MICRORNA‐145在间充质干细胞成软骨分化中的作用及机制研究(人体解剖论文组织胚胎论文参考).pdf

第三军医大学博士学位论文microrna145 在间充质干细胞成软骨分化中的作用及机制研究姓名：杨波申请学位级别：博士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：应大君2011-05第三军医大学博士学位论文5microrna-145 在间充质干细胞成软骨分化中的作用 及机制研究 摘 要 软骨缺损一直是外科修复治疗的难题，组织工程学能够结合细胞学和工程学原理对受损组织进行生理性修复，是一种理想的修复方法。由于其自身优势，骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， mscs)被认为是目前软骨组织工程较理想的种子细胞，如何调控 mscs 定向分化成软骨细胞是目前软骨组织工程学中的重要问题。然而，mscs 成软骨分化的精确分子调控机制还未完全阐明，因此探求 mscs 成软骨分化的调控机制，有可能为探索切实有效的促分化策略提供基础，同时也有益于推进组织工程软骨在临床的应用前景。近年一些研究证实，microrna(mirnas)在干细胞的干性维持和分化中具有重要的功能。与越来越复杂的基因网络和蛋白网络相比，mirnas表达特征谱作为一种新的强有力的工具，在组织器官的定向发育、细胞生长和分化的时空调节、信号通路的开启和关闭及疾病治疗靶点确定的研究中更具独特优势。探讨mirnas 在 mscs 成软骨分化中的作用机制，将为进一步理解 mscs 成软骨分化的调控网络提供新的视角。 本课题拟从三个部分的实验研究对 mirnas 介导的调控 mscs 成软骨分化的生物学功能及分子机制进行系统的探讨。 1. 利用小鼠骨髓来源 mscs，建立稳定的体外诱导成软骨分化细胞模型。通过mirna芯片技术获得小鼠mscs成软骨分化不同阶段的mirna表达谱， 并以定量pcr实验对芯片结果进行验证。再结合生物信息学预测软件和定量 pcr 实验分析 mirna的靶基因，筛选出参与调控 mscs 成软骨分化的候选靶基因。 2. 结合生物信息学实验和双荧光素酶报告基因检测，验证候选 mirna 作用于预测靶基因结合位点的真实性。 3. 利用 c3h10t1/2 诱导成软骨分化细胞模型，检测针对候选 mirna 的gain-of-function 和 loss-of-function 干预实验中， 各种软骨特异性标志表型的表达变化，证实候选 mirna 调控 mscs 成软骨分化的生物学效应。 同时， 以定量 pcr 和 western blot 实验探索候选 mirna 调节靶基因的作用机制。 通过上述三部分实验，研究结果显示： 第三军医大学博士学位论文61. 通过直接贴壁法能够获得增殖能力强，mscs 标志 cd 分子表型一致，并具备多向分化能力(成骨分化、成脂分化和成软骨分化)的小鼠骨髓来源 mscs。基于此方法分离的 mscs，我们选取了 mscs 成软骨分化不同阶段的细胞进行 mirna 芯片扫描，包括：微团培养的 p3 mscs，mscs 诱导成软骨分化 7d，mscs 诱导成软骨分化 14d，单层培养的原代软骨细胞。结果在 mscs 成软骨过程中，表达发生显著性改变的mirnas 有 13 个(8 个上调， 5 个下调)。 其中， mir-143/145 和 mir-132/212 作为 mirna功能簇，在此进程中表达逐步下调。qpcr 验证其中 4 个 mirnas 的表达，与芯片结果一致，反映了芯片结果的可靠性。定量 pcr 结果显示，4 个生物信息学预测差异表达的 mirnas 的软骨相关靶基因在此进程中的表达模式与相应的 mirna 表达模式呈相反趋势。提示这些差异表达的 mirnas 可能参与调控 mscs 成软骨分化。 2. 生物信息学预测，调控软骨形成的关键转录因子 sox9 及其协同效应分子 rela分别是 mir-145 和 mir-143 的靶基因。为了验证其预测作用靶位点的真实性，我们分别成功构建了针对 mir-145 和 mir-143 的阳性对照荧光报告载体(pmir-pt)，包含预测靶位点的实验荧光报告载体(pmir-mre)和包含乱序排列的预测靶位点的实验荧光报告载体(pmir-mut)。双荧光素酶报告基因证实，mir-145 能与 sox9 的 3-utr 上预测靶位点有效结合， 发挥抑制效应。 结合mirna芯片结果显示mir-145在诱导mscs成软骨分化中的显著下调趋势，进一步提示 mir-145 有可能通过调节靶基因 sox9，参与调控 mscs 成软骨分化进程。另一方面，mir-143 的作用方式则不同于我们预期，我们仅得到了 mir-143 作用于 rela 预测靶位点的阴性结果，其在 mscs 成软骨分化中的作用有待于独立的实验再次探索。 3. 在 c3h10t1/2 诱导成软骨分化细胞模型中，mir-145 过表达能抑制 sox9 下游靶基因，同时也是软骨形成特征型表型基因(col2a1、agc1、comp、col9a2、col11a1)的 mrna 表达。相反，抑制 mir-145 表达则显著促进上述基因 mrna 表达。同时， mir-145 过表达能抑制细胞分泌软骨特征型细胞外基质 gags。相反，抑制 mir-145表达则显著提升 gags 形成。另外，mir-145 仅在蛋白水平调节靶基因 sox9 的表达。另一方面，无论过表达或抑制 mir-145 表达，均对 sox9 下游非软骨形成相关特异性靶基因(c/ebp、c/ebp)的 mrna 表达没有影响。进一步关于细胞增殖的实验结果发现，mir-145 的改变并未对细胞增殖产生影响。研究结果证实 mir-145 调控 mscs成软骨分化的作用效应，其作用机制是以转录后水平调节 sox9 表达，从而特异性参与调控 mscs 成软骨分化。 综上所述， 本课题成功分离、 培养小鼠骨髓来源 mscs， 建立稳定的体外诱导 mscs第三军医大学博士学位论文7成软骨分化的细胞模型。通过 mirna 芯片技术首次获得小鼠 mscs 成软骨分化 4 个不同阶段的 mirna 表达谱，并经定量 pcr 验证了部分结果；筛选出与软骨形成相关候选 mirnas。验证了 mir-145 作用于 sox9 的 3-utr 靶位点的真实性。同时也证实了 rela 并非 mir-143 的靶基因。 证实在 tgf-3 驱动的 mscs 成软骨分化中， mir-145表达下调能有效促进 mscs 向软骨细胞系定向分化，其调控机制是通过转录后水平调节 sox9 蛋白表达，从而以 sox9 为重要介导因子，特异性参与调控 mscs 成软骨分化进程。 关键词：间充质干细胞，mirna，软骨分化，mir-145，sox9，基因芯片 第三军医大学博士学位论文3biological functions and molecular mechanisms of mir-145 in chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells abstract chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells (mscs) is accurately regulated by essential transcription factors and signaling cascades. however, the precise mechanisms involved in this process still remain to be defined. micrornas (mirnas) regulate various biological processes by binding target mrna to attenuate protein synthesis. exploring the biology function of mirnas in regulating chondrogenesis will provide a new insight on complicated regulation mechanisms of chondrogenesis. to investigate the mechanisms for mirnas-mediated regulation of chondrogenic differentiation, we designed a systemic scheme of experiments consisted of three parts: 1) performing mirnas microarray in mscs at four different stages of transforming growth factor beta 3 (tgf-3)-induced chondrogenic differentiation. 2) screening the candidated mirnas for regulating chondrogenic differentiation of mscs and identifying their target genes by dual-luciferase reporter gene assay. 3) validating the effect and mechanisms of the candidated mirnas on controlling the chondrogenic differentiation of mscs by gain-of-function and loss-of-function experiments. the following results have been obtained: 1) our microarray results revealed that eight mirnas were significantly up-regulated and five mirnas were down-regulated. four of the thirteen mirnas expression pattern were validated by qrt-pcr. interestingly, we found two mirnas clusters, mir-143/145 and mir-132/212, kept on down-regulation in the process. using bioinformatics approaches, we analyzed the target genes of these differentially expressed mirnas and found a series of them correlated with the process of chondrogenesis. furthermore, the qrt-pcr results showed that the up-regulated (or down-regulated) expression of mirnas were inversely associated with the expression of predicted target genes. next, we identified that mir143 /145 cluster was decreased during tgf-3-induced chondrogenic differentiation of murine mscs. 第三军医大学博士学位论文42) subsequently, dual-luciferase reporter gene assay data demonstrated that mir-145 targets a putative binding site in the 3-utr of sry-related high mobility group-box gene 9 (sox9) gene, the key transcription factor for chondrogenesis. unexpectedly, mir-143 failed to bind to its putative binding site in the 3-utr of rela gene. 3) in addition, over-expression of mir-145 decreased expression of sox9 only at protein levels and mir-145 inhibition significantly elevated sox9 protein levels. furthermore, over-expression of mir-145 decreased mrna levels for chondrogenic marker genes, such as type ii collagen (col2a1), type ix collagen (col9a2), type xi collagen (col11a1), aggrecan (agc1) and cartilage oligomeric matrix protein (comp) in c3h10t1/2 cells induced by tgf-3, whereas anti-mir-145 inhibitor increased the expression of these chondrogenic marker genes. the results of alcian blue staining also showed that anti-mir-145 inhibitor promoted chondrogenic differentiation of mscs by increasing production of gags. c/ebp and c/ebp are both sox9 target genes, which are related to adipose differentiation of mscs.the results of qrt-pcr did not showed that mir-145 effected the mrna expression of c/ebp and c/ebp. furthermore, mir-145 has no effect on the proliferation of mscs. thus, our studies demonstrated that mir-145 is a key negative regulator of chondrogenic differentiation by directly targeting sox9. in conclusion, our results first revealed the expression profiles of mirnas and demonstrate that mir-145 is decreased during tgf-3-induced chondrogenic differentiation of murine mscs. the attenuation of mir-145 expression positively regulates its direct target gene sox9 at protein level, and results in promoting early chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cell line. our findings indicate that the effect which mir-145 regulate chondrogenic differentiation of mscs mediated by sox9 in response to tgf-beta3 is a specific influence on genes associated with cartilage. the results may provide a novel mechanism in mirna-mediated regulation of chondrogenic differentiation of mscs. key words: msc, mirna, chondrogenic differentiation, mir-145, sox9, microarray 第三军医大学博士学位论文1英文缩写一览表 英文缩写 英文全称 中文全称 mirnas micrornas 微小 rna bp base pair 碱基对 bsa bovine serum albumin 牛血清蛋白 cdna complementary dna 互补 dna dna deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 eb ethidium bromide 溴化乙锭 lb luria bertani lb 培养基 od optical density 光密度值 pbs phosphate balanced solution 磷酸盐缓冲液 pcr polymerase chain reaction 聚合酶链反应 rna ribonucleic acid 核糖核酸 rt-pcr reverse transcription pcr 逆转录聚合酶链反应 page polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 sds sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠 temed n,n,n,n-tetra methyl ethylene diamine n,n,n,n一四甲基乙二胺 amp ampicillin 氨苄青霉素 depc diethylpyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 nt nucleotide 核苷酸 ssc sodium chloride-sodium citrate buffer 氯化钠-柠檬酸钠缓冲液 tris tris(hydroxymethyl)aminometnane 三羟甲基氨基甲烷 utr untranslated regions 非翻译区 dapi 4,6-diamidino-2-phenylindole 4,6 二脒基-2-苯吲哚盐酸 dihydrochloride bmscs bone marrow mesenchymal stem cells 骨髓间充质干细胞 dmem dulbecos modified eagle medium dulbeco 改良的 mem 培养基 tgf- transforming growth factor 转化生长因子 第三军医大学博士学位论文2mtt thiazolyl blue 噻唑蓝 edta ethylene diamine tetra acetic acid 乙二胺四乙酸 fbs fetal bovine serum 胎牛血清 bmp bone morphogenetic protein 骨形成蛋白 sox sex determining region y-box 性别决定区 y 框 comp cartilage oligomeric matrix protein 软骨寡聚蛋白 mops 3-(n-morpholino)propane sulfonic acid 3-(n-吗啉代)丙烷磺酸 rpm revolutions per minute 每分钟转数 dab diaminobenzidien 对氨基联苯 facs fluorescence-activated cell sorting 荧光激活细胞分选 pe phycoerythrin 藻红蛋白 cy7 cyanine 7 青色素 7 mre mirna regulatory element mirna 调控元件 rnase ribonuclease rna 酶 sirna small interfering rna 小干扰 rna gag glycosaminoglycan 葡萄糖胺聚糖 mmu mus musculus 小鼠 has homo sapiens 人类 qrt-pcr real time reverse transcriptase pcr 实时定量反转录 pcr dmso dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 第三军医大学研究生学位论文独创性声明 秉承学校严谨的校风和科研作风，本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 日期： 第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外） ，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 第三军医大学博士学位论文8microrna-145 在间充质干细胞成软骨分化中的作用 及机制研究 前 言 骨关节表面关节软骨受损可因创伤、骨关节炎、肿瘤等多种病因导致，常呈现进行性的损伤，严重影响患者的生活质量。由于关节软骨缺乏自身修复能力，如何实现关节软骨缺损的功能性修复是医学领域的一大难题。组织工程学技术结合细胞生物学和生物材料学对受损组织进行生理性修复，为关节软骨缺损修复提供了一种理想的修复方法。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)由于其自身优势，被学术界认为是在软骨组织工程中极具应用前景的种子细胞。 如何促进mscs定向成软骨分化是软骨组织工程学中的重要问题。 然而， 调控mscs成软骨分化的精确分子机制目前还未阐明。 因此探求mscs成软骨分化的调控机制， 有可能为探索切实有效的促分化策略提供基础，同时也有益于推进组织工程软骨在临床的应用前景。 micrornas(mirnas)作为一种独特的内源性的小分子， 具备单一mirna同时调控多个下游靶基因的特性， 已经成为基因工程领域中的一个强有力的工具。 在细胞核内，基因组dna转录生成较长的rna分子，由双链rna特异的核糖核酸酶drosha切割，成为长度大约70-100 碱基，具有发夹结构的前体mirna。这些前体mirna借助核输出蛋白(exportin5)机制转运到胞浆，然后被第二个双链rna特异的核糖核酸酶dicer再次切割，从而得到19-23nt大小的成熟的mirnas产物。成熟的单链mirnas与类似rna诱导沉默复合物(risc)结合，参与 rna干扰效应。在哺乳动物中，结合在复合物上的mirna与其碱基序列完全互补或非完全互补的mrna相结合，在转录或翻译水平调节相应基因表达水平的下降。 大约有60%的mirnas 为独立表达， 15%左右的mirnas 成簇表达，还有25%的mirnas 位于内含子。 大量的研究证实mirnas在调控干细胞分化进程中发挥了至关重要的作用，是维持干细胞分化特性及干细胞定向分化的时空调节的关键因子。与越来越复杂的基因网络和蛋白网络相比，mirnas在组织器官的定向发育、细胞生长和分化的时空调节、信号通路的开启和关闭及疾病治疗靶点确定的研究中更具独特优势。目前国内外关于mirnas在mscs成软骨分化中的调控机制的研究较少，仅明确了极少的mirnas参与调控mscs成软骨分化，mirnas在这一细胞事件中扮演着怎样的角色正亟待我们去探第三军医大学博士学位论文9索。因此，揭示mirnas在mscs成软骨分化中的生物学功能，将从一个全新的视角诠释mscs定向分化的分子机制， 进而为优化组织工程软骨种子细胞策略提供新思路和新靶点。 基于上述研究背景，本课题拟从以下3个部分对mirnas在mscs成软骨分化中的调控作用进行研究：(1)采用microrna基因芯片技术对mscs成软骨分化各阶段的mirnas表达差异进行表达谱分析，筛选出可能参与调控mscs成软骨分化的候选mirnas。(2)通过生物信息学软件预测候选mirnas的与软骨形成相关靶基因，并以双荧光素酶报告基因实验验证mirna与靶基因的作用位点。(3)利用gain-of-function和loss-of-function干预实验探索mirnas调控mscs定向成软骨分化的生物学功能及作用机制。研究结果有望为mscs定向成软骨分化的mirnas调控机制积累基础资料，为临床上利用mirnas基因工程调控软骨细胞的生物学行为奠定基础，尤其是干细胞成软骨定向分化在组织工程种子细胞领域的应用提供有价值的线索。 第三军医大学博士学位论文10第一部分 小鼠骨髓来源 mscs 成软骨分化进程中的 microrna 表达谱分析 前 言 多种因素参与调控mscs成软骨分化进程， 包括各种转录因子、 细胞因子和信号通路分子等，构成了一个复杂的调控网络，理解其精确的调控机制仍是一个挑战。mirnas在各种细胞事件中发挥了至关重要的调控作用，其表达谱分析被大量应用在正常细胞的分化、组织发育和人类疾病致病因素研究中，例如成脂分化、神经元形成、多种肿瘤、心衰、骨关节炎等。由此可见，mirnas的表达变化已经广泛与细胞生物行为、机体组织的正常发育与功能密切相关。针对mscs成软骨分化进程中的mirnas表达谱分析，有助于研究mirnas在该进程中的作用，对于理解软骨形成的调控网络有重要意义。 高通量的microrna基因芯片为表达谱分析的实施提供了良好的技术支持。 我们采用affymetrix公司的genechipr mirna array对mscs成软骨不同阶段mirnas表达进行高通量扫描，该芯片涵盖了所有重要物种来源的mirnas，数据来源于sanger mirbase mirna database v11 (april 15, 2008,http:/microrna.sanger.ac.uk)。再以mirna芯片结果为基础，结合基因表达检测和寻找靶基因，对mirna表达谱进行分析，初步筛选出调控mscs成软骨分化的mirnas。 第一节 小鼠骨髓来源 mscs 和关节软骨细胞的分离、 培养及诱导成软骨 本节研究目的是建立稳定的体外诱导 mscs 成软骨分化细胞模型，为 mirna 表达谱分析奠定基础。 材料和方法 一、材料 1. 实验动物：实验动物：balb/c小鼠(68 周)购自第三军医大学实验动物中心。 2. 主要仪器主要仪器 第三军医大学博士学位论文11超净工作台 air tech 台式离心机 eppendorf 细胞培养箱 sanyo 流式细胞仪 bd 酶联免疫检测仪 molecular device 倒置显微镜 olympus 荧光显微镜 olympus 不锈钢细胞筛 3bio 培养瓶 corning 培养皿 corning 离心管 corning 电子天平 mettler 3. 主要试剂主要试剂 青霉素 sigma 链霉素 sigma mtt检测试剂盒 碧云天 低糖dmem hyclone dmem-f12 hyclone 高糖dmem hyclone 胎牛血清 hyclone 维生素c sigma tgf-3 peprotech 地塞米松 sigma 丙酮酸钠 sigma its sigma 脯氨酸 cyagen 谷氨酰胺 cyagen -磷酸甘油 cyagen 胰岛素 cyagen 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 cyagen 吲哚美辛 cyagen 第三军医大学博士学位论文120.25%胰酶 hyclone ii型胶原酶 invitrogen pe/cy7标记的抗cd34流式抗体及同型对照 santa cruz pe标记的抗cd44、cd45、cd90.2流式抗体及同型对照 biolegend dapi sigma 兔抗鼠抗ii型胶原多克隆抗体 sant cruz 羊抗兔igg jackson dab显色试剂盒 碧云天 alcian blue 8gx amresco 茜素红 cyagen 油红o cyagen 4. 主要试剂配制主要试剂配制 4.1 alcian blue ph 2.5： alcian blue 8gx 1g，3醋酸100ml 4.2 含10%胎牛血清的低糖dmem： 胎牛血清 10ml， 低糖dmem 100ml 4.3 4%多聚甲醛： a 液： 多聚甲醛 40 g 蒸馏水 400 ml b 液： na2hpo42h2o 6.88 g 蒸馏水 300 ml c 液：naoh 3.86 g 蒸馏水 200 ml 操作过程：在 500ml 的三角烧瓶中配制 a 液，待用。磁力搅拌器上加热溶解多聚甲醛，注意避免气体吸入。b 液和 c 液配制好后，将 b 液倒入 c 液中，混合后再加入a 液，以 1nm naoh 调 ph 至 7.27.4，最后，补充蒸馏水至 1000ml 混合，4保存。 4.4 软骨诱导完全培养基： 低糖dmem 97 ml 维生素c 300 l 第三军医大学博士学位论文13tgf-3 10 l/ml(现配现加) 丙酮酸钠 100l its 1 ml 地塞米松 10 l 脯氨酸 100 l 4.5 成骨诱导培养液： 高糖dmem 175 ml 胎牛血清 20 ml 青霉素-链霉素双抗 2 ml 维生素c 400 l 谷氨酰胺 2 ml -磷酸甘油 2 ml 地塞米松 20 l 4.6 成脂诱导培养液： 诱导液a： 高糖dmem 175 ml 胎牛血清 20 ml 青霉素-链霉素双抗 2 ml 谷氨酰胺 2 ml 胰岛素 200 l ibmx 200 l 吲哚美辛 200 l 地塞米松 200 l 诱导液b： 高糖dmem 175 ml 胎牛血清 20 ml 青霉素-链霉素双抗 2 ml 谷氨酰胺 2 ml 胰岛素 200 l 4.7 枸橼酸盐缓冲液： 储存液：a液，0.1m枸橼酸溶液21.01g枸橼酸，溶于1000ml蒸馏水。 第三军医大学博士学位论文14 b液，0.1m枸橼酸钠溶液29.41g枸橼酸钠，溶于1000ml蒸馏水。 工作液：9ml a液和41ml b液混合，加入450ml蒸馏水，调整ph值为6.0。 二、实验方法 1. 小鼠骨髓小鼠骨髓mscs的分离、培养的分离、培养 1.1 取68 周的balb/c小鼠(雌雄不限)，断颈处死后置于70%酒精浸泡3min，再移入超净台操作。 1.2 沿小鼠股骨和胫骨长轴切开皮肤，往切口两侧剥除皮肤和肌肉，暴露股骨和胫骨，尽量不要让皮毛接触到暴露的骨。 1.3 游离股骨和胫骨，更换手术器械，尽量去除骨表面结缔组织，去除干骺端，暴露骨髓腔。 1.4 无菌条件下用10 ml注射器吸取培养基反复冲洗小鼠胫骨和股骨骨髓腔3-5次，培养基含：低糖dmem，10%胎牛血清，100 u/ml青霉素，100 g/ml链霉素。 1.5 将收集的冲洗液经200目不锈钢细胞筛过滤后，调整细胞密度。将1.5 ml冲洗液按2x107/ml细胞密度移入95mm培养皿，在37，5% co2细胞培养箱中孵育。 1.6 3h首次换液，再每隔8h换液，持续72h。以后每隔3d换液，直至融合度至90%，0.25%胰酶25消化2 min传代，重复上述传代操作传代，依次标记为p1，p2，p3,等。 2. 小鼠关节软骨细胞的分离、培养小鼠关节软骨细胞的分离、培养 2.1 按上述小鼠骨髓mscs分离的方法游离出股骨和胫骨。 2.2 用手术刀片刮取股骨头和内外侧髁浅层关节软骨。 2.3 含双抗0.01m pbs(100 u/ml青霉素，100 g/ml链霉素)反复冲洗，0.25%胰酶消化1h。 2.4 含血清培养基(含10%胎牛血清的dmem-f12)中止后加0.02型胶原酶， 37培养箱中消化6h。 2.5 加入上述培养基后1500 rpm离心5min。 培养基重悬， 移入25cm2培养瓶， 37，5% co2细胞培养箱中孵育。每隔3d换液，直至融合度至90%，0.25%胰酶消化传代。 3. 流式细胞术鉴定小鼠流式细胞术鉴定小鼠mscs表面表面cd分子分子 3.1 p3代mscs经0.25%胰酶25消化2min，加入含10%胎牛血清的低糖dmem中止后900rpm离心5min。 3.2 用培养基重悬细胞，并调整细胞密度至5x105/ml。100 l细胞悬液分别加入pe/cy7-conjugated anti-cd34抗体(10l)，pe-conjugated anti-cd45抗体(6l)，第三军医大学博士学位论文15pe-conjugated anti-cd44抗体(6l)， pe-conjugated anti-cd90.2抗体(6l)及他们的同型对照抗体，4放置30min。再37条件下摇床上混匀孵育1h。 3.3 pbs洗涤2次，200l pbs重悬后流式细胞仪检测。 4. mtt法检测法检测mscs的增殖的增殖 4.1 分别取p1、p3、p5、p10小鼠骨髓mscs，按1x104/ml的细胞密度，200l/孔，加入96孔细胞培养板，细胞培养箱中静置24h。 4.2 观察细胞完全贴壁后替换为无血清低糖dmem培养24h后，恢复含10%胎牛血清的低糖dmem培养。 4.3 每隔24h取6孔细胞，分别加入mtt 20l，静置4h，弃去mtt，加入dmso 120l，温柔混合10min后上样。 4.4 选择酶联免疫检测仪上490nm波长检测吸光度，取6孔平均值，以时间为横坐标，平均吸光度为纵坐标绘制生长曲线。 5. mtt法检测原代关节软骨细胞的增殖法检测原代关节软骨细胞的增殖 取原代(p0)关节软骨细胞，经0.25%胰酶消化，按上述mscs增殖检测方法绘制小鼠关节软骨细胞生长曲线。 6. mscs诱导成软骨分化诱导成软骨分化 6.1 在超净台中，按无菌操作取p3 mscs，0.25%胰酶消化后细胞计数。 6.2 在15ml离心管中用不含tgf-3的不完全软骨诱导培养基重悬mscs。室温下900rpm离心5min，弃去培养基。 6.3 再次加入不完全软骨诱导培养基重悬mscs，同时调整细胞密度为7.5x105/ml，室温下900rpm离心5min，弃去培养基。 6.4 按5x105/ml的细胞密度加入含有tgf-3的完全软骨诱导培养基，重悬mscs。 6.5 将细胞悬液分装。每个15ml 聚丙烯离心管中加入0.5ml细胞悬液。室温下1100rpm离心5min。 6.6 小心将离心后的15ml离心管移入细胞培养箱中，将管盖拧松，静置24h。 6.7 每隔2-3d置换0.5ml含有tgf-3的完全软骨诱导培养基，操作中为尽量减少对管底部的细胞微团的影响，每次换液时可留取少量剩余培养基。换液完成后轻弹管壁，使细胞微团保持自由悬浮状态。 6.8 按不同时相点取细胞微团，进行后续实验。 7. mscs诱导成软骨细胞微团诱导成软骨细胞微团alcian blue染色：染色： 7.1 分别取诱导0d、7d、14d的细胞团，4%多聚甲醛固定20min，0.01m pbs洗涤3第三军医大学博士学位论文16次，每次5min。 7.2 按30%乙醇50%乙醇70%乙醇80%乙醇90%乙醇100%乙醇梯度脱水，置于二甲苯中(3min左右)至透明，常规石蜡包埋。切片厚度5um，常规脱蜡至水。 7.3 alcian blue (ph 2.5)染色30min，流水洗5min。酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。 8. mscs诱导成软骨细胞微团诱导成软骨细胞微团ii型胶原免疫组化染色：型胶原免疫组化染色： 8.1 制备防脱玻片：将洗净的玻片置于以1：50比例丙酮稀释的apes中30s，再侵入蒸馏水中浸泡，置于通风橱中晾干保存，待用。 8.2 免疫组化染色：分别取诱导0d、7d、14d的细胞团经上述方法行固定，脱水，石蜡包埋。未使用诱导培养基的mscs作为对照组。 8.3 石蜡切片脱蜡至水，放入装有0.01m 枸橼酸盐缓冲液(ph6.0)的烧杯中。将烧杯置于98水浴锅20min，自然冷却至室温，0.01m pbs浸泡，完成抗原修复。接着，按sabc-dab显色法检测ii型胶原表达。 8.4 滴入0.1%triton x -100，4透化20min，0.01m pbs洗涤3min x 3次。 8.5 3%h2o2覆盖玻片，室温下5min。 8.6 甩去玻片表面h2o2，山羊血清封闭30min。 8.7 弃去封闭液，加入兔抗小鼠ii型胶原一抗(1:150，抗体稀释液稀释)，4湿盒中孵育过夜。 8.8 0.01m pbs清洗3min x 3次。 8.9 加入生物素标记抗兔igg二抗(1:200，抗体稀释液稀释)室温孵育60min。 8.10 01m pbs清洗5min x 3次。 8.11 dab按说明书稀释至工作浓度，加入显色，镜下观察着色。 8.12 自来水冲洗，苏木精复染。 8.13 冲洗，脱水，透明，封片。 9. mscs诱导成骨分化诱导成骨分化 9.1 mscs经0.25%胰酶消化，培养基重悬，调整细胞密度，按3x103/cm2接种于6孔板。 9.2 静置24h，观察细胞贴壁后小心吸去培养基，贴培养板孔壁加入2 ml/孔成骨诱导培养基。 9.3 每隔3天完全换液。 9.4 3周后茜素红染色，观察mscs诱导成骨分化效应。 第三军医大学博士学位论文1710. 茜素红染色茜素红染色 10.1 培养皿用pbs冲洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，双蒸水冲洗3次。 10.2 0.1%茜素红-tris-hcl(ph 8.3)37，30min。 10.3 蒸馏水冲洗，干燥，封片。 11. mscs诱导成脂分化诱导成脂分化 11.1 mscs经0.25%胰酶消化， 培养基重悬， 调整细胞密度， 按2x104/cm2接种于6孔板。 11.2 每隔3填换液，直至细胞达到100%融合后再继续培养3-5d。 11.3 小心吸去培养基，贴培养板孔壁加入2ml/孔成脂诱导培养基a。 11.4 诱导3d后，小心吸取培养基，加入2ml/孔成脂诱导培养基b。 11.5 诱导24h后，替换回成脂诱导培养基a。 11.6 重复上述循环5次，保持使用成脂诱导培养基b培养细胞7d，每隔3d换液。 12. 油红油红o染色染色 12.1 弃去培养基，pbs洗涤1次，4%多聚甲醛固定30min。 12.2 pbs洗涤3次，每次3min。 12.3 加入油红o染色工作液，染色30min。 12.4 pbs洗涤3次，干燥，封片。 13. 小鼠关节软骨细胞的小鼠关节软骨细胞的alcian blue染色染色 13.1 取p1小鼠关节软骨细胞， 按1x105/ml的细胞密度加入预铺有1cm x 1cm玻片的24孔板中，每孔400l。 13.2 48h后加入4%多聚甲醛固定20min。 13.3 0.01m pbs洗涤2次，每次5min。alcian blue(ph 2.5)染色10min，流水洗5min。水性封片剂封片。倒置显微镜下观察染色结果。 结 果 1. mscs的细胞形态学观察 mscs经3d换液后，可以观察到小的纺锤形细胞贴壁生长，散在分布。同时有较多折光度高的死细胞(图1a)。培养4-7天，可以观察到细胞体积增大，呈现集落生长(图1b)，14天后，细胞形态均一，呈漩涡样排列，融合度增高(图1c)。p3 mscs经传代后5d左右， 融合度达到80%以上， 细胞形态较为均一， 部分细胞呈现宽大扁平的成熟mscs形态(图1d)。 第三军医大学博士学位论文18 图 1 直接贴壁法培养小鼠骨髓来源 mscs。a：p0 mscs 培养 3d 换液，纺锤形细胞散在分布。(x100) b：p0 mscs 培养 5d 换液，细胞成集落生长。(x200) c：p0 mscs 培养 14d，细胞融合度到 90%。 (x100) d： p3 mscs 培养 5d， 细胞形态较为均一， 可见宽大、 扁平成熟 mscs。 (x100) 2. 关节软骨细胞形态学观察 原代关节软骨细胞48h贴壁伸展，呈多角形(图2a)。10d左右细胞融合至90%，呈铺路石样排列(图2b)。 图 2 小鼠关节软骨细胞。a：p0 关节软骨细胞培养 72h 换液，细胞成多角形。(x100) b：p0 关节软骨细胞培养 8d 换液，细胞呈铺路石样排列。(x100) 第三军医大学博士学位论文193. 小鼠mscs生长曲线分析 p1、p3 mscs 0-2d增殖缓慢，至3d开始进入增殖活跃期，在7d左右进入平台期。p5 细胞生长曲线斜率较前几代降低，反映增殖能力下降。p10 细胞增殖能力显著降低。因此，我们后续涉及mscs的实验均选取p3细胞(图3)。 图 3 mtt 法测定小鼠 p1，p3，p5，p10 mscs 生长曲线 4. 关节软骨细胞生长曲线分析 0-6d原代软骨细胞增殖缓慢，7-10d增殖活跃，10d后进入平台期并呈下降趋势(图4)。 图4 mtt法测定小鼠原代关节软骨细胞生长曲线 第三军医大学博士学位论文205. 小鼠p3 mscs的cd分子表型鉴定 我们应用流式细胞检测技术对分离的mscs进行了cd分子表型分析，结果显示cd34、cd45(造血干细胞表面抗原标志)表达阴性，cd44、cd90.2表达阳性(图5)。 图5 流式细胞鉴定mscs表面cd分子(黑线为同型对照) cd34(-)、cd45(-)，cd44(+)，cd90.2(+) 6. mscs诱导成软骨分化细胞团大体观察 细胞团呈白色，1-2d内贴于离心管底(图6),3-5d左右与管壁脱离接触，换液时随液体波动可自由活动。 图 6 mscs 成软骨分化诱导微团培养：4%多聚甲醛固定液中， 由左至右分别是诱导 3d，7d，14d。微团体积无明显差异。 第三军医大学博士学位论文217. 微团培养条件下，mscs诱导成软骨分化alcian blue染色 诱导成软骨分化的mscs细胞团， alcian blue染色显示细胞基质中糖胺多糖(gags)染色呈阳性，且随着诱导时间增加，染色明显增强(图7)。提示分离获取的mscs具有成软骨分化潜能，能表达软骨细胞特征表型gags。 图 7 mscs 成软骨诱导不同时相点，alcian blue 染色。 a：诱导 1d，细胞团易碎，且 alcian blue 几乎没有染色。 b：诱导 3d，细胞团周边出现 alcian blue 浅染。 c：诱导 7d，alcian blue染色深度增加。 d：诱导 14d，细胞团更为