c-反应蛋白在慢性乙型肝炎中的表达

C-反应蛋白在慢性乙型肝炎中的表达 2009-10-17 高艳琴 袁胜涛 胡锡琪 汪乃经 【摘要】 目的 了解慢性乙型肝炎时，C-反应蛋白(CRP)在肝细胞中的表达。方法 用本室建立的 LBA 法检测 40 例 HBsAg 阳性慢性肝炎的肝组织和 15 例 HBsAg 阴性的正常肝组 织的 CRP 原位表达；用免疫双标记染色检测肝细胞中 CRP、HBsAg 的表达。结果 40 例肝炎 标本 CRP 均呈阳性，表达位置和形态与 HBsAg 相似；免疫双标记染色显示肝细胞中 CRP 与 HBsAg 有重叠。此外，T 淋巴细胞也表达 CRP。结论 CRP 可与 HBsAg 形成复合物。CRP 可能 与慢性乙型肝炎的发病机制有关。 【关键词】 C-反应蛋白 肝炎，乙型 毛玻璃细胞 Expression of C-reactive protein in HBV chronic hepatitis Gao Yanqin, Yuan Shengtao, Hu Xiqi, et al.School of Basic Medical Sciences, Shanghai Medical University, Shanghai 200032 【Abstract】 Objective To detect the localization of CRP in liver tissue of HBV chronic hepatitis by the labelled biotin-avidin (LBA) technique. Methods The LBA was set up in our laboratory to detect the localization of CRP in liver tissue of 40 HBsAg positive chronic hepatitis patients and 15 HBsAg negative normal individuals, as well as immunodouble labelling technique was used to detect the expression of CRP and HBsAg in hepatocytes. Results CRP positive substance appeared in all 40 HBV hepatitis samples. CRP presented a similar distribution and morphological pattern as HBsAg did in hepatocytes. The expression of CRP and HBsAg in hepatocytes was eclipsed by immunodouble labelling technique. The expression of CRP could be detected also in lymphocytes. Conclusion CRP-HBsAg compound can be formed in hepatocytes. CRP maybe play a role in the pathogenic mechanism of HBV chronic hepatitis. 【Key words】 C-reactive protein Hepatitis B Ground glass cell C-反应蛋白(C-Reactive Protein，CRP)是一种主要由肝脏合成的蛋白质。正常人血液 中的含量甚微，当机体处于炎症急性发作阶段，血液中 CRP 水平急剧升高，当炎症缓解时， CRP 水平也迅速下降，恢复至正常水平。本研究应用本室建立的 CRP 生物素-亲和素免疫酶 标法(LBA)1 ，检测慢性乙型肝炎时 CRP 在肝细胞中的定位表达，并探讨 CRP 在慢性肝炎 发病机制中的作用。 材料与方法 一、标本来源 选取上海医科大学中山医院 1994 年手术切除肝细胞癌标本，其中 HBsAg 阳性 40 例，男 性 34 例，女性 6 例，男女比例为 5.71。平均年龄为 51.611.9 岁；15 例肝血管瘤中男 6 例，女 9 例，男女比例为 11.5，平均年龄为 46.910.3 岁。癌旁肝组织取材距离肿瘤 1cm，癌旁肝组织慢性肝炎按 1994 年英国肝脏病理学家 Scheuer 新分类2 ，40 例癌旁 肝组织中 7 例为 G1，10 例为 G2，12 例为 G3，11 例为 G4。另选手术切除血管瘤的瘤旁肝组 织 15 例作为正常肝组织对照组，即为 G0。全部标本按常规福尔马林固定，石蜡包埋连续切 片。 二、试剂 兔抗人 CRP 的制备，CRP 抗体的生物素标记(B-Ab)，亲和素辣根过氧化物酶偶联物(A- HRP)的制备参照本室建立的方法1 ，工作浓度分别为 11 000、1100。抗人 HBsAg、兔 抗羊 IgG、羊 PAP(均由华美公司提供)的工作浓度分别为：11 500、1200、1200。LCK，L26，UCHL1(均由 DAKO 公司提供)的工作浓度均为 1100。ABC 试剂盒(由 VECTOR 公司提供)按说明使用。 三、免疫组化检测 (一) CRP、HBsAg、淋巴细胞标记 CRP 染色用 LBA 法，HBsAg 染色用 PAP 法，淋巴细胞 标记 LCA、L26、UCHL1 染色采用 ABC 法。 (二) CRP、HBsAg 免疫双重染色 先用 LBA 法定位 CRP，DAB 染色；然后用 PAP 法定位 HBsAg,4-氯-1-萘酚显色。 (三) 免疫组化显色 根据强度、范围分以下几级：1(阴性)；2(弱阳性)；3(阳性)； 4(强阳性)。 结 果 一、HBsAg 染色结果 40 例血清 HBsAg 阳性的肝细胞癌之癌旁肝组织 HBsAg 染色均呈阳性结果。HBsAg 阳性信 号位于肝细胞胞质内，呈包涵体型、全浆型和膜型簇状或散在分布(附图)。肝癌细胞 HBsAg 阳性率为 57.5%(23/40)。15 例血管瘤旁肝组织 HBsAg 呈阴性结果。 附图 HBsAg 免疫酶染色显示肝硬化结节中部分肝细胞阳性，呈包涵体型 1040。右下角为 连续切片 CRP 染色显色与 HBsAg 阳性位置、形态相对应 4040。 二、CRP 染色结果 CRP 阳性信号也位于胞质内，其形态和分布与 HBsAg 相似，呈包涵体型、全浆型和膜型 (图右下角)。肝细胞 CRP 阳性程度与慢性肝炎炎症程度(G 分级)有关(见附表)。肝癌细胞也 表达 CRP，阳性率为 42.5%(17/40)。肝细胞碎片状坏死区和血窦旁部分淋巴细胞 CRP 阳性， 淋巴细胞标记免疫组化染色显示 CRP 阳性的淋巴细胞主要为 T 淋巴细胞。胆管上皮细胞不表 达 CRP。15 例血管瘤旁肝组织 CRP 呈阴性结果。 三、CRP 和 HBsAg 免疫双重染色结果 部分肝细胞胞质的染色既不呈棕黄色，也不呈蓝色，而是这两种颜色的调和色棕褐色， 尤其是 HE 切片所见的毛玻璃肝细胞，双重染色呈棕褐色 附表 慢性乙型肝炎 CRP 表达 炎症程度 G 分 级 例数 免疫组化染色分级 1 2 3 4 平均 G0 15 14 1 1.07 G1 7 1 5 1 2.00* G2 10 1 9 2.90* G3 12 8 4 3.33* G4 11 4 7 3.64* 与 G0 比较：* P0.05，*P0.01 包涵体型；一些肝细胞的部分胞质呈 CRP 阳性的棕黄色；另外部分呈 HBsAg 阳性的蓝色；也 可见胞质呈棕黄色或蓝色，而胞膜呈棕褐色；还可见少数肝细胞呈 CRP 棕黄色或 HBsAg 蓝色 单独阳性。 讨 论 CRP 分子是由非共价连接的五个相同的亚基组成，电镜下呈环状对称的五聚体，每个亚 基由 187 个氨基酸残基组成，亚基不带糖链，亚基内有 2 个半胱氨酸以二硫键连接，无自由 巯基存在3 。CRP 与 IgG 一级结构的氨基酸排列顺序有一定程度的相似之处，其是一种血 浆蛋白，正常时含量甚微。当机体处于外伤、感染、移植排异等急性炎症反应时，CRP 的水 平急骤上升，并随组织损伤程度加剧而增加，当急性炎症反应缓解时，CRP 的水平也迅速下 降4 。自 1978 年 Kushner5首次报道应用免疫组化法定位检测实验性急性炎症的家兔 肝脏 CRP，表明 CRP 由肝脏合成及分泌以来，尚未见人体肝脏资料。我们应用免疫组化 LBA 法显示 CRP 在正常肝组织中基本不表达(15 例中仅 1 例呈弱阳性)，而在慢性乙型肝炎的肝 细胞中有表达。随着慢性肝炎炎症程度加重，肝细胞中 CRP 表达强度增强。人体肝细胞中 CRP 表达的形态除胞浆型和胞膜型与实验动物家兔一样外，尚可见包涵体型，其与 HBsAg 在 肝细胞内表达的形态和位置极其相似，且阳性切片的连续切片 HE 染色显示与 CRP 相对应的 肝细胞为典型的毛玻璃肝细胞。应用 LBA 法 DAB 显示 CRP(棕黄色)和 PAP 法 4-氯-1-萘酚显 示 HBsAg(蓝色)的免疫双重染色，结果肝细胞胞质中的包涵体既不呈棕黄色，也不呈蓝色， 而