实时荧光定量pcr技术

简述实时荧光定量 PCR技术 1.实时荧光定量PCR技术的原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。该技术结合了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软 件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。实时PCR的设想是由Higuchi于 1992年最早提出 1。 荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理而实现的。当某个荧光基团的发射光 谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且2个基团距离足够近时，能量可以从短 波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团，相当于短波长荧 光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。 定量原理：实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量 与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。理想的扩增曲线 应为J型，符合2 N方程(其中N为PCR的循环次数)，但实际上扩增曲线为S型。在 PCR反应早期，不能将产生荧光的水平与背景明显区别，之后荧光的产生进入指 数期、线性期和最终的平台期，因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量， 并由此推断起始模板含量 2-3。 实时荧光定量PCR的标准扩增曲线如图1。其中Rn+表示每点测量的荧光强度， 代表反应管含有模板DNA；Rn-表示荧光基线强度，代表反应管不含有模板DNA， 其在理想情况下是一条平线，只具有背景荧光数值；Rn的值表示PCR过程中， 探针降解的量，也即PCR产物的量。基线(baseline)是背景曲线的一段，范围为 从反应开始不久荧光值开始变得稳定，到所有反应管的荧光都将要但是还未超 出背景。 图1 实时荧光定量PCR的标准扩增曲线 荧光阈值(threshold)是以PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信 号(baseline)，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号标准差的10倍， 即：Threshold=10SD(cycle 3-15)，一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信 号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。Ct值也称阈值循环 (threshold cycle)，指在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长 阶段的拐点所对应的循环次数，也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈 值时所经历的循环数。研究结果表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数 的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标 准样品可作出标准曲线，因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上 计算出该样品的起始拷贝数。 简单地说，实时荧光定量PCR的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长，在 反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，由 于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光，其荧 光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。 2.实时荧光定量PCR技术的类型及特点 实时荧光定量PCR技术的常用机制包括荧光染料检测和水解探针检测。 2.1 SYBR GreenI检测 SYBR GreenI是一种能结合到dsDNA小沟部位的具有绿色激发波长的染料， 它只有与dsDNA结合后才会发出荧光。在变性时，DNA双链分开，不产生荧光； 在复性和延伸时，形成dsDNA，SYBR GreenI发出荧光。荧光强度逐渐增强，直 到达到阈值，被荧光探测系统检测到 4。因此，荧光强度可以代表扩增产物的 数量。SYBR GreenI的优点在于：成本较低，不需合成和标记探针；适合初 步筛查：选用SYBR筛查，再用探针法精确定量少数关键样品。但其缺点有： 特异性差，不能分辨主带与杂带，给出的是总信号，所以在低样本浓度时，不 能进行基因突变分析。但该方法可利用熔点曲线分析将特异产物、引物二聚体 和非特异性产物区别开来，不需要通过电泳鉴定；不能做多重检测，每孔只 能检测1个目标基因；灵敏度低，适合于5000拷贝以上的基因定量。 2.2 TaqMan探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一 寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活 性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统 可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光 信号的累积与PCR产物形成完全同步。 图2 常规TaqMan探针检测原理 常规TaqMan探针的5端标记荧光发射基团FAM(6-羧基荧光素)，3端标记荧 光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)。该探针在PCR过程中不能被延伸。根 据FRET原理，当探针保持完整时，3端淬灭基团抑制5端发射基团的荧光发射。 在PCR的退火期，探针与模板发生特异性杂交，延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA 模板延伸，当到达探针处，Taq酶发挥5-3外切活性，继而发生置换。切断探 针后，FAM与TAMRA分离，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统就能检测到光 密度有所增加。模板每复制1次，就有1个探针被切断，并有1个荧光信号被释放。 由于理论上被释放的荧光基团数和PCR产物数是一对一的关系，且光密度同被释 放的荧光基团数也呈正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量 5。但 TaqMan也存在一定不足，主要表现在：由于采用荧光和淬灭基团双末端标记， 因此淬灭难以彻底，本底较高。报告基团的水解利用的是Taq酶的5-3外切 活性，因此定量时容易受酶活性影响。探针标记成本较高，不便普及应用。 另外还有TaqMan MGB(minor groove binder)探针、分子信标、双杂交探针、 复合探针等特异性检测技术，在此不一一介绍。 3.结语和展望 荧光定量PCR技术自建立以来，发展迅速、应用广泛，表明其具有强大的生 命力。由于具有定量、特异、灵敏和快速等特点，是目前检测目的核酸拷贝数 的可靠方法，已广泛应用于人类和动植物疾病的快速检测、基因型的鉴定、肿 瘤基因检测、转基因研究等方面，也为畜牧兽医领域的研究提供了重要的方法。 近些年来，许多科研工作者基于荧光PCR的基本原理对荧光PCR技术进行不断深 入的研究和改进，使荧光PCR技术得到了进一步的完善，并在此基础上开发出了 许多新的荧光定量PCR技术。随着科技的发展，功能更强大、操作更方便的实时 定量PCR仪不断推出，更特异、更灵敏的荧光标记材料的不断出现，数据分析软 件的不断改进更新，使得实时定量PCR技术的应用前景更加广泛，使之成为生物 定量分析的强有力手段。TaqMan和分子信标荧光探针是目前用于荧光定量PCR检 测的主流，但都存在各自的优缺点，其他荧光探针都是在此基础上为了克服它 们的不足而设计出来的，随着探针技术的发展，更特异更稳定的探针将会出现 6。 4.参考文献 1 Higuchi R，Fockler CKinetic PCR analysis real-time monitoring of DNA amplification reactions田Biotechnology，1993，11(9)：1026- 1030 2 黄留玉PCR最新技术原理、方法及应用M北京：化学工业出版社。 2005：131-139 3 韩俊英等.国外医学遗传学分册，2000,23(3):117-120 4 Yin J L，Shackel N A，Zekry A，et a1real-time reverse transcript-tase -polymerase chain reaction(RT-PCR)for measurement of cytokine and growth factor mRNA expression with fluorescent probes or SYBR Green IJImmunol Cell Biol，2001，79(3)：213 5 Livak K J，Flood S J，Marmaro J，et a1Oligo nueleotides with fluorescent dyes at opposite ends