3、次生代谢产物丰富，主要化学成分明晰4,5,6，基因组相对小7、基因操作技术成熟简便8-10等优点。是研究药用植物次生代谢产物生物合成及调控的理想材料。因此具有“药用模式植物”之称11-13。丹参为我国十大大宗药材之首，年需求量超万吨，仅原药材生产销售额达数亿元人民币，现已上市的中成药和复方制剂达百余种，总产值超过100亿元11。1.1.1 丹参主要化学成分及其药理作用对丹参活性成分的研究始于二十世纪三十年代。依据已分离化合物的特特够特征和理化性质，将其分为两类：脂溶性丹参酮类化合物与水溶性酚酸类化合物4,5,6。（见图1-1）。自1934开始，现已分离鉴定的丹参脂溶性化合物达40余种，主要包括丹参酮I、IIA、IIB 、V 、VI，异丹参酮I、II 、IIB，隐丹参酮，异隐丹参酮，丹参新醌A、B、C 、D，二氢异丹参酮、丹参酮二酚、丹参环庚三烯酚酮等14。其中，丹参酮A 是丹参治疗冠心病的主要成分之一，具有扩张冠状动脉、抗血小板凝集、清除氧自由基、改善记忆力障碍等作用，被2010年版中华人民共和国药典规定为丹参药材质量控制的指标成分之一；隐丹参酮具有强抗菌性，而且对治疗心肌缺血也有一定的疗效并对治疗心肌缺血也有一定的疗效，是丹参抗菌消炎类制剂的质量控制指标2,15-17。对丹参水溶性成分的相关研究始于20世纪70年代，至今已分离鉴定了咖啡酸、迷迭香酸，迷迭香酸甲酯，丹酚酸A、B、C 、D、E、F 、G， 原儿茶醛，原儿茶酸，紫草酸，丹参素，异阿魏酸，紫草酸单甲酯，紫草酸二甲酯， 紫草酸乙酯等20多种水溶性的酚酸类物质4,18-19（图1-1）。丹参水溶性酚酸类成分主要表现为抗氧化作用20。丹酚酸B 是目前发现的抗氧化作用最强的天然产物之一，也是丹参中含量最高的酚酸类化合物，对心、脑、肝、肾、胃等多个器官具有保护作用，被2010年版中华人民共和国药典规定为丹参药材质量控制的水溶性指标性成分之一；迷迭香酸具有抗炎镇痛作用；丹参素和原儿茶醛是治疗冠心病的有效成分2,20-23。鉴于传统yij中药以水煎服的用药方式，丹参水溶性化合物受到人们越来越多的关注。除以上所述化合物，丹参中还含有微量的鼠尾草酚、弥罗松酚、黄芩苷、熊果酸、柳杉酚、琥珀酸和-谷甾醇-D-葡萄糖苷等化学成分。图1-1 丹参酚酸类化合物的结构Figure 1-1 Structures of the phenolic acids of S. miltiorrhiza1.1.2 丹参资源利用的现状随着对丹参有效成分及药理作用的深入研究，近年来以丹参为主要原材料的产品不断被推出，丹参的需求量越来越多。伴随着丹参需求量的日益增加，对丹参野生资源的采挖力度加大，同时人工种植面积也在不断增加。但是，丹参作为异交植物，其种内变异非常大，性状也很复杂。因此只注重扩大栽培面积而忽略其优良品种选育导致了丹参品种严重退化，质量不均一，有效成分含量降低等诸多问题，从而影响了丹参作为高品质药用植物大规模进军国际市场24-25。另外，人工栽培条件下药田生态环境中生物多样性差、丰富度低，导致丹参病虫害优势种群突出、病虫害频发等问题也严重影响了药材的产量和质量26,27。因此为了提高丹参品质，更好的满足其市场需求，近年来利用基因工程、细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良来筛选优异丹参资源细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良，筛选优异丹参资源，提高丹参药材有效成分的含量愈来愈受到人们的重视。1.2丹参酚酸类物质的合成1. 2.1 丹参酚酸类成分生物合成途径的研究概况 迷迭香酸在多种唇形科植物中均有发现，迷迭香酸生物合成相关酶基因已经研究的较为清楚。咖啡酸和丹参素等几种单苯环物质可由氨基酸直接氧化脱氨生成，而其余均可视为咖啡酸与丹参素酯化缩合反应得到产物。丹参素源于酪氨酸代谢途径，咖啡酸来自苯丙烷类代谢途径，迷迭香酸是由酪氨酸代谢途径和苯丙烷类代谢途径共同参合成的。酪氨酸代谢途径中的羟基苯丙酮酸还原酶（HPPR）与酪氨酸氨基转移酶（TAT）参与了丹参素的合成；迷迭香酸合酶（RAS）、苯丙烷类代谢途径中的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和4-香豆素辅酶A连接酶（4CL）以及酪氨酸代谢途径中的TAT和HPPR共同参与了迷迭香酸及丹酚酸B的生物合成过程28-29。丹参酚酸类化合物的生物合成途径分为三部分。第一部分：莽草酸途径，由葡萄糖经过多步酶促反应生成莽草酸，进而形成芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸，它们是连接初生代谢和次生代谢的关键。第二部分：酪氨酸代谢和苯丙烷主干代谢两条互相平行的途径，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL）催化作用下生成肉桂酸，肉桂酸在细胞色素P450单加氧酶CYP73 亚家族的肉桂酸- 4- 羟化酶(C4H）和4- 香豆素辅酶A连接酶(4CL)的催化下生成4- 香豆酰CoA ，是植物酚酸、黄酮类和木质素类物质合成的通用途径；酪氨酸经由酪氨酸氨基转移酶（TAT ）和羟苯基丙酮酸还原酶（HPPR）的催化合成丹参素。第三部分：丹参酚酸类物质的特异合成途径，以4- 香豆酰辅酶A 和4- 羟苯基乳酸为前体通过迷迭香酸合酶（RAS ）催化苯丙烷类代谢途径来源的4- 香豆酸CoA 和酪氨酸途径来源的4- 羟苯基乳酸缩合、羟化形成迷迭香酸，迷迭香酸再经多步缩合、还原反应合成丹酚酸B28-29。1.2.2丹参酚酸类物质的调控研究目前对于丹参酚酸类活性成分生物合成的骨架途径已研究的较为清楚。丹参酚酸类活性成分生物合成主体途径上的多数酶基因已被克隆，这些酶基因的表达及调控与酚酸类化合物的累积密切相关。丹参中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆素辅酶A连接酶（4CL）、酪氨酸氨基转移酶（TAT）、羟苯基丙酮酸还原酶（HPPR）以及迷迭香酸合酶（RAS）共同参与了酚酸类化合物主要成分-丹酚酸B的生物合成过程30。图1-2植物酚酸类物质的合成途径Figure 1-2synthetic route of plant pheonlic substanve. 1.3 各自基因的介绍1.3.1 -基因概述重点阐述！ 1.3.2 -基因启动子的研究进展重点阐述！1.3.2 -基因的表达调控重点阐述！1.4 本研究的目的意义 缩略词表英文缩写英文名称中文名称-第3章 丹参SmPAP1基因的生物信息学分析第2章 丹参-基因启动子序列的克隆2.1实验材料、试剂及主要实验仪器2.1.1 实验所用植物材料丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）种子从购自陕西道地药材有限公司，种于蛭石与营养土(体积比约为3：1)混合的培养土的盛有蛭石的培养盆中于人工气候箱中培养，每隔两天浇一次水。当幼苗长出第二对真叶时栽至含蛭石的营养钵中，每个营养钵种 3 棵幼苗。人工气候箱培养条件：光周期16/8 h（day/night），光照强度2000 lx 216 molm2s-1，温度 25 2 ，湿度60 80 %。本章实验材料为人工气候箱中培养30 d后的丹参实生苗。将丹参种子种在蛭石与营养土(体积比约为3：1)混合的培养土中，幼苗在第二对真叶长出时移至营养钵中培养，培养条件：温度25 2 C，湿度60 80 %，光周期16/ 8 h（day/night），光照强度2000 lx。2.1.2实验试剂LA EX Taq Polymerase、dNTP mix,T4 DNA Ligase,PrimeScript RT reagent Kit EmeraldAmp PCR Master Mix, DL 2000 DNA Marker, pMD19-T Simple Vector（购自TaKaRa公司）；BD Genome Walker Universal Kit（购自Clontech公司）；DNA胶回收试剂盒（AXYGEN公司）；氨苄青霉素钠（Ampicillin sodium，Amp）Amresco公司引物序列合成，克隆片段测序均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成；其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。附：实验所用缓冲液和培养基配方，及本章实验中所用到但未列出的各种试剂配制方法参考分子克隆实验指南104。（1）实验所用抗生素及植物激素的配制：Amp储备液（100 mg/mL）：无菌水溶解10.0 g氨苄青霉素钠，定容至100 mL，0.22 m无菌滤头过滤除菌，1 mL分装置于-20 贮存。以100 g/mL的使用终浓度添加于LB培养基；（2） CTAB提取液(1L)CTAB 10.0g； PVP 25.0g；NaCl 40.908g；EDTA 3.7224g；Tris: 6.057g；调PH8.0。（3） TAE缓冲液（50）（使用的时侯稀释至1）：Tris 242.0 g；EDTA 18.612g；冰乙酸 57.1 mL；加H2O定容至1000 mL，室温保存。（4） LB (Luria-Bertani) 培养基（1 L）：NaCl 10.0g；Tryptone 10.0g；Yeast extract 5.0g，调pH7.0；固体LB培养基再附加15.0g琼脂粉。2.1.3实验仪器恒温培养箱 上海智新苗实验设备有限公司紫外-可见分光光度计 UNICAM UV-300HH-6B数显恒温水浴锅 国华电器有限公司摇床 上海智诚实验设备有限公司电泳仪 北京六一仪器厂DY-8型超净工作台 AIR TECH 苏州净化设备有限公司玻璃仪器气流烘干机 郑州长城科工贸有限公司涡旋器 姜堰市康健医疗器具有限公司 XH-BPCR仪 美国BIO-RAD公司 NanoDrop 2000核酸仪 美国Thermo Scientific公司凝胶成像系统 美国Media Cybernetics公司 UVP GDS-8000型超纯水仪 美国Millipore公司超低温-80冰箱 美国Thermo Fisher Scientific公司冷冻台式离心机 德国Eppendorf公司Centrifuge 5802REppendorf微量移液器 德国Eppendorf公司电子天平 德国Sartorius公司4/-20冰箱 德国SIEMENS公司高压灭菌锅 日本SANY公司MLS-3750型2.2实验方法2.2.1 丹参基因组DNA的提取丹参基因组DNA的提取采用CTAB法。（1）将CTAB在水浴锅中预热至65，研钵、研磨棒在液氮中预冷。（2）取新鲜的丹参叶片于研钵中，加入液氮迅速研磨使其成粉末。（3）称取0.20.3g研磨样于EP管中，每管中分别加入CTAB600L,和L-巯基乙醇12，颠倒混匀数次。（4）65水浴约60min，这一过程中每10 min颠倒混匀一次；（5）每管加入4L的RNA酶，37水浴约30min；（6）5,500 rpm离心15 min，取上清；（7）加入氯仿/异戊醇（24:1）480L，20L抽提一次。；（8）12,000 rpm离心5 min，取上清；（9）重复步骤7、8两次；（10）加样品二倍体积的无水乙醇，1/10提及的NaOAC；（11）-20放置1h以上，用枪头将DNA挑至EP管中。；（12）加750L的无水乙醇和250L Elution Buffer，12,000 rpm离心5 min，洗脱两次，去上清，干燥；（13）加0.10.5mL Elution Buffer，65水浴，使DNA完全溶解。-基因启动子片段的PCR扩增 在NCBI查到注册号为GU218694.1的-基因，根据其序列特征，利用PrimierPrimier5软件设计一对引物，ORF采用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性的引物，引物序列见表2-1分别以丹参cDNA和gDNA为模板，分别扩增SmPAP1基因的ORF和DNA全长，扩增体系（50 L）如下：Template DNA 1LPrimer F (10 M) 0.5LPrimer R (10 M) 0.5L2Taq MasterMix 10Ldd H2O add to 20L 扩增条件：94 ，10 min；（94 ，30 s；57 ，1min；72 ，50 s）33Cycles72 ，10 minPCR扩增产物经胶回收分别与pMD19-T Simple Vector连接转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH5，经菌落PCR检测的阳性克隆送至上海桑尼生物有限公司测序。大肠杆菌DH5感受态细胞的制备及转化方法（热激转化法）参照分子克隆实验指南104PCR产物纯化及克隆的方法与步骤：（1）PCR产物凝胶回收及纯化采用DNA Gel Extraction Kit (U-gene, Hefei)进行：用手术刀片在紫外灯下切含有目的 DNA条带的琼脂糖凝胶块，用滤纸吸干凝胶表面残余液体，切碎。加入400L的 Buffer DE-A，混合均匀后于 75 水浴加热约7min，至凝胶块完全熔化，其间每3min左右轻轻震荡混匀反应管。加200L Buffer DE-A 并混合。（分离的DNA片段长度1000bp的片段进行胶回收，纯化产物克隆连接到pMD19-T Simple Vector，送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。-基因启动子的5侧翼序列的序列分析分析PCR产物序列的结果，我们得到了一条长-bp的5侧翼序列，其A+T 含量符合启动子区高A+T含量的特征。利用PlantCARE database分析表明，在-基因转录起始位点的上游总共有38个可能的TATA box。我们认为，-基因最可能的TATA box 位于-65-57 bases处，其序列为：TCTATATATA。在SmPAP1基因转录起始位点上游共找到11个可能的CAAT box序列，这些序列被认为对转录效率具有非常重要的作用。分析结果显示，在-基格式因的启动子区，分布着多种类型的顺式作用元件，分别是与生物源或非生物源胁迫相关的顺式作用元件(表3-1)表3-1 预测的启动子区順式作用元件Tabel 3-1 Cis-acting element analysis of promote sequences位点名称Factor of site name信号序列Signal sequnce位置Location位点功能Fuction of siteCIACADIANLELHCCAANNNNATC-1172光响应元件，生理节律相关元件GT1CONSENSUSGRWAAW-708，-679 ，-637，-549，-548 ，-344 -343，-219 光响应元件，SA诱导相关元件HDZIP2ATATHB2TAATMATTA-1023,-677 光响应元件IBOXCOREGATAA-679 ,-219 光诱导响应元件INRNTPSADBYTCANTYY-1113光响应元件SORLIP1ATGCCAC-286光响应元件Box 4ATTAAT-1118,-264,-1026,-209,-1029,-913光响应元件Box1TTTCAAA-573,-527光响应元件G-BOXCACGTA-1131,-1037光响应元件G-box TACGTG-158,-231,-157,-230光响应元件WBOXNTERF3TGACY-667,-400创伤诱导响应元件MBSCAACTG-581MYB结合位点，干旱响应元件ABRELATERD1ACGTG-229,-156 ABA、干旱响应元件ACGTATERD1ACGT-1130,-1036,-719 ,-229,-156 脱水相关元件MYB1ATWAACCA-660ABA、脱水诱导元件MYB2CONSENSUSATYAACKG-581,-372 脱水相关元件MYCCONSENSUSATCANNTG-1075,-581,-554 ,-538,-524-502,-472,-439 干旱、ABA诱导响应元件DPBFCOREDCDC3ACACNNG-1076ABA诱导元件MYB2CONSENSUSATYAACKG-581,-372ABA诱导元件RYREPEATBNNAPACATGCA-1105ABA诱导元件ABRETACGTG-230,-157ABA诱导元件GAREATTAACAAR-364 ,-334 GA诱