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分子杂交技术与应用 v分子杂交技术的目的是什么？ v分子杂交的基本方法有哪些？ vSouthern印迹法有哪些步骤，为了达到什 么目的呢 v为什么叫印迹法呢？ 一、核酸分子杂交的基本原理与分类 （一）核酸分子杂交的基本原理 1、变性（denaturation） （1）定义： 在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双 螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链 。 （2 2）. .引起核酸变性的因素引起核酸变性的因素 酸酸 碱碱 热热 变性剂变性剂 （尿素）（尿素） 有机溶剂有机溶剂 （乙醇）（乙醇） （3）、变性后核酸的特点： 粘度下降 密度增加 紫外吸收增加 2、融解温度（Tm）： 定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最 大值一半时的温度。 3、复性（退火） 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程 。 影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度 4、杂交 定义定义 两条两条来源不同来源不同，但具有，但具有互补序列互补序列的核酸，按的核酸，按 碱基配对碱基配对原则原则复性复性形成一个杂交体，这个过程即形成一个杂交体，这个过程即 分子杂交。分子杂交。 DNA/DNADNA/DNA的杂交作用：的杂交作用： 检测特定生物有机体之间的亲源关系检测特定生物有机体之间的亲源关系 DND/DNADND/DNA或或RNA/DNARNA/DNA： 揭示核酸片断中某种特定基因的位置揭示核酸片断中某种特定基因的位置 。 v1975，Southern 印迹杂交法: DNA v1977，Northern印迹杂交法：RNA v1979，Western印迹杂交法：Protein 由Southern 1975年设计。 被检测对象为DNA。 二、Southern 印迹杂交 具体研究什么呢？ v克隆基因DNA的酶切图谱分析 【哪里可以剪开】 v基因组中某一基因的定性与定量分析 【有没有这个基因；在哪里】 v基因点突变【在哪个地方出现突变】 v限制性片段长度【可以被剪开的片段多长 】 带有DNA片段的凝胶 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上 转膜 杂交、显影 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸附有DNA 片段的膜 Southern 印迹杂交的技术流程 （一）待测核酸样品的制备 v提取待测DNA v用限制酶将DNA切成大小不同的片段 v用EDTA，65灭活限制酶，进入下一步 骤电泳分离片段。 （二）电泳分离DNA片段 v目的：确定杂交靶分子的大小【待测片段】 v原则：分辨大片段用低浓度胶； 分辨小片段用高浓度胶 v如何确定片段大小：用marker 【标准分子量DNA】 v胶的注意事项有四条，一起来看书： （三）印迹转移前凝胶的预处理 v分子量不同所需转移的时间不同； v浸泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤 v再进行碱变性，待测DNA链断裂单链，以 便与已知序列的DNA杂交 （四）转膜（印迹） v谁转移？ v将凝胶中已成单链的待测DNA片段 v转移到哪里？ v膜：固相支持物，常用NC膜和Nylon膜 v转移后有什么特点？ v转到膜上的相对位置跟在凝胶中的一样 （a） （b） （c） （d） （e） 基因组DNA DNA限制片段 硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的基因DNA片段 X光底片 白瓷盘 玻璃板 滤纸 凝胶尼龙膜滤纸 吸水纸 玻璃板重物 吸水纸转膜 硝酸纤维素（NC）膜 v不能滞留小于150bp的DNA片断，不能同 RNA结合。 vRNA变性后也能十分容易的结合到膜上 尼龙膜： 耐用，结合力强，但其本底高。 本底：指没有进样时检测到的信号值. 尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤： 1. 核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体 支持膜上。 利用的是毛细管作用 2. 印迹杂交： 将具有核酸印迹的滤膜和带 标记的DNA/RNA进行杂交 。 （五）、核酸探针 v1、探针（probe）的概念 指能与特定靶分子发生特异性相互作用 ，并能被特殊方法所检测的分子。 v例如抗原-抗体等均可看成是探针与靶分子 的相互作用。 v基因探针 指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂 交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标 记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。 2.探针种类 （1）基因组DNA探针 为某一基因的全部或部分序列。 （2）cDNA探针 以mRNA为模板经逆转录产生的DNA链。 （3）RNA探针 以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成 RNA。 （4）寡核苷酸探针 3.探针的选择 高度特异性，一般探针越长，杂交作用越强 ，其专一性也越强。 4、探针基本条件（特点） 标记物（32p, 35S, 125I, 地高辛（DIG）, FITC） 单链核酸（ssDNA） 高特异性（500bp） 标记物稳定灵敏，检测方便安全 （1）、标记物 放射性同位素标记物 非放射同位素标记物 v探针标记物 放射性标记物： 32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、 125I(60d) 非放射性标记物： v半抗原：生物素、地高辛 v荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC） a、放射性标记物 特点： 可用放射自显影技术检测，信号的强弱易于 进行定量分析。 主要缺点 射线对人体有伤害 放射性物质需特殊的处理 半衰期短不宜存放使用 B、 非放射性标记物 常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物 素（biotin）、荧光素。 特点： 敏感性不如同位素标记 稳定性和分辨率高 检测时间短 操作简便 不需特殊的防护设备 不存在放射性污染 （六）核酸的固定 v1、烘烤 802小时 v2、紫外光固定 v3、碱固定 （七）杂交 v1、预杂交 （1）目的：减少非特异性杂交 【探针会与其他非互补核酸产生非特异性结合， 所以杂交前用封闭物将这些非特异位点封闭】 （2）成分： 去污剂：1%SDS （可促进溶液对薄膜的覆盖，可 抑制RNase酶活性） 封闭剂： v鲑鱼精子DNA（与探针无同源性） v高分子化合物： Denhard氏溶液，包括聚 乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。 2、杂交 vv影响杂交的因素影响杂交的因素 核酸分子浓度与杂交速率核酸分子浓度与杂交速率 高浓度双链探针的杂交高浓度双链探针的杂交 碱基组成碱基组成：探针的：探针的TmTm高，杂交速率快高，杂交速率快 盐浓度盐浓度：离子强度与杂交速率成正比；与：离子强度与杂交速率成正比；与 杂交稳定性也成正比。杂交稳定性也成正比。 温度温度：与杂交速率成正比。：与杂交速率成正比。 甲醛甲醛：可降低：可降低TmTm值。值。 错配的核酸序列错配的核酸序列：错配降低杂交速率。：错配降低杂交速率。 杂交的加速剂杂交的加速剂 （八）洗膜 vv除去溶液除去溶液 未反应的探针未反应的探针 与滤膜疏松结合的探针与滤膜疏松结合的探针 非特异性结合的探针非特异性结合的探针 （九）杂交信号的检测 vv放射自显影放射自显影 vv非放射性杂化分子的检测非放射性杂化分子的检测 分子杂交技术 vSouthern blot 应用 DNA指纹分析 血迹中的DNA Southern DNA Southern DNA 印迹杂交之印迹杂交之X X光显像图片光显像图片 水稻（水稻（OryzaOryza sativa L sativa L.) .)的叶绿体的叶绿体DNADNA分别用核酸内切限制分别用核酸内切限制 酶酶BglBgl(A(A-C)-C)、BamHBamH（D-FD-F）、）、EcoREcoR（G-IG-I）、和）、和HindHind （J-LJ-L）消化，加样在消化，加样在1%1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离， 然后同然后同32 32P P标记的玉米 标记的玉米psbApsbA探针作探针作SouthernSouthern杂交。杂交。X X光底片中 光底片中 显现的阳性条带显现的阳性条带 ，表明含有水稻的，表明含有水稻的psbApsbA基因序列。基因序列。 三、 Northern印迹杂交 应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交 技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子 大小，其方法类似于Southern印迹杂交。 四、斑点杂交和狭缝杂交 五、原位杂交 1、定义： 将标记探针与细胞或组织中的核酸进行特异 性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在 显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术 2、操作步骤： 载片的清洁与处理 组织与细胞的固定 探针 湿盒 HPVHPV FISHFISH 补充：生物芯片技术 生物芯片（biochip）是生命科学领域中迅速发 展的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微 电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析 系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组 分的准确、快速与大信息量的检测。 1.1 生物芯片的分类 (1) DNA芯片(Gene chip, DNA chip, DNA microarray) (2) 蛋白质芯片(Protein chip) (3) 芯片实验室(Lab-on-a-chip) v基因芯片：是指将大量探针分子固定在物体表面 ，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分 子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和系列 信息。 v它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因 组信息而显示巨大威力。 v目前，基因芯片已经应用于基因表达检测、寻找新 基因、杂交测序、基因突变等许多方面。 基因芯片 v蛋白芯片：是以蛋白质代替DNA作为检测 对象，比基因芯片更进一步接近生命活动的物 质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用 前景。 蛋白芯片 v芯片实验室：是生物芯片技术发展的最终 目标。它将样品制备、生化反应和检测分析 的全过程集约化，形成微型分析系统。目前 ，这种形式尚处于研发阶段。 芯片实验室 1.2 DNA芯片技术的基本原理 DNA芯片技术的基本原理是分子识别，与 Southern杂交和Northern杂交同出一理，即 DNA的碱基互补配对和序列互补原理。 v据芯片的性能与用途分： 1）毛细管型微芯片 2）基因探针型微芯片 v据DNA芯片上微排列的DNA不同分： 1）寡核苷酸芯片 2）cDNA芯片 1.3 DNA芯片的类别 芯片方阵的构建 样品制备 生物分子