小麦胚中谷胱甘肽含量与几种元素间含量的相关性研究 毕业论文.doc

小麦胚中谷胱甘肽含量与几种元素间含量的相关性研究 摘要：测定19份不同来源小麦生、熟胚芽中总谷胱甘肽、还原型和氧化性谷胱甘肽以及ca、fe、zn、se元素的含量，研究了谷胱甘肽与4种元素间含量的相关性。结果表明，3种谷胱甘肽与4种元素含量间均存在一定差异，总谷胱甘肽与zn、gsh与se达显著相关。熟制加工后谷胱甘肽与se含量呈极显著正相关，较之生品有明显改善。谷胱甘肽与元素间含量的相关性由参与生化反应的多种物质决定，利用筛选高se品种从而获得高谷胱甘肽含量的小麦胚时，应考虑材料加工的影响。关键词：小麦胚；谷胱甘肽；元素；相关性studies on correlation between the content of glutathione and several elements in wheat germabstract: 19 samples of raw and cooked wheat germ from different sources were determined for the contents of total glutathione, reduced glutathione (gsh), oxidized glutathione (gssg), ca, fe, zn and se, with the correlation between the glutathione and the four elements content studied. the results showed that some variabilities existed in glutathione and 4 elements. besides, highly significantly correlation was showed between total glutathione and zn, as well as gsh and se. total glutathione was highly significantly positively correlation with se content in cooked samples, which improved noticeably. the correlation between the glutathione and the elements was determined by multiple substances that participated in biochemical reaction and the processing characteristic of samples should be considered when getting high glutathione content wheat germ by selecting varieties of high se content.key words: wheat germ; glutathione; elements; correlation1 文献综述1.1 小麦及小麦胚小麦提供了人类消费蛋白质总量的20.3%，热量的18.6%，食物总量的l1.1%，超过其他任何作物，也是我国第二大粮食作物1。人们主要利用的是小麦胚乳制成的面粉，而对于占小麦籽粒重量2.5% 3.0%的小麦胚，由于其富含的色素和不饱和脂肪酸不利于面粉的贮存和烘焙特性，往往将之作为制粉工业的副产品且利用较少。据统计，我国每年可供开发利用的小麦胚芽达300万吨，但被开发利用的却不足1万吨2。事实上小麦胚芽富含各种营养成分。其脂肪含量约占胚重的10，可提取胚芽油；维生素大致含有b族维生素和维生素e两大类；矿物质则含镁、磷、钾、钙、锌、铁、硒等。此外，小麦胚中还含有麦胚凝集素、谷胱甘肽和黄酮类化合物和谷胱甘肽过氧化酶等生理活性物质。其中，谷胱甘肽在小麦胚中的含量约为98107 mg/100g3。在消费者越来越看重食品营养价值的今天，小麦胚在食品加工工业中的应用也逐步受到人们的广泛关注。小麦胚可用来加工面包类、糕点类、饼干类、面条类等食品，也可作为天然食品添加剂使用2, 4。1.2 谷胱甘肽1.2.1 概述谷胱甘肽（glutathione）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键形成的三肽，是最重要的非蛋白巯基化合物之一，有还原型和氧化型两种形态。两分子还原型谷胱甘肽（gsh）的活泼巯基氧化缩合为二硫键，即得到氧化型谷胱甘肽（gssg），又称谷胱甘肽二硫化物。谷胱甘肽分布广泛，在谷物种子胚芽、某些蔬菜（西红柿、菠菜）、酵母、动物肝脏、红细胞和眼睛晶状体中含量较高5。谷胱甘肽在生物体内仅还原型谷胱甘肽具有生理活性，gsh的-谷氨酰基和活性巯基对维持生物体内适宜的氧化还原环境发挥着重要作用。gsh在动物体内能清除体内氧离子及其它自由基，同时具有保肝解毒、治疗帕金森病、肿瘤及心血管疾病等临床功效6-8；而在高等植物体内gsh对维持细胞膜完整性，清除体内自由基，参与氨基酸的吸收和转运，促进蛋白质合成及抵御植物的重金属等外界胁迫等方面有重要的功能意义9。1.2.2 谷胱甘肽与钙、铁、锌、硒生物体内的gsh既能与金属离子直接结合生成配合物以解毒，也可间接地保护生物体免受由金属氧化还原反应引起的氧化胁迫10。植物组织中，ca作为偶连胞外信号与胞内生理生化反应的第二信使，几乎参与所有细胞对环境刺激的响应11-12，如外源ca处理能显著提高植物中谷胱甘肽过氧化酶（gsh-px）活性，抑制外界胁迫条件下gsh的减少，同时增强谷胱甘肽还原酶（gr）活性 13-15，而细胞内的gssg能在gr的作用下还原成gsh。fe和zn是生物体内的必需微量元素，作为重金属元素，它们具有强烈的亲硫（s）元素的特性，而gsh分子结构中重要的官能团巯基( -sh )能与金属离子（m2+）结合形成无毒或低毒的配合物而排出体外，从而在高剂量重金属元素存在时起解毒作用，此时谷胱甘肽合成及利用的平衡取决于其抗氧化作用和植物螯合肽（pc）合成前体16。文献表明，在zn毒害可使水鳖gsh含量显著降低，施加外源gsh后毒性作用得到缓解17；高浓度zn处理番茄幼苗时，其茎和叶片中谷胱甘肽含量增加，进而螯合重金属离子18。硒是人体中具有重要生理功能的元素，具有抗癌、延缓衰老对重金属的解毒作用等。研究表明，硒（se）与谷胱甘肽也具有密切的关系。gsh除了通过与氧化物直接反应，还可以作为还原剂与谷胱甘肽过氧化酶（gsh-px）相互作用来达到维持细胞抗氧化功能的作用19。而硒是gsh-px酶系的重要组成成分，能催化gsh变为gssg，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进h2o2的分解，从而避免细胞膜受到氧化损害20-21。se-gsh系统在动物氧化防御体系中起协调作用，如富硒乳酸菌能显著提高肝纤维化大鼠组织匀浆中的gsh-px活性22。在植物方面的研究发现，一定浓度的亚硒酸钠作用能不同程度地提高大豆、菠菜及番茄等植物组织中gsh-px酶活性，同时影响gsh含量20, 23-29。1.2.3 在食品领域的应用谷胱甘肽广泛应用于食品领域，主要起还原和强化风味作用。作为一种抗氧化剂， gsh可防止水果罐头中色素沉着，抑制肉类食品的核酸分解，稳定酸奶和婴儿食品，以延长食品保鲜期。与此同时，gsh在与谷氨酸钠、核酸系的呈味物质或其混合物共存时还具有较好的肉类风味强化效果3。日本等发达国家在20世纪50年代起就开始将gsh作为生物活性添加剂开发应用于乳品及婴儿食品、海鲜等各类食品生产中。随着对谷胱甘肽研究的深入，谷胱甘肽在开发延缓衰老，增强免疫力等功能性食品方面将有更多的应用。1.3 元素与蛋白质的相关性研究研究发现，生物体内的元素与蛋白质之间具有密切的联系。如，小麦叶片中硝酸还原酶活性与氮元素、小儿厌食症中骨碱性磷酸酶活性与锌元素间的相关性等研究30-31均揭示了生物体内蛋白质（酶）等活性物质与元素之间的相关关系。动物组织中谷胱甘肽与硒的相关性研究32已见报道，而植物组织中谷胱甘肽与元素间的相关性分析还未有报道。1.4 立题依据当前，对于小麦胚的营养价值、功能特性及麦胚应用的文献较多，但未见关于小麦胚中谷胱甘肽含量与元素之间含量相关性研究的相关报道。本实验测定了19份不同来源的小麦生、熟胚芽中总谷胱甘肽、gsh、gssg及ca、fe、zn、se4种元素的含量，初步探讨了谷胱甘肽含量与ca、fe、zn、se元素含量的相关性，旨在为小麦胚中谷胱甘肽活性物质与元素间生化反应研究提供参考，同时为是否能通过元素含量的测定来筛选高谷胱甘肽含量的小麦胚提供一定科学依据。2 材料和方法2.1 仪器与试剂shimadzu高效液相色谱仪（spd-10a vp紫外-可见检测器、lc-6a高压泵、cto-10as vp柱温箱含7725i型手动进样器），浙大智达n2000工作站；北京海光公司afs-3000型双道原子荧光光谱仪；日立z2000原子吸收光谱仪；sartorius cp225d型电子天平；millipore milli-q型纯水仪；sartorius bp-20型ph计；江苏kq-100b超声波清洗机；thermo micromax型离心机；可调式电热板等。gsg和gssg对照品（sigma公司提供），纯度（99.00.5）%；ca、fe、zn及se元素标准储备液（国家标准物质中心提供）。乙腈、辛烷磺酸钠（上海蓝季科技发展有限公司提供）为色谱纯；硝酸、高氯酸、盐酸、氢氧化钾、硼氢化钾、氧化镧为优级纯；磷酸二氢钠、氯仿为分析纯。2.2 材料供试样品为19份不同来源的小麦生、熟胚芽，见表1。将麦胚粉碎过40目筛，烘干后保藏细粉于干燥环境中备用。2.3 方法采用高效液相色谱法（hplc）测定gsh和gssg含量，原子荧光法（afs）测定se的含量，原子吸收法（aas）测定fe、zn、ca元素的含量，每份样品均重复测定3次。采用spss17.0统计软件，分析不同形态谷胱甘肽与各元素间含量的相关性。2.3.1 谷胱甘肽的测定2.3.1.1 对照品制备精密称取gsh、gssg对照品，以超纯水定容，配制成三组不同浓度梯度的对照品混合溶液。gsh对照品混合液浓度分别为7.72gml-1、8.64gml-1和15.44gml-1；gssg对照品混合液浓度分别为17.28gml-1、30.88gml-1和34.56gml-1。表1 样品编号、来源及加工工艺tab.1 the numbers , sources and process technic of samples样品编号来源地加工工艺样品编号来源地加工工艺1河南郑州生11宁夏银川生2浙江嘉兴生12江苏徐州熟3吉林长春生13台湾统一生机牌熟4上海熟14山东烟台神恩牌生5河南偃师市生15广州安琪纽特牌 生6山东济宁生16广州伊贝莱牌熟7山东济宁济麦11生17台湾马玉山牌生8上海熟18四川温江云b58863-2/川育18 生*9山东烟台生19四川温江1401-dh区4/川育16/川育18 生*10山东烟台熟*表示全麦剥胚所得，自制2.3.1.2 样品制备采用浸提与超声提取的方式处理样品。精密称取小麦胚粉干样1 g于50 ml具塞三角瓶中，加入提取溶剂蒸馏水（ph=4.0）30ml并称定三角瓶和溶液的总质量后立即加盖避光静置提取1h，再于0超声（100w，40khz）提取10min，待提取液恢复室温，擦干瓶壁表面水分，再次称量补加提取溶剂至原总质量，取0.5ml于离心管、加入1ml氯仿沉淀，10000r/min离心15min，上清液作为供试品溶液。2.3.1.3 色谱条件色谱柱：synergi 4 fusion-rp 80 1504.6mm；进样量：10l；流速：1.0ml/min，流动相：水（0.08辛烷磺酸钠+0.24磷酸二氢钠）-乙腈（vv=828）以磷酸调ph=2.5，柱温：25 ，紫外检测波长：210nm，采样时间：25 min。精密量取样品溶液注入高效液相色谱仪，采用上述条件进行测定。2.3.2 ca、fe、zn、se的测定2.3.2.1 标准溶液配制fe和zn混合标准溶液配制：吸取fe和zn的混合标准储备液，用5%盐酸逐级稀释至混合标准使用液。吸取该混合标准使用液，用5%盐酸配制成含fe和zn的标准系列，0.0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 g/ ml。ca标准溶液配制：吸取ca标准储备液，用20g/l的氧化镧水溶液逐级稀释至混合标准使用液，用20g/l的氧化镧水溶液配成含ca的标准系列，0.0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0 g/ml。se标准溶液配制：吸取se标准储备液，用5%的盐酸稀释标准使用液。吸取se标准使用液，用5%盐酸配制成含se的标准系列，0.0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0 g/ l。2.3.2.2 消化ca、fe和zn的消化方法：精确称取小麦胚粉干样0.5g于50ml锥形瓶中，加混合酸（硝酸高氯酸=41）79 ml，盖上小三角漏斗，放置过夜，置于电热板上加热消化。消化时按需补酸，消化至溶液变为黄绿色或无色透明，加入5ml高纯水（ca加7ml）排酸。待锥形瓶中液体剩余2ml左右时，取下冷却。ca用20 g/l的氧化镧水溶液洗涤并转移至25ml容量瓶，定容；fe、zn用0.5%硝酸溶液洗涤并转移至25 ml容量瓶，定容。se的消化方法：精确称取干样1.0g于50 ml锥形瓶中，加混合酸（硝酸高氯酸=41）912 ml，盖上小三角漏斗，放置过夜，置于电热板上加热消化。消化时若酸过少可再加入消化至黄绿色或无色透明为止，加入50%的盐酸5ml，加热以还原se(se6+se4+)，待烧杯中液体还有2ml左右时，取下冷却。用0.5%盐酸洗涤并转移至25ml容量瓶，定容。以上消化每次均做随行空白。2.3.2.3 分析条件采用火焰原子吸收法测定ca、fe、zn，原子荧光法测定se，各元素分析条件分别见表2和表3。表2 ca、fe、zn分析条件tab.2 the conditions of analyzing ca , fe and zn元素波长（nm）狭缝宽度（nm）燃烧器高度（nm）ca422.7 1.3 7.5 fe248.3 0.2 7.5 zn213.9 1.3 7.5 表3 se分析条件tab.3 the conditions of analyzing se元素负压高（v）灯电流原子化器高度（mm）载气（mlmin-1）屏蔽气（mlmin-1）se340 100mv（主辅阴极各50mv）8 500 1000 3 结果与分析3.1 小麦胚中谷胱甘肽与4种元素的含量变异情况 测定发现19份不同来源地小麦胚中谷胱甘肽及ca、fe、zn、se元素的含量有较大差异，同时均存在不同程度的变异（表4）。其中，se的变异系数最大，达141.32%；其次，总谷胱甘肽、gsh和gssg三者的变异系数均在70%左右；ca、fe、zn元素变异系数相对较低，但均达20%以上。说明利用不同来源地小麦胚中不同含量的元素来筛选高含量谷胱甘肽小麦胚具有实际意义。表4 供试材料谷胱甘肽及4种元素变异情况tab.4 the variability in glutathione and 4 elements of tested materials成分 平均值 mg/100g变异幅度mg/100g变异系数%总谷胱甘肽72.926.58180.7167.65gsh35.603.83105.4675.67gssg41.386.5897.2170.90ca42.2321.3554.8521.64fe10.322.3613.6822.07zn13.101.8217.2534.10se0.02290.00090.1216141.323.2 谷胱甘肽与4种元素含量间相关性分析 样品小麦胚中谷胱甘肽与ca、fe、zn、se元素间含量的简单相关系数见表5。gsh与se含量的相关系数最高，为0.473；其次为总谷胱甘肽与zn含量的相关系数，达0.470，二者均达显著相关水平。但偏相关分析发现，谷胱甘肽与4种元素间含量的偏相关系数均不显著，说明其简单相关分析中显著的相关性由其他元素协同作用产生。此外，总谷胱甘肽与se、gssg与zn、总谷胱甘肽与fe的相关系数也较高，分别为0.453、0.435和0.399；gsh与ca之间相关性最差，且为负相关，相关系数为-0.035。由此可见，19份小麦胚样品中谷胱甘肽与四种元素含量间存在一定的相关性，其中与zn、se相关性较强，与ca之间相关性较差。表5 样品小麦胚中谷胱甘肽与4种元素间含量的相关性分析tab.5 correlation coefficients between the glutathione and 4 elements in tested wheat germcafeznse总谷胱甘肽0.1960.3990.470*0.453gsh-0.0350.1840.3220.473*gssg0.1850.3260.4350.282*表示相关性达到5%显著水平3.3 熟制加工对谷胱甘肽与4种元素间含量相关性的影响 熟制加工对小麦胚中谷胱甘肽与四种元素间含量的相关性影响各有不同（表6）。其中，熟制加工后谷胱甘肽与ca、se元素相关性增强，而与fe、zn元素相关性减小；gsh与生粉和熟粉小麦胚中ca的相关性分别为负相关和正相关；熟制加工对谷胱甘肽与zn的相关系数影响相对较小，但是对谷胱甘肽与ca、fe、se间相关系数影响较大，均至少为2倍数值变化，如gssg与ca的r值由0.085变为0.468，总谷胱甘肽与se和gsh与se相关性均由不显著变为1%显著水平，gssg与se变为5%显著水平。表6 生粉与熟制小麦胚中谷胱甘肽与4种元素间含量的相关性分析tab.6 correlation coefficients between the glutathione and 4 elements in raw and cooked wheat germcafeznse生粉熟粉生粉熟粉生粉熟粉生粉熟粉总谷胱甘肽0.1360.3680.5270.2200.561*0.3930.2250.980*gsh-0.1820.2000.3330.1540.3790.3130.5310.924*gssg0.0850.4680.4110.2450.5160.400-0.0700.855*表示相关性达到1%显著水平 *表示相关性达到5%显著水平3.4 生、熟小麦胚中谷胱甘肽与元素含量间的回归分析采用逐步回归法，进一步分别对生粉与熟制小麦胚中谷胱甘肽进行多元线性回归分析，得回归方程：生粉小麦胚中 y=5.208x3+10.612 （1） 熟制小麦胚中 y=1.162x1+1612.584x4-34.626 （2） ygsh=868.132x4+2.208 （3）式中y为总谷胱甘肽含量，ygsh为gsh含量，x1、x2、x3 、x4分别为ca、fe、zn和se元素含量，三个回归方程的调整判定系数分别为0.252、0.987和0.817。回归方程显著性检验发现，（1）式达5%显著水平，而（2）（3）式均达1%显著水平。逐步回归法f检验进一步表明，zn对生粉小麦胚中总谷胱甘肽产生显著影响，而熟制小麦胚中ca和se元素与总谷胱甘肽含量关系显著，se与gsh含量关系显著。此外由调整判定系数看出，熟制小麦胚中谷胱甘肽的线性回归方程，特别是总谷胱甘肽的回归方程对观察值的拟合程度更好，用于预测谷胱甘肽含量更加可靠。以上说明利用与元素间相关性测定小麦胚中谷胱甘肽含量时，需充分考虑样品的加工特性。4 结论与讨论 本研究测定小麦胚中谷胱甘肽与ca、fe、zn、se元素含量发现，19份不同来源地小麦胚中谷胱甘肽及ca、fe、zn、se元素的含量有较大差异及变异性，其中ca变异系数21.64，zn变异系数34.10，与鲁璐等人33研究不同地区及品种小麦籽粒中元素变异结果类似。另外，文献报道3 小麦胚芽中谷胱甘肽含量为98107mg/100g，而本实验中该变幅更大，为6.58180.71mg/100g，考虑该差异与小麦品种、生长环境及麦胚加工工艺有关。不同来源地小麦胚中谷胱甘肽与元素含量差异的存在为利用谷胱甘肽与元素的相关性筛选高含量谷胱甘肽品质的小麦胚材料提供了客观条件。 样品小麦胚中总谷胱甘肽与ca、fe、zn、se元素含量间相关系数大小依次为znse fe ca，gsh分别与4种元素含量间相关系数大小则依次为seznfe ca，且仅有总谷胱甘肽与zn、gsh与se达到显著相关水平。目前植物组织中谷胱甘肽含量与元素间含量的相关性研究还未有报道，仅有关于外源施加某元素化合物对植物中谷胱甘肽或与谷胱甘肽有关酶（如gr、gsh-px等）的含量的影响方面的研究，而本实验通过偏相关分析表明，其他元素协同作用共同产生了谷胱甘肽与zn、se的显著的相关性，又考虑到谷胱甘肽在高等植物体内具有维持细胞膜完整性、清除自由基及参与植物多种胁迫保护的作用，推测小麦胚中谷胱甘肽与元素含量间相关性还可能受到各种生化反应中各种酶等多种物质含量的影响。熟制加工后，小麦胚中谷胱甘肽与se相关性明显增强，由生粉中的相关不显著变为熟粉中总谷胱甘肽与se、gsh与se相关极显著，gssg与se相关显著，同时谷胱甘肽与ca的相关性亦有所增加。有文献34报道，对西兰花热处理产生的h2o2会诱导谷胱甘肽-抗坏血酸循环中酶的活性，而植物在应对环境胁迫时谷胱甘肽-抗坏血酸循环和谷胱甘肽两者关系密切35；另一方面，植物中se元素可以在高温应激过程中发挥加强抗氧化防御系统的保护作用36，外源ca预处理能减轻热胁迫引起的植物细胞膜破坏，并减少叶片中gsh的破坏14，故推测熟制加工使小麦胚中谷胱甘肽与se、ca间相关性增强可能与热处理条件下植物抗氧化胁迫系统整体的活性提高有关。本实验中，是否考虑加工的因素使小麦胚中谷胱甘肽与元素间相关性的测定结果有所差异，如不考虑加工因素时小麦胚中gsh与se呈显著相关，而生粉小麦胚中gsh与se相关不显著，提示在筛选高含量谷胱甘肽小麦胚时，需根据样品特性和待测定的谷胱甘肽指标及测定实际条件，合理利用加工工艺对小麦胚中谷胱甘肽与元素含量相关性的影响，选择适宜的测定方法，从而达到简化谷胱甘肽指标测定工序的目的。另外，本实验仅初步探讨了19种不同来源地小麦胚中谷胱甘肽与4种元素含量间相关性问题，加工工艺对其的影响也仅讨论了小麦胚是否熟制的方面，对更多来源地及品种小麦胚与更多元素间含量的相关关系以及小麦胚生长、储藏条件等因素的影响还有待进一步研究。参考文献：1 孙强, 李正军, 赵天勇, 等. 超级小麦及其应用前景j. 中国种业. 2004, (8): 14-152 胡春凤, 周显青, 张玉荣. 小麦胚理化特性及其稳定化技术研究进展j. 粮食加工. 2006, (3): 70-743 袁尔东, 郑建仙. 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