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什么叫基因工程？什么叫基因工程？ 基因工程，又叫基因工程，又叫DNADNA重组技术重组技术。通俗。通俗 的说，就是的说，就是按照人们的意愿按照人们的意愿，把，把一种生物一种生物 的的某种基因某种基因提取出来，加以修饰改造，然提取出来，加以修饰改造，然 后放到后放到另一种生物的细胞里另一种生物的细胞里，定向定向地改造地改造 生物的遗传特性。生物的遗传特性。 基因工程的概念基因工程的概念 基因工程的概念基因工程的概念 基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 DNADNA重组技术重组技术 生物体外生物体外 基因基因 分子水平分子水平 剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达 “分子手术刀分子手术刀” 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 “分子缝合针分子缝合针” DNADNA连接酶连接酶 “分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体 1.11.1、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具 一、限制性核酸内切酶“分子手术刀” n1.主要来源： n2.作用特点（特异性） n3.限制酶识别序列 主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化 识别识别特定特定核苷酸序列，并且使每条链中核苷酸序列，并且使每条链中特定部特定部 位位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由6 6个核苷酸组成个核苷酸组成， 少数由少数由4 4、5 5或或8 8个核苷酸组成，是回文序列。个核苷酸组成，是回文序列。 限制酶的识别序列：限制酶的识别序列： 能被限制性内 切酶特异性识 别的切割部位 都具有回文序 列：在切割部 位，一条链正 向读的碱基顺 序与另一条链 反向读的顺序 完全一致。 1 1 、基因工程的、基因工程的 “ ” “ ” G A A T T CG A A T T C C T T A A GC T T A A G C T T A AC T T A A GGA A T T CA A T T C GG 粘性末端 限制性内切酶 酶! 观察与思考 T G C AT G C A A C G TA C G T A C GA C G T T G C AG C A T T 不同的不同的“ “剪刀剪刀” ”所所识 别的核苷酸序列、 切点以及形成的黏 性未端都不同不同 观察与思考 不同的限制性内切酶识别的核 苷酸序列、切点以及形成的粘 性未端都是否相同？ DNADNA 目的基因目的基因 G C AG C A T T T G CT G C AA A C GA C G T T C G TC G T AA G C AG C A T T T G CT G C AA 问题2: 如何把目的基因从DNA 分子上切下来呢? 观察与思考 1 1 、基因工程的、基因工程的 “ ” “ ” 限制性内切酶限制性内切酶 原核生物原核生物（已发现的有（已发现的有200200种）种） 一种限制酶一种限制酶只能识别只能识别一种特定的一种特定的 核苷酸序列核苷酸序列, ,并在并在特定切点特定切点切割切割 （3）分布： （1）特点： （2）结果： 产生粘性末端或平末端产生粘性末端或平末端 限制酶DNA解旋酶 区别 限制性内切酶与限制性内切酶与DNADNA解旋酶的区别解旋酶的区别 切割特定的核苷酸序列 的磷酸二酯键 将DNA两条链的氢键 打开形成两条单链 2 2 、基因工程的、基因工程的 “ ” “ ” C T T A AC T T A A GG A A T T CA A T T C GG DNA连接酶 A A T T CA A T T C GG 问题3： 如果把两种来源不同的DNA用同一种酶 切割，会怎样呢？ 观察与思考 指指 “ “ DNADNA连接酶连接酶 ” ” “ “ ” ” （1 1）连接的部位：）连接的部位： 连接 连接“ “梯子梯子” ”断口的断口的“ “扶手扶手” ” 磷酸酯键磷酸酯键；而非；而非“ “梯子梯子” ”中间的中间的“ “ 踏板踏板” ”氢键氢键 2 2 、基因工程的、基因工程的 “ ” “ ” （2 2）结）结 果：果：两个相同的粘性末端或平末端两个相同的粘性末端或平末端 连接连接 可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“ “缝合缝合” ”起来，起来， Ecoli DNAEcoli DNA连接酶 或连接酶 或T T 4 4 DNADNA连接酶连接酶 即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“ “缝合缝合” ”起起 来，但效率较低来，但效率较低 T T4 4 DNADNA连接酶连接酶 3. 3.类型：类型： 类型 EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶 T T4 4 DNADNA连接酶连接酶 来源来源 功能功能 大肠杆菌大肠杆菌 T T4 4 噬菌体噬菌体 恢复恢复 磷酸磷酸 二酯键二酯键 只能连接只能连接黏性末端黏性末端 能连接能连接黏性末端黏性末端和和 平末端平末端( (效率较低效率较低) ) 相同点相同点差别差别 DNA聚合酶DNA连接酶 区别1 区别2 相同点 寻根问底寻根问底 DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗? ?为什么为什么? ? 1)只能将单个核苷酸连 接到已有的核酸片段上 ，形成磷酸二酯键 1.形成磷酸二酯键 1)在两个DNA片段之 间形成磷酸二酯键 2)以一条DNA链为模板 ，将将单个核苷酸单个核苷酸通过磷 通过磷 酸二酯键酸二酯键连接成一条互 补的DNA链 2)将DNA双链上的两 个缺口同时连接起来 ，不需要模板 2.化学本质都是蛋白质（但组成和性质各不相同） c n经典例题剖析 n下图表示限制酶切割某DNA的过程，从图 中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切 点是（ ） nACTTAAG，切点在C和T之间 B CTTAAG，切点在G和A之间 nCGAATTC，切点在G和A之间 D CTTAAC，切点在C和T之间 三、“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体 1、载体的作用 将 转移到受体细胞中去。 目的基因 2、种类 u质粒（常用，最常用的质粒是大肠杆菌的） u噬菌体的衍生物 u动植物病毒 3、载体需要的条件： 有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因 连接。 对受体细胞无害 能够在受体细胞中自我复制并稳定地保存 有某些标记基因，便于筛选 1 1）质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌 拟核DNA之外，并且具有自我复制能力的很小的 双链环状DNA分子。 4、质粒是基因工程最常用的载体。 2 2）质粒DNADNA上有上有一个或多个限制酶一个或多个限制酶的切割位点的切割位点 ，供外源，供外源DNADNA片段（基因）插入其中。片段（基因）插入其中。 3 3）携带外源）携带外源DNADNA片段的片段的质粒进入受体细胞后， 在细胞中进行自我复制自我复制，或整合到染色体，或整合到染色体DNADNA上上 ，随染色体，随染色体DNADNA进行进行同步复制同步复制。 4 4）质粒DNADNA上有上有特殊的标记基因，如四环素抗特殊的标记基因，如四环素抗 性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重 组组DNADNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。 能复制并带着能复制并带着 插入的目的基插入的目的基 因一起复制因一起复制 有切割位点有切割位点 有标记基因的有标记基因的 存在，可用含存在，可用含 氨苄青霉素的氨苄青霉素的 培养基鉴别培养基鉴别 5）真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的 基础上进行人工改造的。 三、基因操作的基本步骤 n提取目的基因 n目的基因与运载体结合 n将目的基因导入受体细胞 n目的基因的检测和表达 n目的基因的提取 1、基因文库中获取【鸟枪法】 2、人工合成基因的方法 3、利用PCR技术扩增目的基因 三、基因操作的基本步骤 n鸟枪法 三、基因操作的基本步骤 优点： 缺点： 操作简便 工作量大，具有一定的盲目性 三、基因操作的基本步骤 n人工合成法 DNA合成仪 逆转录法 根据已知的氨基酸 序列合成DNA mRNA 逆转录酶 单链DNA双链DNA DNA聚合酶 杂交双链 核酸酶H 蛋白质 mRNA DNA 推测推测 n人工合成法 三、基因操作的基本步骤 优点： 缺点： 专一性强，还可以合成自然界中 不存在的基因，因此有着广泛的 应用前景。 操作过程麻烦，技术条件要求较高 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 cDNA文库基因组文库 大小 启动子 内含子 小 大 无 有 无 有 2、利用PCR技术扩增目的基因 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 条件：_、 _、_ 、 _.等 原理：_ 方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数） 结果： 聚合酶链式反应 体外特定DNA片段 DNA复制 四种脱氧核苷酸一对引物 DNA聚合酶 指数2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件 ） 过程： a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_ b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_。 氢键单链DNA 双链 DNA链 基因表达载体的构建 基因工程的核心 1、目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并且可以遗传给下一代，同时使目的 基因能够表达和发挥作用。 基因表达载体的组成： 复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因 它们各自 的作用是 什么? 三、将目的基因导入受体细胞 （一）转化： （二）方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 Ca 处理法 目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程 受体细胞 稳定表达 2+ 1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 农杆菌特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多 数单子叶植物没有感染能力 原理：Ti质粒上的T-DNA可以转 移到受体细胞，并整合到受体细胞染 色体的DNA上。 过程： 优点 （2）基因枪法 （3）花粉管通道法 2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 程序： 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 方法： 用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表 达载体与感受态细胞混合 感受态 细胞吸收DNA分子 四、目的基因的检测与鉴定 检查是否成功 目的基因的检测与鉴定 n检测转基因生物染色体上的DNA 是否插入了目的基因 n检测目的基因是否转录出了mRNA n检测目的基因是否翻译出蛋白质 分子水 平检测 方法DNA分子杂交 方法分子杂交 方法抗原抗体杂交 个体水 平鉴定 抗虫鉴定、抗病鉴定等 小 结 基因工程的基本内容基因工程的基本内容 基因操作基因操作 的基本步骤的基本步骤 基因操作基因操作 的工具的工具 限制性内切酶限制性内切酶 DNADNA连接酶连接酶 运载体运载体 目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合 目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 目的基因的提取目的基因的提取 巩固练习 1、有关于基因的叙述正确的是 ( ) A 限制性内切酶只在获得目的基因时才使用 B 重组质粒的形成在细胞内完成 C 质粒都可作为运载体 D 蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 D 1.在基因工程中使用的限制性核酸内切酶，其作用 是（ ） A.将目的基因从染色体上切割出来 B.识别并切割特定的DNA核有酸序列 C.将目的基因与运载体结合 D.将目的基因导入受体细胞 2.基因工程中常用细菌等原核生物作受体细胞的原 因不包括（ ） A.繁殖速度快 B.遗传物质相对较少 C.多为单细胞，操作简便 D. DNA为单链，变异少 B D n3.基因工程是DNA分子水平的操作，下列 有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） n A.限制酶只用于切割获取目的基因 n B.载体与目的基因必须用同一种限制酶处 理 n C.基因工程所用的工具酶是限制酶DNA连 接酶 n D.带有目的基因的载体是否进入受体细胞 需检测 A n4.作为基因的运输工具运载体，必须具备的条 件之一及理由是（ ） A.能够在宿主细胞中稳定的保存下来并大量复制， 以便提供大量的目的的基因 B.具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达 C.具有某些标记基因，以便目的基因能够与让结合 D.它的参与能够使目的基因在宿主细胞中复制并稳 定保存 n5.基因工程中常见的载体是（ ） n A.质体 B.染色体 C.质粒 D.线粒体 D C 1、中国科学陈炬把人的搞病毒干扰素（一种蛋白质） 基因植入烟草的细胞中并“嫁接”到基DNA分子上，使 烟草获得了抗病毒的能力。试分析回答： （1）、人的基因这所以能“嫁接”到植物的DNA分子上去，是因为： _。 （2）、烟草有了抗病毒的能力，这表明烟草体内产生了 _。这个事实说明，人和植物共同用一套 _，蛋白质的合成方式_。 （3）、这个事实也可证明，现代地球上的生物是由工 人的原始祖先经过漫长的地质年代逐渐进化而来的，它 们之间有着或近或远的_关系。 人与植物的DNA分子结构相同 抗病毒干扰素 遗传密码相同 亲缘 二、填空题 番茄在运输和储存过程中，由于过早成熟 而易腐烂。应用基因工程技术，通过抑制某 种促进果实成熟激素的合成能力，可使番茄 储藏时间延长，培育成耐贮藏的番茄新品种 。这种转基因番茄已于1993年在美国上市。 请回答： （1）促进果实成熟的重要激素是_ （2）在培育转基因番茄的基因操作中。所用的 基因“剪刀”是_ 基因“针线”是_，基因“运 输工具”是_。 （3）与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工 程来培育新品种的主要优点是： _，_和 _ 。 乙烯 限制性内切酶 DNA连接酶 运载体 目的性强 育种周期短 克服了远缘杂交的障碍 基因工程的应用 一、基因工程与遗传育种 1、传统的遗传育种方法有哪些？ 杂交育种 诱变育种 单倍体育种 多倍体育种 优点： 缺点： 时间长、 远缘亲本难以杂交（优良性状的重组 只能限制于同种生物之间） 2、基因工程技术如何解决不同生物之间优 良性状的重组？ 转基因抗虫棉花 转入苏云金杆菌 的一个抗虫基因， 是中国目前最主要 的转基因作物 转基因植物： 1）高产、优质的农作物； 2）抗逆性品种 抗盐碱、抗寒、抗干旱 3）提高农作物的营养价值。 提高动物生长速度 生长快、耐不良环境、肉质 好的转基因鱼(中国) 转基因动物： 乳汁中含有人生长激素的转 基因牛(阿根廷) 转基因的动物生产药物 导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠 改善畜产品的品质 导入人基因具特殊用途的猪和小鼠 转基因的动物作器官移植的供体 1.1.运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的 抗虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验抗虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验 是否成功，最方便的方法是检测棉花植株是否成功，最方便的方法是检测棉花植株 是否有（ ）是否有（ ） A.A.抗虫基因 抗虫基因 B.B.抗虫基因产物抗虫基因产物 C.C.新的细胞核 新的细胞核 D.D.相应性状相应性状 2.2.转基因动物转基因时的受体细胞是（ ）转基因动物转基因时的受体细胞是（ ） A.A.受精卵 受精卵 B.B.精细胞 精细胞 C.C.卵细胞 卵细胞 D.D.体细胞体细胞 DD A A 随堂练习随堂练习 3.3.人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工 合成，通过转基因技术，可以使人合成，通过转基因技术，可以使人 的糖蛋白基的糖蛋白基 因得以表达的受体细胞是（ ）因得以表达的受体细胞是（ ） A.A.大肠杆菌 大肠杆菌 B.B.酵母菌酵母菌 C.C.噬菌体 噬菌体 D.D.质粒质粒DNADNA 4.4.人们利用基因工程方法，用大肠杆菌生产人类胰人们利用基因工程方法，用大肠杆菌生产人类胰 岛素，与此过程无关的是（ ）岛素，与此过程无关的是（ ） A.A.用限制酶对胰岛素基因与载体分别切到并催化两用限制酶对胰岛素基因与载体分别切到并催化两 者连接者