高效液相色谱hlpc

高效液相色谱 （ high performance liquid chromatography,HPLC ）中南大学湘雅医学院医学检验系 徐克前一 基本原理（一）定义 HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同，进行连续的、无数次的交换和分配而达到分离的过程。组成： 固定相 柱内填料流动相 洗脱剂（二）固定相 （ stationary phase)和 流动相（ mobile phase ）(1)化学键合相硅胶化学官能团键合到硅胶表面OH OH | |硅胶（ SiO2 nH2O） Si O Si | |键合相反应R1| | | | Si OH + XSiR Si OSiR + HX| | | |R2硅胶 有机硅烷 键合相X: Cl、 CH3O、 C2H5O等R: 烷 C8(C8H17) 、 C10(C10H21) 、 C18(C18H37)等R1 R2: Z、 CH3等(2)十八烷基硅烷键合硅胶填充料（octadecylsilyl, ODS） 万能柱即 C18柱或 ODS柱 主要用于反相 HPLC中，适用于各种类型的生物分子(3) 短链烷基键合物短链烷基（ c3、 c4等） 大孔硅胶 键合物适用于氨基酸、小肽等生物小分子(4)键合到基质上的官能团性质 反相柱： 填料是非极性的，官能团为烷烃， 如 C18 、 C8 、 C4等 正相柱： 填料是极性的，官能团为 CN、NH2等 离子交换键合相： 阳离子官能团 ： SO3H、 COOH等等阴离子官能团阴离子官能团 NH2、 R4N+等等2、流动相（ mobile phase）流动相选择原则： 1.样品易污，且溶解度尽可能大2.化学性质稳定，不损坏柱3.不妨碍检测器检测分析4.粘度低，流动性好5.易于从中回收样品6.无毒或低毒，易于操作7.易于制成高纯度，即色谱纯8.废液易处理，不污染环境反相色谱常用流动相及冲洗强度反相色谱常用流动相及冲洗强度H2O甲醇甲醇 乙腈乙腈 乙醇乙醇 丙醇丙醇 异丙醇异丙醇 四氢呋喃四氢呋喃最常用组成：甲醇最常用组成：甲醇 /H2O、 乙腈乙腈 /H2O洗脱顺序：极性物先洗脱下来洗脱顺序：极性物先洗脱下来正相色谱常用流动相及冲洗强度正相色谱常用流动相及冲洗强度正乙烷正乙烷 乙醚乙醚 乙酸乙酯乙酸乙酯 异丙醇异丙醇二、分离模式正相 HPLC反相 HPLC离子交换 HPLC凝胶 HPLC亲和 HPLC（一）正相 HPLC（ normal phase HPLC ,NP- HPLC ） 固定相 ：极性吸附剂（或极性键合 相），如硅胶、 Al3O2 流动相： 非极性或弱极性溶剂，如己烷、庚烷等 洗脱顺序： 非极性、弱极性、极性 应用： 石油化工产品、染料、农药、医药、有机酸、有机碱等（二）反相 HPLC（ reverse phase HPLC ,RP- HPLC ） 固定相 ：非极性物质，如 C18(ODS)、 C10、 C8 、 C6 、 C4 、 C2 流动相： 极性溶剂，如 甲醇 /H2O、 乙腈 /H2O等 洗脱顺序： 极性、弱极性、非极性 应用： 蛋白质、多肽等（三）离子交换 HPLC（ ion-exchange HPLC ,IE- HPLC ） 原理： 用离子交换剂作固定相，根据不同组分在一定 pH下，组分电荷性质和数量不同而分离的技术 分类： 阳离子交换树脂： 含酸性基团： 阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：磺酸基、磷酸基等磺酸基、磷酸基等合碱性基团：合碱性基团：季胺基、叔胺基等季胺基、叔胺基等应用：应用： 核酸、蛋白质、氨基酸等核酸、蛋白质、氨基酸等（四）凝胶 HPLC（ gel HPLC ,G- HPLC ） 原理： 基于分子大小和形状的差异进行分析的技术 固定相： 交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶 流动相： 水、乙醇、丙酮等 应用： 核酸、蛋白质、酶、多糖等（五）亲和 HPLC（ affinity HPLC ,AF- HPLC ） 原理： 利用生物大分子间专一的亲和力 进行分离的技术 固定相： 基质（琼脂糖凝胶等）交联配 基（亲和性） 应用： 酶、抗体、抗原、受体等三、 HPLC仪器HPLC仪 一般由 输液系统、进样系统、色谱柱、检测器、记录和数据处理系统及计算机 等几